2.1   usAgNPs的表征结果   usAgNPs的形态见图1，透射电镜下为均匀散在分布的球形纳米颗粒[21]，平均粒径(4.7±1.4) nm，动态光散射检测显示其粒径约为8 nm。usAgNPs的粉末X射线衍射图谱显示在2θ=13.2°和16.5°处有明显的衍射峰(图2A)，表明结晶度和峰形较好[22]。



为了确定usAgNPs中Ag元素的化学状态，基于X射线光电子能谱测试研究了usAgNPs样品中的4种元素(C、N、O和Ag)，C1s发射光谱可分为3个主峰，288.2 eV中的峰来自于O=C-OH中的羧酸碳，而284.8 eV和289.3 eV中的峰与来自苯环中的芳基碳有关；N1s信号图显示，399.8 eV的峰分别可归因于配体中的-NH2基团；O1s发射光谱图显示531.5 eV处的组分是典型的金属-氧(Ag-O)键；Ag 3d水平的光谱显示，Ag 3d3/2和Ag 3d5/2自旋-轨道光电子的结合能为368.5 eV和374.5 eV(图2B)。根据之前的报告[23]，峰值在368.5 eV和374.5 eV处归因于金属银，这2个自旋能量分离为6.0 eV的峰，进一步表明usAgNPs样品中存在Ag[24]。
通过能量色散X射线光谱检测到usAgNPs中C、N、O和Ag的存在(图2C)，结果表明Ag元素均匀分散到usAgNPs中。



图3A热重分析曲线显示，usAgNPs降解分2个步骤：当温度在260 ℃时水分蒸发，usAgNPs从300 ℃开始分解，在400 ℃下完成羟基、羧基和吡啶环的分解，质量损失约为25%；当温度达到400 ℃后，usAgNPs的质量不再降低[25]。
图3B傅里叶红外光谱中显示，1 517 cm?1处的峰值归因于C-N拉伸，1 729 cm?1处的峰值归因于N-H拉伸；在1 288 cm?1和1 350 cm?1处发现的2个峰很可能分别对应于C=C和C≡O拉伸，1 288 cm?1处的峰值是由C-O-C对称拉伸引起的；1 082 cm?1处的峰值与C-O拉伸有关；881-762 cm?1范围内的几个峰可能归因于C-H键合，特别是摇摆振动；512 cm?1属于500-577 cm?1之间的细峰，这可能与Ag-O的振动[26]，779 cm-1除的峰值也归因于Ag-O振动。
图3C紫外光谱显示，usAgNPs在252-310 nm处具有较强的吸附带，表明吡啶环的π → π*跃迁[27]。由于材料的吸附能力与其表面积、孔隙体积和多孔结构密切相关[28]，为了证明usAgNPs可以吸附PL，分析了其氮吸附/解吸等温线。在图3D中，usAgNPs具有典型Ⅳ等温线，N2吸附下usAgNPs的表面积为29.003 m2/g、孔容为0.062 970 cm3/g，结果表明usAgNPs具有良好的吸附能力。



2.2   usAgNPs-PL的表征结果   透射电镜证明了PL表面成功吸附了usAgNPs，图4A显示了单纯PL的结构特征，外形为无色，圆盘状小体，部分表现为不规则的形状，无细胞核，展现出良好的结构[29]。当PL表面吸附usAgNPs后，通过透射电镜观察到usAgNPs在PL中的分布情况(图4B)。透射电镜表明了在(未染色的)PL表面能观察到黑色球形颗粒，说明usAgNPs都被空心状囊泡吸附[30-31]。当usAgNPs与PL混合后，收集小球获得usAgNPs-PL，并选择残留的上清液作为对照，Western blot检测结果显示(图4C)，与上清液相比，usAgNPs-PL被证实含有血小板衍生因子β、转化生长因子β、血管内皮生长因子和CD41。



2.3   usAgNPs-PL/CMC水凝胶的表征结果   扫描电镜下可见3种水凝胶都具有均匀多孔的三维网状结构，usAgNPs-PL的加入不影响凝胶体系中的微观结构，见图5A。为了研究水凝胶的流变行为，进行了动态温度扫描流变测试，计算水凝胶储能模量(G’)和损耗模量(G’’)，图5B显示3种水凝胶的G’和G’’在20-40 ℃之间相对稳定，各组水凝胶的G’值始终大于G’’，所以水凝胶仍然是一个弹性网络。当剪切速率轻微增加时，3种水凝胶的黏度迅速下降；当剪切速率逐渐增加时，3种水凝胶的黏度缓慢下降，表现出剪切稀化行为(图5C)。图5D显示CMC水凝胶、usAgNPs/CMC和usAgNPs-PL/CMC水凝胶在80 min后的溶胀率分别为907.3%，870.7%和836%，结果表明3种水凝胶都具有较强吸水能力，有助于吸收创面表面渗出液、保持创面干燥、加速伤口愈合过程、控制药物的释放。图5E显示3种水凝胶在室温下的状态，表明所有水凝胶都处于凝胶状态。



2.4   usAgNPs-PL/CMC水凝胶的体外抗菌性能   UsAgNPs和usAgNPs-PL通常作为创面愈合的液体形式给药，然而这些传统剂型很难停留在创面表面，并且存在涂抹后药物容易丢失和排出、可用性差且时间短等问题，对创面愈合产生不利影响[32]。相比之下，水凝胶表现出了兼容性，可以延缓药物释放，从而避免多次、重复给药。因此，实验选择CMC水凝胶作为载体来加载usAgNPs-PL复合物。
为了解usAgNPs-PL/CMC水凝胶的最佳抗菌效果，筛选不同质量浓度的usAgNPs和usAgNPs-PL，以此确定最终装载的usAgNPs-PL/CMC水凝胶的浓度，研究其对革兰阴性和革兰阳性菌的抗菌活性。如图6所示，usAgNPs-PL/CMC水凝胶明显抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。由于高浓度的Ag具有显著的毒性，因此装载水凝胶的最佳杀菌浓度是含有2.5 mg/mL的usAgNPs。可以看到usAgNPs、usAgNPs-PL和usAgNPs-PL/CMC水凝胶都明显抑制细菌的生长，经过usAgNPs-PL(其中usAgNPs的质量浓度为2.5 mg/mL)和usAgNPs-PL/CMC水凝胶处理后存活的细菌比usAgNPs多，虽然与usAgNPs相比，usAgNPs-PL和usAgNPs-PL/CMC水凝胶具有较低的抗菌效果，但usAgNPs-PL和usAgNPs-PL/CMC水凝胶均对细菌具有有效的抑制率。抑菌圈实验发现，usAgNPs/CMC水凝胶显著增加大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌范围(图7)。








生物膜的产生是导致抗生素耐药性和治疗效果差的原因之一，作者认为usAgNPs-PL/CMC水凝胶对生物膜具有高渗透性，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生物膜形成具有良好的抑制和清除作用，因此实验采用结晶紫染色和XTT测定两种方法来评价细菌生物膜的形成。XTT定量分析结果显示，usAgNPs-PL/CMC水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物膜的破坏作用较强，能够抑制细菌繁殖(图8A)。然后通过结晶紫染色确定生物膜的生物量，结晶紫染料可以与细菌细胞膜表面的分子和多糖结合。从图8B可以看出，对照组呈深紫色，表明细菌形成了相对完整的生物膜；然而，usAgNPs-PL/CMC水凝胶组形成了几乎透明的薰衣草色，这证明了usAgNPs-PL/
CMC水凝胶可以抑制细菌形成生物膜和生长繁殖。核酸染料PI能与死细菌结合后发出红色荧光，图8C显示对照组表现出微弱的红色荧光，相比之下，usAgNPs-PL/CMC水凝胶组显示较强的红色荧光，说明usAgNPs-PL/CMC水凝胶具有更重要的抗菌能力。基于上述抗菌实验结果，作者尝试探索usAgNPs-PL/CMC水凝胶的抗菌机制，进行了活性氧、丙二醛和ATP水平检测，其中，细菌产生大量活性氧是导致其死亡的主要原因。图8D显示usAgNPs-PL/CMC水凝胶诱导大量活性氧，细胞内活性氧积累的主要后果之一是逐渐建立的氧化应激对膜完整性的损害。因此继续使用丙二醛方法检测细胞脂质过氧化，以确定膜损伤的程度，如图8E显示，usAgNPs-PL/CMC水凝胶组活性氧诱导的丙二醛在大肠杆菌中达到149.94%、在金黄色葡萄球菌中达到127.08%，均高于对照组。为了评估usAgNPs-PL/CMC水凝胶对细菌代谢的影响，测定了细胞内ATP水平，如图8F所示，usAgNPs-PL/CMC水凝胶组中的ATP水平明显低于对照组，表明usAgNPs-PL/CMC水凝胶能够抑制细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)ATP水平。




2.5   usAgNPs-PL/CMC水凝胶促进糖尿病大鼠创面愈合实验结果   
2.5.1   实验动物数量分析   40只大鼠全部进入结果分析。
2.5.2   各组大鼠创面外观及细菌检测   如图9所示，所有治疗组在第7天创面愈合率显著增加，而模型组创面愈合速度较慢；模型组创面在治疗14 d时未完全闭合，仍可观察到不完全上皮化和薄上皮，其他治疗组的创面愈合率均高于模型组，其中usAgNPs-PL/CMC水凝胶组创面基本完全闭合，创面闭合率最高。创面细菌培养结果显示，usAgNPs-PL/CMC水凝胶可抑制创面细菌的存活和繁殖(图10)，与体外抗菌结果一致。








2.5.3   各组大鼠创面愈合质量   采用苏木精-伊红染色研究不同给药大鼠糖尿病创面的病理结构变化[33-34]，结果见图11A所示。苏木精-伊红染色显示，治疗7 d时，模型组创面边缘有较多中性粒细胞浸润，肉芽组织疏松，成纤维细胞较少，没有表皮形状；usAgNPs-PL/CMC水凝胶处理后，创面部位炎症细胞较少，肉芽组织和血管形成较多，出现更多的再上皮化和完整的表皮。治疗14 d时，各治疗组出现了再生真皮的组织结构，新生肉芽组织表皮均完整且厚，而模型组未观察到上述现象，在第14天仍有明显的炎症细胞浸润。
由于适当的胶原蛋白沉积和重塑可以改变组织的拉伸强度[35]，能产生更好的治疗效果，因此进一步通过Masson染色评估新生的胶原蛋白，评估真皮形成的效率，结果见图11B。Masson染色结果显示，与模型组和CMC水凝胶组相比，usAgNPs-PL/CMC水凝胶组和usAgNPs/CMC水凝胶组治疗第14天创面有更多形成和排列整齐的蓝色胶原纤维，其中usAgNPs-PL/CMC水凝胶组可见堆积的平行的成熟胶原纤维，而在其他治疗组中仅观察到部分增殖的胶原纤维。Masson染色结果表明，usAgNPs-PL/CMC水凝胶持续释放因子可以改善创面的胶原蛋白沉积，从而促进皮肤再生和糖尿病全层创面的修复。
血管生成在整个创面修复过程中至关重要，血管提供祖细胞、氧气和营养物质，以维持创面的增殖和重塑[36]，许多研究表明血管生成受损会导致糖尿病患者的慢性创面不愈合[37]。
CD31是一种血管生成标志物，在内皮细胞表面表达[38]。治疗第7天的CD31免疫组化染色显示，CMC水凝胶组和usAgNPs/CMC水凝胶组可见中等数量的阳性细胞，usAgNPs-PL/CMC水凝胶组阳性细胞最多(图11C、D)。



为了研究局部应用usAgNPs-PL/CMC水凝胶影响肉芽组织细胞的潜在机制，实验对增殖细胞标志物Ki67进行了免疫荧光染色[39]，结果见图12。Ki67免疫荧光染色显示，治疗第7天时， usAgNPs-PL/CMC水凝胶组创面组织中Ki67的表达丰富，而CMC水凝胶组创面组织中Ki67的表达增加不明显；此外，usAgNPs/CMC水凝胶组创面组织中Ki67表达水平(阳性细胞)显著高于CMC水凝胶组，CMC水凝胶组Ki67表达和模型组相比略有升高，表明usAgNPs-PL/CMC水凝胶可以通过控制成纤维细胞在伤口组织中的增殖而加速创面愈合。这些结果与创面愈合率、创面组织学和血管生成结果一致，表明usAgNPs-PL/CMC水凝胶可以作为支持usAgNPs-PL的支架，延长其体外存活时间，并将其原位送至糖尿病创面。



综上所述，usAgNPs-PL/CMC水凝胶通过促进胶原的发育、血管生成和肉芽组织中成纤维细胞的增殖促进糖尿病创面愈合。

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创面愈合是一个动态过程，包括止血、炎症、增殖和重塑4个阶段[1]。然而，高糖环境下的创面愈合非常缓慢[2]，特别是糖尿病的高糖环境为细菌提供了良好的滋生条件，导致细菌长期感染和长期创面难以恢复[3]。尽管传统抗生素在临床治疗中显示出一定的积极作用[4]，但由于耐药性尚未显示出令人满意的结果[5]，因此迫切需要找到一种新的抗菌材料来治愈糖尿病创面。
Ag+可以通过多种机制杀死细菌，包括干扰细菌细胞内的代谢、破坏细胞膜的完整性、催化生成活性氧和抑制生物膜的形成[6]。据报道，Ag负载纳米复合材料如Ag-金属-有机骨架(Ag@MOFs)不仅具有较高的抗菌性能[7]，而且促进Ag+渗透进入细菌[8]。Ag+可以从具有多孔结构的纳米复合材料中缓慢释放出来，具有持久的杀菌作用和高稳定性[9]。
聚合物水凝胶作为一种局部给药系统有助于控制原位药物库释放药物，实现长期的局部给药[10]。越来越多的研究表明，水凝胶是治疗糖尿病创面最理想的敷料[11]，亲水水凝胶能吸收创面渗出物保持环境的湿度，降低创面感染的风险[12]。水凝胶的这些特性在改善受损皮肤组织修复方面具有巨大的潜力[13]。
血小板(platelets，PL)被广泛认为在受损组织血管重建和细胞的增殖和分化中起到关键作用[14]。众所周知，PL会通过分泌活性物质(如血管内皮生长因子、血小板衍生因子、表皮生长因子和转化生长因子β)来促进糖尿病创面愈合和血管生成[15-16]。此次实验在血小板表面吸附超小银纳米颗粒(ultra-small silver nanoparticles，usAgNPs)并装载在羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)水凝胶中，观察其对1型糖尿病大鼠创面愈合的作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   银纳米颗粒材料合成实验和随机对照动物实验，组间比较进行单因素方差分析和独立样本t检验。
1.2   时间及地点   实验于2022年9月至2023年5月在锦州医科大学生命科学研究院、药学院实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验材料   微生物大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)[美国模式培养物研究所(ATCC)]；血小板提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；CMC(天津鑫博特化工有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺和硝酸银(广东西陇化工有限公司)；对苯二甲酸(上海沃凯药业有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒和Masson染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；CD31抗体(美国CST公司)；CD41抗体(美国Affinity抗体公司)；血小板衍生因子β、转化生长因子β和血管内皮生长因子抗体(沈阳万类生物科技有限公司)；Ki67抗体(ZenBio公司)。
1.3.2   实验仪器   X射线衍射仪(ULTIMALV，日本科学公司)；傅里叶红外光谱仪(布鲁克，德国)；紫外可见分光光度计(岛津UV-2550，日本)；高分辨率透射电镜(H-800电子显微镜，日本)；TristarⅡ3020表面积分析仪(Bel Japan Inc，日本东京)；差示扫描量热仪(DSC-60，岛津公司，日本)；旋转流变仪(安东帕 MCR302，奥地利)：磁力加热搅拌器(上海力辰科技仪器有限公司，中国)。
1.3.3   实验动物   健康雄性SD大鼠44只，SPF级，7周龄，体质量220-250 g，购自锦州医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证编号：SYXK[辽]2019-0007。大鼠饲养于温度 (22±2) ℃、相对湿度(65±10)%、光照/黑暗每12 h交替循环、干净通风的实验动物房中，分笼饲养(5只/笼)，饲养期间自由进食水。该实验经锦州医科大学动物保护与机构委员会批准，批准号：2022030501，遵循国家动物保护指南。所有实验动物均在麻醉下进行手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   实验方法   
1.4.1   usAgNPs的制备及表征   首先，将硝酸银和对苯二甲酸以1∶1的摩尔比(0.417 8 g硝酸银溶解于30 mL N，N-二甲基甲酰胺中，再将0.412 g对苯二甲酸溶于上述溶液中，继续搅拌使溶解完全)加入到50 mL圆底烧瓶中，然后将整个体系在避光条件下以300 r/min的速度持续机械搅拌，120 ℃回流加热20 h。反应结束后，15 000 r/min离心15 min，收集上清液，用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤3次，去除未反应的原料，最后在真空烘箱中80 ℃干燥18 h得到产物。 
采用高分辨率透射电镜、X射线衍射、X射线光电子能谱、热重分析、紫外光谱、傅里叶红外变换光谱、全自动比表面积及孔隙度分析对usAgNPs进行形貌、结构、稳定性和吸附性能表征。
1.4.2   usAgNPs-PL/CMC水凝胶的制备及表征   首先，从4只SD大鼠的心尖取出总共20 mL全血，分别放入4只5 mL采血管中，3 000 r/min离心20 min，使用血小板提取试剂盒获得PL[17]。 
CMC水凝胶的制备：称取1.0 g CMC溶解于25 mL蒸馏水中，在温和搅拌(120 r/min)条件下过夜得到CMC水凝胶。
usAgNPs/CMC水凝胶的制备：将2.5 mg usAgNPs均匀分散于1 mL CMC水凝胶中，得到usAgNPs质量浓度为2.5 mg/mL的usAgNPs/CMC水凝胶。
usAgNPs-PL/CMC水凝胶的制备：称取1.0 g usAgNPs加入10 mL DMSO中，再与10 mL PL混合，此时usAgNPs的质量浓度为50 mg/mL，57 000 r/min离心2.5 h，取最下面1 mL液体即为usAgNPs-PL。取200 μL usAgNPs-PL加入到1 800 μL蒸馏水中，得到usAgNPs-PL(其中usAgNPs质量浓度为5 mg/mL)；采用梯度稀释法制备含不同质量浓度usAgNPs的usAgNPs-PL，取1 mL usAgNPs-PL(其中usAgNPs质量浓度为5 mg/mL)和1 mL蒸馏水混合，即得到usAgNPs质量浓度为2.5 mg/mL的usAgNPs-PL，再取500 μL的2.5 mg/mL的usAgNPs-PL和500 μL蒸馏水混合得到usAgNPs质量浓度为1.25 mg/mL的usAgNPs-PL。取100 μL usAgNPs-PL(其中usAgNPs质量浓度为50 mg/mL)均匀分散在900 μL CMC水凝胶中，即得到usAgNPs-PL/CMC水凝胶(其中usAgNPs质量浓度为2.5 mg/mL)。
使用扫描电子显微镜观察3种水凝胶的孔隙结构，使用旋转流变仪对3种水凝胶的储能模式与耗能模式进行评估，采用动态力学分析仪测定水凝胶的力学性能，同时检测3种水凝胶的溶胀性能。
Western blot检测：采用Western blot检测usAgNPs-PL中生长因子的蛋白表达。取制备的usAgNPs-PL上清液和最下层 usAgNPs-PL液体进行蛋白浓度测定，将样品在100 ℃加热3 min进行蛋白变性，选择合适的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，孵育CD41、血小板衍生因子β、转化生长因子β以及血管内皮生长因子(1∶1 000)一抗4 ℃过夜，第2天回收一抗并用TBST清洗3遍，随后选择相应的二抗(1∶10 000)，在室温下孵育2 h并用TBST清洗3遍，最后，加入增强型化学发光显色剂显色，采用凝胶分析系统对目标蛋白进行拍照。
1.4.3   体外抗菌能力实验 
体外抗菌测试：将含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬浮液稀释，使菌液浓度约为108 CFU/mL。①将100 μL细菌悬浮液分别与100 μL PBS(对照组)、100 μL不同的实验组样品[5 mg/mL usAgNPs、usAgNPs-PL(其中usAgNPs质量浓度为5 mg/mL)、2.5 mg/mL usAgNPs、usAgNPs-PL(其中usAgNPs质量浓度为2.5 mg/mL)、1.25 mg/mL的usAgNPs、usAgNPs-PL(其中usAgNPs质量浓度为1.25 mg/mL)及usAgNPs-PL/CMC水凝胶(其中usAgNPs质量浓度为2.5 mg/mL)]混合，在37 ℃下培养12 h，使用酶标仪在600 nm处测量培养细菌的吸光度值。②将灭菌后直径为5 mm的药物敏感纸片分别浸泡在500 μL 的usAgNPs(2.5 mg/mL)、usAgNPs-PL(其中usAgNPs质量浓度为2.5 mg/mL)及usAgNPs-PL/CMC水凝胶中，先用无菌棉签把稀释后细菌悬浮液均匀涂抹在LB-琼脂板上，再把浸泡好的纸片放在LB-琼脂平板上，最后在37 ℃培养箱中培养过夜，通过测量抗菌圈的直径来评估抗菌性能。
细菌活性的荧光检测：取100 μL处于对数生长期的大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)悬浮液分别与100 μL的PBS(对照组)、usAgNPs-PL/CMC水凝胶加入到24孔板中混合，菌液浓度为108 CFU/mL，37 ℃恒温培养12 h后，3 000 r/min离心15 min，在室温下用PI染料在黑暗中染色15 min，使用PBS洗涤3次，通过荧光显微镜观察染色情况。对于PI染色，激发和发射波长分别为490 nm和635 nm。
抑制细菌生物膜检测：将500 μL大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)悬浮液放入24孔板中，菌液浓度为2.5×108 CFU/mL，在 37 ℃下培养 24 h以形成生物膜，用PBS洗涤3次后，将500 μL的PBS(对照组)和usAgNPs-PL/CMC水凝胶分别加入孔中与生物膜接触24 h。从孔中取出溶液，加入500 μL甲醇固定20 min。除去内部液体后，加入200 μL结晶紫染色30 min，随后冲洗3次。使用200 μL乙醇溶液孵育30 min，最后测量570 nm处的吸光度值。
细菌中活性氧的检测[18]：将500 μL的大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)悬浮液放入24孔板中，菌液浓度为5×108 CFU/mL，对照组加入500 μL PBS，实验组加入500 μL usAgNPs-PL/CMC水凝胶，于37 ℃恒温培养12 h后，用40 g/L多聚甲醛固定细菌。在黑暗环境中，将细菌与2’，7’二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)孵育0.5 h，用PBS洗涤细胞以除去多余的DCFH-DA，荧光显微镜下观察。使用酶标仪在488 nm和535 nm的激发和发射波长下测量活性氧的产生。
二甲氧唑黄(XTT)染色检测细菌活力：向24孔板每个孔中接种100 μL大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)悬浮液，菌液浓度为108 CFU/mL，分别与100 μL的PBS(对照组)和usAgNPs-PL/CMC水凝胶混合，于37 ℃恒温培养12 h后，用PBS洗涤3次，每孔加入0.04 mg/mL的XTT溶液，37 ℃下避光孵育3 h，在490 nm处测量吸光度值。
细菌细胞内ATP水平的检测：取1 mL处于对数生长期的大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)悬浮液，菌液浓度为1×108 CFU/mL，分别与1 mL的PBS(对照组)和usAgNPs-PL/CMC水凝胶(实验组)混合，于37 ℃恒温培养12 h后，3 000 r/min离心15 min后收集细菌，加入裂解液充分裂解，12 000×g离心5 min后取上清，使用ATP试剂盒测定细菌细胞内的ATP水平。
细菌细胞内丙二醛水平检测：将100 μL的大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)悬浮液加入试管内，菌液浓度为2.5×108 CFU/mL，分别与100 μL的PBS(对照组)和usAgNPs-PL/CMC水凝胶混合，37 ℃下共孵育12 h，加入200 μL丙二醛试剂盒反应液，置于95 ℃下加热40 min，冷却，12 000 r/min离心5 min后取上清，再次12 000 r/min离心2 min，最后在532 nm处测定吸光度值，计算细菌细胞内丙二醛水平[19]。
1.4.4   水凝胶修复糖尿病大鼠创面实验   40只SD大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字法分为5组：假手术组、模型组、CMC水凝胶组、usAgNPs/CMC水凝胶组和usAgNPs-PL/CMC水凝胶组，每组8只。
糖尿病大鼠皮肤创面的制备与分组干预：为建立1型糖尿病大鼠模型，提前给大鼠禁食过夜，水正常提供。模型组、CMC水凝胶组、usAgNPs/CMC水凝胶组和usAgNPs-PL/CMC水凝胶组大鼠腹腔注射55 mg/kg的1%链脲佐菌素溶液(链脲佐菌素溶于0.1 mol/L、pH=4.2的柠檬酸钠缓冲液中)[20]，假手术组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液。3 d后随机尾静脉采血测量血糖值> 16.7 mmol/L，并出现饮食量、饮水量和尿量增多症状时表明造模成功。饲养期间每天更换大鼠垫料、饮水、饲料。造模成功后，异氟烷气体麻醉5组大鼠，剃去毛发，在无菌环境下切除背部皮肤制作1个深达筋膜层的创面(直径20 mm)，不涉及皮肤下面的肌肉组织，将CMC水凝胶组、usAgNPs/CMC水凝胶组和usAgNPs-PL/CMC水凝胶组对应的圆柱体(直径约 2 cm、高约5 mm)凝胶敷于创面上，假手术组和模型组创面注射1.57 mL的生理盐水，并用医用纱布覆盖固定。大鼠单笼饲养，每1 d更换一次纱布。治疗7 d后，每组随机取2只大鼠，麻醉后处死，进行创面组织取材；治疗14 d后，麻醉后处死剩余的3只大鼠，进行创面组织取材。
创面外观及细菌检测：创面造模后第0，3，7，10和14天，对创面面积进行统计学分析。创面造模后第1天，每组随机选取1只大鼠，用无菌棉签在轻轻刮取创面表面，将每个棉签分别放入相同体积LB液体培养基里，37 ℃摇床孵育4 h，然后取10 μL共培养后的菌悬液均匀涂抹在固体琼脂板上，37 ℃恒温培养12 h后拍照。平板上的菌落数用Image J软件计数，每组3个平行样，实验重复3次。
苏木精-伊红与Masson染色：治疗7，14 d后，石蜡包埋切片后进行苏木精-伊红染色。治疗14 d后，将脱蜡组织切片进行Masson染色。
CD31免疫组化染色：治疗7 d后，将4 μm厚的创面组织切片在二甲苯中脱蜡，用梯度醇溶液再水合。用柠檬酸缓冲液(pH=6.0)孵育3 min，用PBS洗涤，山羊血清封闭切片20 min，加入CD31抗体(1∶100)，所有步骤都按照说明执行和染色。所有切片均在光学显微镜下随机拍摄3个不重复视野，并通过Image J分析计数。
Ki67免疫荧光染色：治疗7 d后，4 μm厚的创面组织切片在二甲苯中脱蜡，用梯度醇溶液再水合。采用高压法进行抗原提取，与山羊血清预孵育后，加入一抗Ki67(1∶100)在4 ℃下孵育过夜，用PBS冲洗几次后，加入抗兔IgG二抗孵育1 h，加入DAPI孵育2 min，荧光显微镜下收集图像。
1.5   主要观察指标   usAgNPs-PL/CMC水凝胶的微观结构、溶胀性能、力学性能及体外抗菌性能，以及在糖尿病大鼠创面中的应用效果。
1.6   统计学分析   所有数据均以x±s表示，使用GraphPad Prism 9.5(美国)、Origin 9.1(美国)软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05被认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经锦州医科大学生物统计学专家审核。

众所周知，糖尿病的伤创面愈合包含多个阶段的参与。在第一阶段，长时间暴露在高葡萄糖环境中的皮肤不可避免地为细菌增殖提供了有利条件，导致创面反复感染和出血，因此有必要快速抑制创面表面的细菌繁殖。传统抗生素虽然对许多细菌有效，但出现严重的耐药性，需要反复给药，因此迫切需要改进一种新型药物和给药系统来解决这个问题。此次研究设计了PL吸附usAgNPs，并将其加载到CMC水凝胶中，使usAgNPs-PL均匀分布在创面，加速了糖尿病的创面愈合。纳米银可以在几秒钟内杀死数百种细菌，通过催化活性氧的产生破坏细菌细胞内代谢、破坏细菌膜结构、抑制细菌生物膜的形成，达到快速抗菌效果。PL含有多种生长因子(血小板衍生因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子β、表皮生长因子等)，因此可以修复创面。此外，将usAgNPs与PL相结合，虽然纳米银和PL都具有促进创面愈合的作用，但是联合复合物(usAgNPs-PL)显示出更好的效果。根据前期研究的报告[40]，作者发现药物或纳米颗粒配制成悬浮液或溶液并通过在创面周围皮下注射给药，会引起疼痛和随后的损伤，降低患者的用药依从性；此外，注射后混悬液可能会扩散并迅速从创面部位移除，从而缩短在创面滞留的时间并削弱治疗效果。相反，水凝胶表现出相容性、顺应性和保留时间的延长，还避免了频繁的重复给药并产生持久的治疗效果，因此实验使用CMC水凝胶加载usAgNPs-PL，并研究了它们在加速糖尿病创面愈合中的潜在作用。水凝胶是亲水网络，可以吸收和保留水、体液和相关治疗分子，这些特性使水凝胶适用于伤口敷料、组织黏合剂或密封剂。创面用水凝胶管理和组织胶合应用必须在给定的时间范围内黏附在组织上，然后消失[41]。usAgNPsPL/CMC水凝胶可以促进创面部位肉芽组织的形成、再上皮化和胶原重塑，从而加速糖尿病创面的愈合过程。usAgNPs-PL/CMC水凝胶作为一种负载纳米颗粒的水凝胶是糖尿病创面愈合的有效靶向治疗剂。
总之，usAgNPs-PL/CMC水凝胶在糖尿病创面愈合中起着有效作用，usAgNPs-PL/CMC水凝胶可能为糖尿病创面提供有效的治疗方法。但是，还应进行更深入的研究和进一步的优化研究，以提高制备的纳米颗粒负载水凝胶的临床应用；另外，实验并没有从细胞水平验证usAgNPs-PL促进血管内皮细胞增殖以及血小板释放的多种生长因子(血小板衍生因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子β、表皮生长因子等)是如何调控通路来促进血管生成的，因此需要在细胞水平进一步完善。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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文题释义：

金属有机骨架：是由金属中心作为中心节点和有机桥连配体通过配位键自组装连接而成的高度结晶化网状配合物，因具有广谱抗菌、高效、长效、结构可调和热稳定性等优点，所以在医学领域有着广泛的应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

目前已知创面受损是多因素作用的结果，涉及细菌感染、氧化应激增加、细胞增殖不足以及新的肉芽组织形成受阻等多方面，其中起主要作用的是细菌感染，因此迫切需要开发一种更有效的治疗策略用于创面愈合。水凝胶有许多优良特性，如机械强度、弹性、含水量、生物活性和可降解性，可作为伤口的敷料应用。研究表明，羧甲基纤维素水凝胶具有可注射性、生物相容性和热敏性的显著特点，是理想的伤口修复材料。银-金属-有机骨架(Ag@MOF)由Ag+/团簇和有机配体组成，在抗细菌、酵母等微生物方面具有重要作用，Ag@MOF可以在聚合物基质中均匀分散，持续释放Ag+，从而起到持续杀菌的作用。来源于血小板的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子能明显促进血管生成。因此。此次研究将血小板表面吸附银纳米颗粒并装载在羧甲基纤维素水凝胶中，可以通过快速抑菌和促进血管生成来加速糖尿病创面愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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