掺锶介孔生物活性玻璃负载双膦酸盐改善去卵巢小鼠骨流失

doi:10.12307/2024.482

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (17): 2653-2658.doi: 10.12307/2024.482

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

掺锶介孔生物活性玻璃负载双膦酸盐改善去卵巢小鼠骨流失

周志1，陈致介1，霍市城2，李展春1

1上海交通大学医学院附属仁济医院骨科，上海市 200127；2中国人民解放军海军军医大学附属长征医院脊柱微创科，上海市 200003

收稿日期:2023-07-25 接受日期:2023-09-22 出版日期:2024-06-18 发布日期:2023-12-14
通讯作者: 李展春，博士，教授，主任医师，博士生导师，上海交通大学医学院附属仁济医院骨科，上海市 200127 霍市城，在读博士，中国人民解放军海军军医大学附属长征医院脊柱微创科，上海市 200003
作者简介:周志，男，1996年生，江西省抚州市人，汉族，上海交通大学医学院附属仁济医院在读硕士，主要从事骨质疏松研究。
基金资助:
上海市科委计划项目(21140904600)，项目负责人：李展春

Strontium-containing mesoporous bioactive glass nanoparticles loaded with bisphosphonates ameliorate bone loss in ovariectomized mice

Zhou Zhi1, Chen Zhijie1, Huo Shicheng2, Li Zhanchun1

1Department of Orthopedics, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China; 2Department of Minimally Invasive Spine, Changzheng Hospital, Chinese People’s Liberation Army Navy Military Medical University, Shanghai 200003, China

Received:2023-07-25 Accepted:2023-09-22 Online:2024-06-18 Published:2023-12-14
Contact: Li Zhanchun, PhD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China Huo Shicheng, Doctoral candidate, Department of Minimally Invasive Spine, Changzheng Hospital, Chinese People’s Liberation Army Navy Military Medical University, Shanghai 200003, China
About author:Zhou Zhi, Master candidate, Department of Orthopedics, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China
Supported by:
Shanghai Science and Technology Commission Plan Project, No. 21140904600 (to LZC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

掺锶介孔生物活性玻璃：在使用溶胶-凝胶法合成介孔生物活性玻璃的过程中加入硝酸锶，使得锶离子能部分取代钙离子掺入生物活性玻璃并稳定存在。掺锶介孔生物活性玻璃具有良好的组织相容性和离子缓释性，在体液模拟液中能完全分解并不断释放锶离子，因此具有良好的促进成骨抗骨质疏松活性。
骨质疏松：是一种以骨脆性增加和骨折易感性增强为特征的全身性代谢性骨骼疾病，主要危害是容易发生脆性骨折，是老年人致残、致死的重要原因。

背景：双膦酸盐通过抑制破骨细胞活性延缓骨质疏松进展，然而双膦酸盐严重的并发症如下颌骨坏死、非典型性股骨骨折等严重限制了其临床应用，需要寻求有效的替代疗法改善现有的临床困局。

目的：制备掺锶介孔生物活性玻璃负载双膦酸盐(BPS@Sr-MBG)，分析其抗骨质疏松活性。
方法：采用溶胶-凝胶法制备掺锶介孔生物活性玻璃，然后加入阿仑膦酸盐饱和溶液中制备BPS@Sr-MBG。①细胞实验：将小鼠骨髓巨噬细胞接种于96孔板内，加入含巨噬细胞集落刺激因子、核因子κB受体活化子配体的ɑ-MEM完全培养基进行破骨细胞诱导分化实验，同时分3组培养，空白组加入PBS，对照组加入双膦酸盐，实验组加入BPS@Sr-MBG。培养5 d后，F-肌动蛋白环染色观察破骨细胞分化情况。②动物实验：将24只雌性C57/BL小鼠随机分为4组，每组6只。除假手术组外，切除去卵巢组、BPS组、BPS@Sr-MBG组小鼠双侧卵巢构建骨质疏松模型，造模1周后，BPS组、BPS@Sr-MBG组小鼠分别腹腔注射双膦酸盐溶液、BPS@Sr-MBG溶液，假手术组、去卵巢组小鼠腹腔注射PBS，1次/周。连续注射8周后，取小鼠股骨进行Micro-CT扫描及苏木精-伊红染色分析。

结果与结论：①细胞实验：F-肌动蛋白环染色显示，与空白组比较，对照组破骨细胞面积占比与破骨细胞数量均减少(P < 0.01)；与对照组比较，实验组破骨细胞面积占比与破骨细胞数量均减少(P < 0.01)。②动物实验：股骨Micro-CT扫描结果显示，与假手术组比较，去卵巢组小鼠骨密度、骨小梁骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均降低(P < 0.05，P < 0.01)，骨小梁间距、结构模型指数升高(P < 0.01)；与去卵巢组比较，BPS组、BPS@Sr-MBG组小鼠上述骨参数均得到明显改善(P < 0.01)，其中以BPS@Sr-MBG组各指标改善更明显。股骨苏木精-伊红染色进一步证实了Micro-CT扫描结果。③结果表明：BPS@Sr-MBG可通过抗破骨效应与促骨形成发挥抗骨质疏松活性。

https://orcid.org/0009-0002-1498-7259(周志)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 骨质疏松, 生物活性玻璃, 锶离子, 双膦酸盐, 骨流失, 骨髓巨噬细胞

Abstract: BACKGROUND: Inhibition of osteoclast activity by bisphosphonates slows the progression of osteoporosis. However, serious complications of bisphosphonates, such as osteonecrosis of the jaw and atypical femur fracture, limit the clinical application of bisphosphonates. Effective alternative therapies need to be sought to improve existing clinical dilemmas.
OBJECTIVE: To prepare strontium-containing mesoporous bioactive glass nanoparticles loaded with bisphosphonates (BPS@Sr-MBG) and analyze its activity against bone loss.
METHODS: Strontium-containing mesoporous bioactive glass nanoparticles (Sr-MBG) were prepared by sol-gel method and added to alendronate saturated solution for the preparation of BPS@Sr-MBG. (1) Cell experiment: Mouse bone marrow macrophages were inoculated in 96-well plates and supplemented with ɑ-MEM complete culture medium containing macrophage colony stimulating factor and activator-ligand of nuclear factor κB receptor for osteoclast induced differentiation experiment. Meanwhile, they were cultured in three groups. The blank group was added with PBS. The control group was added with bisphosphonate, and the experimental group was added with BPS@Sr-MBG. After 5 days of culture, the differentiation of osteoclasts was observed by F-actin ring staining. (2) Animal experiments: Twenty-four female C57/BL mice were randomly divided into four groups with six mice in each group. Except sham operation group, ovariectomy group, BPS group and BPS@Sr-MBG group were used to construct osteoporosis model. One week after model establishment, mice in BPS group and BPS@Sr-MBG group were intraperitoneally injected with bisphosphonate solution and BPS@Sr-MBG solution, respectively. Mice in the sham operation group and ovariectomy group were intraperitoneally injected with PBS once a week. After 8 weeks of continuous injection, mouse femurs were taken for Micro-CT scanning and hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cell experiment: F-actin ring-formation staining demonstrated that compared with blank group, the area proportion and number of osteoclasts in the control group were decreased (P < 0.01). Compared with the control group, the area proportion of osteoclasts and the number of osteoclasts in the experimental group were decreased (P < 0.01). (2) Animal experiments: Micro-CT scanning results of femur showed that compared with the sham operation group, bone density, trabecular bone volume fraction, trabecular thickness and trabecular number of mice in the ovariectomy group were decreased (P < 0.05, P < 0.01), while trabecular distance and structural model index were increased (P < 0.01). Compared with the ovariectomy group, the above bone parameters in the BPS group and BPS@Sr-MBG group were significantly improved (P < 0.01), and the improvement in the BPS@Sr-MBG group was more obvious. The Micro-CT scanning results were further confirmed by hematoxylin-eosin staining of the femur. (3) The results show that BPS@Sr-MBG can exert anti-osteoporosis activity through anti-osteoclastic effect and promoting bone formation.

Key words: osteoporosis, bioactive glass, strontium ion, bisphosphonate, bone loss, bone marrow macrophage

中图分类号:

周志, 陈致介, 霍市城, 李展春. 掺锶介孔生物活性玻璃负载双膦酸盐改善去卵巢小鼠骨流失[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(17): 2653-2658.

Zhou Zhi, Chen Zhijie, Huo Shicheng, Li Zhanchun. Strontium-containing mesoporous bioactive glass nanoparticles loaded with bisphosphonates ameliorate bone loss in ovariectomized mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(17): 2653-2658.

图/表（结果） 6

2.1 Sr-MBG表征结果通过场发射扫描电子显微镜和透射电镜分析研究了Sr-MBG的形貌，具有球形结构形态和介孔结构，见图1A、B。场发射扫描电子显微镜下可见Sr-MBG具有良好的分散性和均一性，粒径大小基本分布在120-140 nm之间，平均粒径大小约为134.90 nm，见图1C。使用X射线电子能谱对Sr-MBG的成分进行定性分析，其内存在微量Sr元素，见图1D-F。
图1G为Sr-MBG的氮气吸附-脱附曲线，属于Ⅳ型等温线，并且具有H3滞回线，说明Sr-MBG具有介孔结构，这与场发射扫描电子显微镜观察结果一致。图1H显示Sr-MBG介孔孔径大部分在2-7 nm之间。图1I为Sr-MBG的X射线衍射图，显示Sr-MBG的无定形性质(宽峰在2θ=20°-32°)。图1G-I说明Sr-MBG具有良好的比表面积和非晶结构，为负载BPS提供了良好的物质结构基础。

2.2 BPS@Sr-MBG的细胞毒性和药物释放 CCK-8检测结果显示，100 mg/mL及以下质量浓度的BPS@Sr-MBG对骨髓巨噬细胞无明显的毒性作用，见图2A-C，说明在0-100 mg/mL质量浓度范围以内BPS@Sr-MBG是安全的。图2D为BPS@Sr-MBG的药物释放曲线，在前24 h内双膦酸盐存在爆发性释放，此后不断地缓慢释放双膦酸盐，表明BPS@Sr-MBG具有良好的缓释效果。

2.3 BPS@Sr-MBG抗破骨效果成熟破骨细胞的形态是多核巨细胞形态，所以可以利用破骨细胞这一特征验证双膦酸盐和BPS@Sr-MBG能否有效地抑制核因子κB受体活化子配体诱导的破骨细胞生成与分化。图3为各组小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的情况，与空白组比较，对照组破骨细胞面积占比与破骨细胞数量均减少(P < 0.01)；与对照组比较，实验组破骨细胞面积占比与破骨细胞数量均减少(P < 0.01)。结果表明相比于空白组，对照组和实验组破骨细胞分化均受到明显阻碍；相比于对照组，BPS@Sr-MBG对破骨细胞分化具有更强的抑制效果。

2.4 BPS@Sr-MBG有效抵抗骨质疏松导致的骨流失各组小鼠股骨Micro-CT扫描结果，见图4。与假手术组比较，去卵巢组小鼠骨密度、骨小梁骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均降低(P < 0.05，P < 0.01)，骨小梁间距、结构模型指数升高(P < 0.01)，说明骨质疏松动物模型构建成功；与去卵巢组比较，双膦酸盐组、BPS@Sr-MBG组小鼠骨密度、骨小梁骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均升高(P < 0.01)，骨小梁间距、结构模型指数降低(P < 0.01)；与双膦酸盐组比较，BPS@Sr-MBG组小鼠骨密度、骨小梁骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均升高(P < 0.01)，骨小梁间距、结构模型指数降低(P < 0.01)，见表1。

苏木精-伊红染色进一步证实了Micro-CT扫描结果，见图5。以上结果表明，BPS@Sr-MBG能有效抵抗骨质疏松导致的骨流失。

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引言

骨质疏松症是一种累及全身骨骼的代谢性骨骼疾病，导致全身骨骼质量悬崖式下降，这种骨骼在轻微应力作用下就可能发生病理性骨折，严重危害中老年患者的身心健康[1]。绝经后骨质疏松症自从妇女绝经后就可能开始隐匿起病，是最常见的骨质疏松症[2-3]。骨质疏松及相关并发症已经成为严重的公共卫生问题，对国家医疗开支造成了重大经济压力。
正常个体内骨组织的骨吸收和骨重塑处于微妙的平衡状态，既能通过破骨细胞的吞噬功能及时清理受损骨组织，又能通过成骨细胞的矿化能力产生新鲜骨组织，维持骨稳态[4-5]。破骨细胞起源于血细胞中单核/巨噬细胞系统，是一种黏附于骨骼表面的多核巨细胞。多种细胞因子包括巨噬细胞集落刺激因子、核因子κB受体活化因子配体、白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α参与趋化和激活破骨细胞。当核因子κB受体活化因子配体与其细胞表面受体结合发生相互作用，肿瘤坏死因子受体相关因子6等分子就会被募集，从而激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联、核因子κB、蛋白激酶B(AKT/PKB)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)下游信号传导途径参与破骨细胞生成的基因表达[6-7]。破骨细胞激活后会在局部形成骨吸收区域，区域内不断分泌蛋白水解酶和酸性离子介导骨吸收反应；当骨吸收进行到一定程度后，成骨细胞分泌相关细胞因子如骨保护素抑制破骨细胞功能并诱导其凋亡，从而拮抗骨吸收。在这一过程中，机体内部通过内分泌、旁分泌和自分泌多种途径表达Runx2、Osterix蛋白、骨碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白激活经典WNT途径，促进成骨分化和骨矿化进行骨修复[4，8]。雌激素对成骨具有保护作用，对破骨具有抑制作用。绝经后雌激素缺乏会刺激破骨活性，导致高强度的骨转换，受刺激的破骨细胞不仅清理了衰老损伤的骨组织，也损害了正常的骨微结构，导致骨小梁连通性的丧失和皮质骨的孔洞超越了成骨细胞矿化能力的极限，引发严重的骨流失[9-11]。
双膦酸盐作为一种骨吸收抑制剂在临床上被广泛用于抗骨质疏松治疗[2]。长期使用双膦酸盐可能导致罕见而又严重的并发症，包括下颌骨坏死和非典型性股骨骨折等[12-16]。此外，双膦酸盐能提高骨密度，但是过度抑制骨转换可能导致骨微损伤不能有效清理，从而引发骨折[17-18]。
由于生物活性玻璃与骨组织具有良好的相容性而备受青睐，自从20世纪70年代HENCH教授制备出具有划时代意义的生物玻璃后，其作为一种医用植入材料得到广泛研究[19-20]。生物玻璃一般由硅、钙、钠、磷4种氧化物构成，植入体内后能与周围骨组织良好地结合并促进骨组织的生长；随着时间的推移，它在生理液中可再吸收，其降解产物通过促进成骨相关基因的表达来刺激成骨，因此不断被开发并应用于骨组织的修复[21]。通过在二氧化硅网络中引入铜(Cu)、镁(Mg)、锌(Zn)、锶(Sr)等治疗性金属阳离子开发了新的剂型，扩大了生物玻璃在血管生成、伤口愈合、抗菌和抗癌等方面的潜在应用[19，22-24]。锶与钙(Ca)具有相似的物理和化学性质，锶具有抑制骨吸收和促进骨重塑的双重能力，当钙作为骨矿化主要成分时，锶可以替代部分钙激活细胞表面的钙敏受体，发挥其抗骨质疏松活性[25]。
掺锶介孔生物活性玻璃(Sr-doped mesoporous bioactive glasses，Sr-MBG)是一种有前景的注射型载药材料[26]，由于掺入了锶元素其本身具有抗骨质疏松活性[27]。此次实验将Sr-MBG负载双膦酸盐(BPS@Sr-MBG)作为一种新型药剂作用于骨质疏松小鼠，观察其抗骨质疏松活性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，随机对照动物实验，组间比较进行单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年9月至2023年6月在上海交通大学医学院附属仁济医院科研楼完成。
1.3 材料
1.3.1 主要原料与试剂十六烷基三甲基溴化铵、三乙醇胺、正硅酸四乙酯、环己烷、Ca(NO3)2·6H2O、Sr(NO3)2·6H2O、磷酸三乙酯、阿仑膦酸盐(阿拉丁，中国)；巨噬细胞集落刺激因子(R&D System，美国)；胎牛血清(Hyclone，美国)；青霉素/链霉素、ɑ-MEM培养基(TED，中国)；核因子κB受体活化因子配体(R&D System，美国)。
1.3.2 实验动物 2只4周龄雌性C57BL/6小鼠，SPF级，体质量(13.9±0.2) g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可编号：20180004063868，用于骨髓巨噬细胞的提取。24只12周龄雌性C57BL/6小鼠，SPF级，体质量(20.2±0.1) g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可编号：20180004063868，用于BPS@Sr-MBG抗骨质疏松动物实验。实验方案已获得上海交通大学医学院附属仁济医院动物伦理委员会批准，实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.3 主要仪器场发射扫描电子显微镜(ZEISS GeminiSEM 300，德国)；透射电子显微镜(FEI Talos F200X G2，美国)；全自动快速比表面积与空隙度分析仪(Micromeritics ASAP 2460，美国)；X射线衍射仪(Rigaku UltimaⅣ，日本)；X射光电子能谱仪(Thermo Scientific K-Alpha，美国)；微型CT扫描仪(SkyScan-1176，比利时)；荧光显微镜(OlympusCorporation，DP70，日本东京)。
1.4 方法
1.4.1 Sr-MBG的制备利用溶胶-凝胶法制备Sr-MBG[28]。将3.6 g十六烷基三甲基溴化铵、200 mg三乙醇胺和36 mL超纯水置于100 mL三口烧瓶中，磁力搅拌至澄清，在一定温度下缓慢加入正硅酸四乙酯和环己烷的混合溶液(正硅酸四乙酯与环己烷的体积比为1∶19)，在搅拌8 h时加入0.632 5 g Ca(NO3)2·6H2O，搅拌1 h时加入0.145 6 g Sr(NO3)2·6H2O，搅拌9 h时加入0.051 mL磷酸三乙酯，继续反应12 h形成溶胶。将溶胶用乙醇、超纯水分别交替洗涤离心至上清液澄清，60 ℃下热烘72 h，得到白色固体，在600 ℃下高温煅烧6 h，制备得Sr-MBG。
1.4.2 Sr-MBG的表征
场发射扫描电子显微镜分析：对Sr-MBG的表面形貌进行分析。称取少量Sr-MBG粉末溶于乙醇中，超声20 min使其充分分散，用移液枪吸取少量液体于铝箔纸上，用导电胶粘在样品台上，红外灯下干燥30 min，场发射扫描电子显微镜下观察并拍照。使用Imag J和GraphPad Prism 9.0软件分析样品粒径并绘制图像。
透射电镜分析：对Sr-MBG的内部结构和形貌进行分析。称取少量Sr-MBG粉末溶于乙醇中，超声20 min使其充分分散，用移液枪吸取少量液体于铜网上，红外灯下干燥30 min，透射电镜下观察并拍照。
X射线电子能谱分析：使用X射光电子能谱仪对Sr-MBG的元素进行定性分析。所得数据使用Origin 8.0软件分析并绘制图像。
X射线衍射分析：使用X射线衍射仪对Sr-MBG的晶体结构进行分析，电流参数设置25 mA，电压参数设置35 kV。所得数据使用Origin 8.0软件分析并绘制图像。
比表面积与孔径分析：通过全自动快速比表面积与空隙度分析仪检测Sr-MBG的比表面积与孔径。所得数据使用Origin 8.0软件分析并绘制图像。
1.4.3 BPS@Sr-MBG的制备与药物释放
BPS@Sr-MBG的制备：取5 mg Sr-MBG粉末和5 mg阿仑膦酸盐加入20 mL PBS(pH=7.4)中，黑暗环境中室温下搅拌24 h，8 000 r/min离心10 min，去上清，将沉淀用去离子水离心3次，60 ℃下干燥6 h，得到BPS@Sr-MBG粉末[29]。
BPS@Sr-MBG的药物释放：将制备的BPS@Sr-MBG粉末溶解于5 mL PBS(pH=7.4)中并搅拌，分别在不同时间点(2，4，6，12，24，48，72，96，120 h)取0.1 mL BPS@Sr-MBG与PBS的混合溶液，利用文献中的方法测量溶液中双膦酸盐累积释放浓度[30]，并补足等量的PBS。共测试3次。所得数据使用GraphPad Prism 9.0软件进行分析并绘制图像。
1.4.4 细胞实验
骨髓巨噬细胞的提取：取4周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下注射过量戊巴比妥钠处死后放入体积分数75%乙醇中消毒10 min，解剖小鼠，完整取出股骨和胫骨浸入体积分数75%乙醇中，带入超净实验台，小心剔除股骨和胫骨周围软组织，用无菌剪刀剪开股骨和胫骨两端，利用1 mL胰岛素针将股骨和胫骨骨髓冲洗至含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的ɑ-MEM完全培养基中培养。培养24 h后，弃悬浮细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养贴壁依赖细胞，待细胞融合达90%即得骨髓巨噬细胞。
BPS@Sr-MBG的细胞毒性：将骨髓巨噬细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板中，加入含不同质量浓度(0，10，20，40，80，100，150，200，250 mg/mL)BPS@Sr-MBG的ɑ-MEM完全培养基，培养1，3，5 d后，利用CCK-8法测定细胞活性。所得数据使用GraphPad Prism 9.0软件分析并绘制图像。
骨髓巨噬细胞的破骨细胞分化实验：将骨髓巨噬细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板中，加入含50 ng/mL核因子κB受体活化因子配体的ɑ-MEM完全培养基进行成骨诱导分化实验，同时分3组干预，空白组加入3 μL PBS，对照组加入3 μL双膦酸盐溶液(0.1 μg/μL)，实验组加入3 μL BPS@Sr-MBG溶液(0.1 μg/μL)，每组重复3孔，每2 d更换一次培养液，培养5 d[31]。
F-肌动蛋白环染色：破骨诱导分化5 d后，将各组细胞置于40 g/L多聚甲醛中固定15 min，用0.1% Triton X-100预固化5 min；用PBS浸泡3次，然后在37 ℃、避光环境下与霍罗丹明标记的鬼笔环肽(1∶500稀释度)孵育1 h；最后用DAPI染色细胞核，荧光显微镜下观察染色的细胞。
1.4.5 动物实验
实验分组：24只12周龄雌性C57BL/6小鼠适应环境1周后，采用随机数字表法分为假手术组、去卵巢组、双膦酸盐组、BPS@Sr-MBG组，每组6只。
构建骨质疏松模型与分组干预：皮下注射0.5%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉4组小鼠，沿小鼠背侧脊柱中线后腹腔交点左右两侧2 cm处纵行入路约2 cm，探查进入后腹膜腔，沿着输卵管找寻到卵巢之后，去卵巢组、双膦酸盐组、BPS@Sr-MBG组完整切除，并结扎输卵管防止出血，假手术组只在卵巢周围取下同等大小脂肪块，完整保留卵巢确定没有出血后回归原位[32]。术后小心缝合伤口。恢复1周后，双膦酸盐组、BPS@Sr-MBG组小鼠分别腹腔注射0.1 mL双膦酸盐溶液(5 mg/kg)、0.1 mL BPS@Sr-MBG溶液(5 mg/kg)，假手术组、去卵巢组小鼠腹腔注射0.1 mL PBS，1次/周。连续注射8周后，皮下注射过量戊巴比妥钠处死所有小鼠，取股骨进行Micro-CT扫描和组织学观察。
Micro-CT扫描：用高分辨率的Micro-CT扫描仪观察小鼠股骨微结构变化，参数设置：80 kV、112 mA和9 mm像素尺寸。使用扫描仪自带软件分析骨密度、骨小梁骨体积分数、结构模型指数、骨小梁间距、骨小梁数目和骨小梁厚度。
苏木精-伊红染色：将小鼠股骨置于10%EDTA中脱钙约4周，然后石蜡包埋，进行苏木精-伊红染色。
1.5 主要观察指标 BPS@Sr-MBG对骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的影响，BPS@Sr-MBG对骨质疏松小鼠股骨微结构的影响。
1.6 统计学分析数据用x±s表示。使用GraphPad Prism 9.0 (GraphPad SoftwareInc.，CA，USA)软件分析结果，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05说明差异有显著性意义。该文统计学方法已经上海交通大学医学院附属仁济医院生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症是一种以骨脆性增加和骨折易感性增强为特征的全身性代谢性骨骼疾病，并伴有骨密度降低和骨微结构恶化。尽管长期使用双膦酸盐能缓解骨质疏松症，但由于现有治疗方法的严重不良反应仍需要替代方法。
锶在治疗骨质疏松症和其他骨疾病方面具有巨大潜力，被应用于骨组织生物材料的开发与研究[25]。WU等[33]将锶掺入改良氨基介孔活性生物玻璃支架中作用于骨质疏松大鼠骨缺损部位，发现其可以通过激活cAMP/PKA信号通路促进成骨，发挥抗骨质疏松作用。HAIDER等[34]将生物活性玻璃与海藻酸盐结合形成支架并掺入锌和锶，在体外能稳定释放锌离子、钙离子和锶离子。这些生物活性玻璃支架作用于骨组织局部发挥其促成骨、抗菌等生物活性。但是骨质疏松是一种全身性骨骼疾病，治疗其引发的骨流失需要全身用药。生物活性玻璃负载药物后在骨质疏松个体体内不断缓释其中的药物和阳离子，通过血运作用于全身骨骼，发挥抗骨质疏松活性。
此次实验证明了BPS@Sr-MBG是一种比双膦酸盐效益更好的抗骨质疏松活性药物。CCK-8实验结果表明，0-100 mg/mL的BPS@Sr-MBG具有良好的细胞相容性。F-肌动蛋白环染色显示，BPS@Sr-MBG对破骨细胞分化有明显的负面影响。动物实验进一步证实了BPS@Sr-MBG的抵抗骨质流失作用。Micro-CT扫描和组织学分析显示，与去卵巢组相比，双膦酸盐组和BPS@Sr-MBG组小鼠股骨骨小梁数目增多、增厚增加、间距减小，并且BPS@Sr-MBG组相较于双膦酸盐组的变化趋势更为明显。通过对比各组结构模型指数可知，BPS@Sr-MBG组骨小梁比双膦酸盐组更接近板状骨小梁，说明使用BPS@Sr-MBG比单独使用双膦酸盐更能提高骨骼质量[35]；此外，感兴趣区定量分析还表明，它们均可通过提高去卵巢小鼠的骨密度来减轻骨丢失。与双膦酸盐相比，BPS@Sr-MBG在小鼠骨骺部能发现显著的成骨效应，说明BPS@Sr-MBG不仅对破骨具有抑制作用，对成骨也具有一定的促进作用。因此，相比于单纯使用双膦酸盐，BPS@Sr-MBG不仅可以减少BPS的使用剂量，而且能够有效对抗骨质疏松导致的骨流失，既能抑制破骨吸收又能促进成骨分化，是一种有前景的新型抗骨质疏松药物。
尽管实验证明BPS@Sr-MBG具有抗骨质疏松作用，但是现在仍未有生物玻璃负载相关抗骨质疏松药物上市，并且对于BPS@Sr-MBG的安全性和临床实用性仍有待进一步阐明。对于BPS@Sr-MBG的剂型、使用剂量以及给药方式也需要更多研究进一步探索。
综上所述，此次实验通过比较BPS@Sr-MBG和双膦酸盐对破骨细胞和骨质疏松个体的影响，发现BPS@Sr-MBG具有更强的抗骨质疏松活性，是一种潜在有效预防绝经后骨质疏松症的药物。这种生物活性玻璃负载药物的独立体系为临床上骨质疏松的防治提供了新见解。当然，在未来药物开发的背景下，BPS@Sr-MBG进入临床需要更多的研究和探索，但其仍不失为一种强效有力的潜在抗骨质疏松药物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

掺锶介孔生物活性玻璃负载双膦酸盐改善去卵巢小鼠骨流失

Strontium-containing mesoporous bioactive glass nanoparticles loaded with bisphosphonates ameliorate bone loss in ovariectomized mice

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