软骨细胞中SIRT1基因敲减后作用状态不明确信号通路及对相关疾病或功能的影响

doi:10.12307/2024.352

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (20): 3123-3129.doi: 10.12307/2024.352

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软骨细胞中SIRT1基因敲减后作用状态不明确信号通路及对相关疾病或功能的影响

叶海明1，2，3，曾晖1，2，3，杨琪4，张耕1，2，3，翁鉴1，2，3，于斐1，2，3

北京大学深圳医院，1骨关节科，4超声影像科，广东省深圳市 518036；2骨科生物材料国家地方联合工程研究中心，广东省深圳市 518036；3深圳市骨科疾病与生物材料研究重点实验室，广东省深圳市 518036

收稿日期:2023-05-04 接受日期:2023-06-15 出版日期:2024-07-18 发布日期:2023-09-09
通讯作者: 于斐，博士，医师，北京大学深圳医院骨关节科，广东省深圳市 518036；骨科生物材料国家地方联合工程研究中心，广东省深圳市518036；深圳市骨科疾病与生物材料研究重点实验室，广东省深圳市 518036
作者简介:叶海明，男，1977年生，广东省汕尾市人，汉族，副主任医师，主要从事骨创伤与骨愈合方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82102568)，项目负责人：于斐；广东省基础与应用基础研究基金(2021A1515012586，2022A1515220111)，项目负责人：于斐；北京大学深圳医院科研启动金项目(KYQD2021099)，项目负责人：于斐；深圳“医疗卫生三名工程”项目(SZSM201612092)，项目负责人：曾晖；深圳市医学重点学科建设经费(SZXK023)，项目负责人：曾晖；深圳市高水平医院建设专项经费，项目负责人：曾晖

Exploration of signaling pathways with unclear action status and possible effects on related diseases or functions after knockdown of silencing information regulator 1 gene in chondrocytes

Ye Haiming1, 2, 3, Zeng Hui1, 2, 3, Yang Qi4, Zhang Geng1, 2, 3, Weng Jian1, 2, 3, Yu Fei1, 2, 3

1Department of Bone & Joint Surgery, 4Department of Medical Ultrasound, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; 2National & Local Joint Engineering Research Center of Orthopaedic Biomaterials, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; 3Shenzhen Key Laboratory of Orthopaedic Diseases and Biomaterials Research, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

Received:2023-05-04 Accepted:2023-06-15 Online:2024-07-18 Published:2023-09-09
Contact: Yu Fei, MD, Physician, Department of Bone & Joint Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; National & Local Joint Engineering Research Center of Orthopaedic Biomaterials, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; Shenzhen Key Laboratory of Orthopaedic Diseases and Biomaterials Research, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
About author:Ye Haiming, Associate chief physician, Department of Bone & Joint Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; National & Local Joint Engineering Research Center of Orthopaedic Biomaterials, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; Shenzhen Key Laboratory of Orthopaedic Diseases and Biomaterials Research, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82102568 (to YF); the Basic and Applied Basic Research Fund of Guangdong Province, Nos. 2021A1515012586 and 2022A1515220111 (both to YF); the Scientific Research Foundation of Peking University Shenzhen Hospital, No. KYQD2021099 (to YF); Shenzhen Project of Three Famous Items for Medical Care and Public Health, No. SZSM201612092 (to ZH); Shenzhen Medical Key Discipline Construction Fund, No. SZXK023 (to ZH); Shenzhen High-level Hospital Construction Special Fund (to ZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

高通量技术：该文中主要指基因芯片技术，是以同源DNA分子杂交为基本工作原理而设计的检测方法，能够检测某一物种所有mRNA的基因层面变化情况。
沉默信息调节因子1：位于人10号染色体，是哺乳动物中研究最为深入的Ⅲ型去乙酰化酶基因，通过催化蛋白质赖氨酸ε位去乙酰化而起到调节相关蛋白功能的作用。

背景：沉默信息调节因子1以去乙酰化的方式调控软骨细胞中相关蛋白的功能，参与软骨细胞增殖分化，促进软骨缺损修复。

目的：利用高通量技术筛选软骨细胞中沉默信息调节因子1基因敲减后作用状态不明确的信号通路以及产生变化的疾病或功能。
方法：取处于对数生长期的小鼠ATDC5软骨细胞，分2组转染：对照组转染沉默信息调节因子1基因敲减阴性对照慢病毒，实验组转染沉默信息调节因子1基因敲减慢病毒。转染72 h后，利用小鼠基因表达谱芯片GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array检测mRNA的基因层面变化情况，应用生物信息学技术筛选激活或抑制不明确的信号通路以及这些信号通路相关因子，并分析疾病或功能模块的富集情况。

结果与结论：①沉默信息调节因子1基因敲减后，小鼠ATDC5软骨细胞中激活或抑制状态不明确的信号通路有245条；②根据-log(P-value)排序选择排前20的激活或抑制状态不明确信号通路中的因子情况进行报道，包括IGFBP4、TGFBR1、CTGF、COL4A5、LHX2、IL1RL1、KLF6等；③根据-log(P-value)进行排序，细胞生长和增殖、生物体存活和细胞死亡与存活等14个疾病和功能密切相关模块明显变化；根据差异基因数量排序，生物体损伤和异常、癌症和细胞死亡与存活3个疾病和功能密切相关模块明显变化；根据-log(P-value)与差异基因数量综合排序，固有免疫应答这一疾病和功能模块被显著激活。

https://orcid.org/0009-0008-5401-0470(叶海明)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 高通量测序, 沉默信息调节因子1, 软骨缺损, 信号通路, 疾病或功能

Abstract: BACKGROUND: silencing information regulatory 1 (SIRT1) regulates the function of related proteins in chondrocytes in a deacetylated manner and participates in chondrocyte proliferation and differentiation, thereby promoting cartilage defect repair.
OBJECTIVE: To screen for signaling pathways with unclear action status after SIRT1 gene knockdown in chondrocytes, as well as diseases or functions that produce changes using high-throughput technology.
METHODS: ATDC5 chondrocytes from mice in logarithmic growth phase were divided into two groups: the cells were transfected with SIRT1 gene knockdown negative control lentivirus in control group and SIRT1 gene knockdown lentivirus in experimental group. GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array was used to detect the mRNA expression at 72 hours after transfection. Applied bioinformatics technology was also used to screen for unclear activation or inhibition signaling pathways and their related factors. Moreover, enrichment of disease or function modules was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: After knocking down the SIRT1 gene, there were 245 signaling pathways with unclear activation or inhibition status in the mouse ATDC5 chondrocytes. According to the ranking of -Log (P-value), we reported the factors in the top 20 signaling pathways with unclear activation or inhibition status, including IGFBP4, TGFBR1, CTGF, COL4A5, LHX2, IL1RL1, and KLF6. According to the ranking of -Log (P-value), there were significant changes in 14 disease or function modules, including cellular growth and proliferation, organism survival, cell death and survival. According to the number of differentially expressed genes, there were significant changes in three disease or function modules, including organismal injury and abnormalities, cancer, and cell death and survival. According to the comprehensive ranking of -Log (P-value) and the number of differentially expressed genes, the disease or function module related to intrinsic immune response was significantly activated.

Key words: high throughput technology, silent information regulator 1, cartilage defect, signaling pathway, disease or function

中图分类号:

叶海明, 曾晖, 杨琪, 张耕, 翁鉴, 于斐. 软骨细胞中SIRT1基因敲减后作用状态不明确信号通路及对相关疾病或功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3123-3129.

Ye Haiming, Zeng Hui, Yang Qi, Zhang Geng, Weng Jian, Yu Fei. Exploration of signaling pathways with unclear action status and possible effects on related diseases or functions after knockdown of silencing information regulator 1 gene in chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(20): 3123-3129.

图/表（结果） 6

2.1 SIRT1基因敲减后ATDC5软骨细胞中激活或抑制状态不明确的信号通路生物信息学技术分析发现，ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后，有245条信号通路的激活或抑制状态不明确(表1)。

2.2 SIRT1基因敲减后ATDC5软骨细胞中排序前20的激活或抑制状态不明确信号通路相关因子通过生物信息学技术，分析了ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后-log(P-value)排序前20的激活或抑制状态不明确的信号通路中的因子情况，为相关研究提供研究基础(表2)。

2.3 SIRT1基因敲减后ATDC5软骨细胞中疾病或功能模块的富集情况生物信息学技术分析发现，根据-log(P-value)进行排序，ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后，细胞中细胞生长和增殖、生物体存活、细胞死亡与存活、细胞发育、生物体发育、细胞周期、心血管系统发育与功能、细胞运动、传染病、癌症、生物体损伤和异常、组织形态学、心血管疾病、血液病这些疾病和功能模块密切相关并且这些疾病和功能模块为所有富集疾病和功能模块中排名最靠前的14位(图1)。生物信息学技术分析发现，根据差异基因数量排序，ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后，细胞中生物体损伤和异常、癌症和细胞死亡与存活这些疾病和功能模块密切相关并且这些疾病和功能模块为所有富集疾病和功能模块中排名最靠前的3位(图2)。

生物信息学技术分析发现，根据-log(P-value)与差异基因数量综合排序，ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后，细胞中固有免疫应答这一疾病和功能模块被显著激活(图3)。

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引言

软骨缺损是由创伤、炎症等引起软骨缺失、退变的一种疾病[1-2]，由于缺乏血管和神经并与循环系统分离，其自我修复能力较差，成为临床医生的棘手问题[3-4]。加强对软骨缺损修复新靶点的研究，有助于为骨科医生治疗软骨缺损提供新思路[5-6]。软骨细胞是软骨组织中最主要的细胞类型，通过其内部基因的改变能够实现软骨细胞增殖分化，从而有利于软骨缺损修复[7-8]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一种在哺乳动物中研究最为深入的Ⅲ型去乙酰化酶基因，与衰老关系密切[9-10]，依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激活，并以去乙酰化的方式调控软骨细胞中相关蛋白的功能，参与软骨细胞增殖分化[11-12]，促进软骨缺损修复[13-14]。传统的检测技术如qPCR、Western Blot、免疫组化或ELSA等，只能进行单个或少量因子的检测，若要进行大量因子的检测，则需要耗费大量的人力、物力、财力。随着高通量技术的发展[15-16]，使得应用少量标本进行大量因子检测成为可能，应用生物信息学技术分析自己及他人公布的数据库中的数据，可以分析大量因子在某一疾病、组织甚至细胞中的作用通路并富集该通路中的因子，为临床疾病治疗提供新靶点[17-18]。基因芯片是高通量检测技术中的一种，也是应用最早、发展最为完善的高通量技术之一，应用基因芯片可以检测某一物种全部mRNA相关的因子的变化情况，为相关研究提供理论基础[19-20]。
前期研究阐述了SIRT1基因敲减后ATDC5软骨细胞中被激活的细胞退变信号通路及因子表达情况[21]，在此基础上，此次研究采用慢病毒转染的方法将ATDC5软骨细胞中的SIRT1基因敲减，应用小鼠基因表达谱芯片GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array检测相关因子的表达，并结合后续的生物信息学分析探讨ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后作用状态不明确的信号通路以及对软骨缺损的可能影响，为临床治疗软骨缺损提供新策略及新靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，样本之间采用独立样本t检验分析。
1.2 时间及地点实验于2015年1月至2023年4月在上海吉凯基因科技有限公司、北京大学深圳医院骨关节科、骨科生物材料国家地方联合工程研究中心、深圳市骨科疾病与生物材料研究重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 ATDC5软骨细胞购买自南京科佰生物科技有限公司。
1.3.2 主要试剂胎牛血清由Ausbin提供，DMEM培养基由Corning提供，胰酶由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，Puromycin由Clontech提供，D-Hanks由上海吉凯基因技术有限公司提供，Aglient RNA 6000 Nano Kit由Aglient提供，GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit由Affymetrix提供。
1.3.3 主要仪器荧光显微镜购买自奥林巴斯，CO2培养箱自日本三洋，倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司，离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，生物安全柜购自上海振样创空气净化设备有限公司，Thremo nanodrop 2000购自Thremo，Aglient 2100 Bioanalyzer购自Aglient，GeneChip Hybridization Oven 645购自Affymetrix，GeneChip Fluidics Stations 450购自Affymetrix，GeneChip Scanner 3000购自Affymetrix。
1.4 实验方法
1.4.1 携载SIRT1基因的慢病毒转染ATDC5软骨细胞取处于对数生长期的ATDC5软骨细胞，胰酶消化后制备成浓度为(3-5)×107 L-1的细胞悬液，取2 mL/孔接种于6孔板内。待细胞汇合度达20%后分2组进行转染：对照组转染SIRT1基因敲减阴性对照慢病毒，实验组转染SIRT1基因敲减慢病毒。其中SIRT1基因慢病毒载体制备、具体转染方式及转染效率和SIRT1基因敲减效率检测参照课题组前期研究[21-22]。转染72 h后进行后续实验。
1.4.2 SIRT1基因敲减后ATDC5软骨细胞基因芯片检测 RNA质检：NanoDrop 2000及Agilent 2100检测；3’IVT反应：poly-A RNA对照准备，一链cDNA合成，二链cDNA合成，IVT反应，aRNA纯化，aRNA片段化；杂交。
1.5 主要观察指标 ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后激活或抑制状态不明确的信号通路及通路上存在的相关因子；ATDC5软骨细胞中SIRT1基因敲减后疾病或功能模块的富集情况。
1.6 统计学分析全部计量资料采用x±s表示，样本之间比较采用独立样本t检验分析，采用 SPSS 21.0软件(SPSS，Chicago，IL，USA)进行数据分析，P < 0.05代表差异有显著性意义。文章统计学方法已经北京大学深圳医院生物统计学专家审核。

讨论

SIRT1基因又称为长寿基因，是哺乳动物中研究最为深入的Ⅲ型去乙酰化酶基因，位于人10号染色体，依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激活，编码的蛋白质分子质量为120 kD，位于细胞核中。SIRT1基因通过催化蛋白质赖氨酸ε位去乙酰化而起到调节相关蛋白功能的作用，在骨科疾病中起到重要作用并受到越来越多的关注[23-24]。在软骨缺损中，SIRT1基因可以影响软骨细胞的细胞周期、DNA损伤修复、线粒体功能等促进软骨缺损修复[25-27]，但是目前SIRT1基因调控软骨缺损修复的具体机制并未阐述清楚，有待于进一步说
明[28-29]。因此，此次研究首先通过慢病毒转染技术敲减了小鼠ATDC5软骨细胞中的SIRT1基因，并通过后续的基因芯片检测全面研究与SIRT1基因相关的作用状态不明确的信号通路及对相关疾病或功能模块的可能影响，并将两者结合分析，为相关领域的研究提供靶点。
传统的分子生物学技术如qPCR、Western Blot、ELISA、免疫荧光或免疫组化等，只能进行单个因子或少量因子的检测，无法实现一个物种中所有编码基因相关因子的检测，而随着高通量技术的发展，对某一物种的全基因组检测成为现实，基因芯片、转录组测序、单细胞测序、蛋白质谱等技术不断发展，使得研究者可以在全mRNA、全转录组、全编码蛋白等层面对疾病机制进行探讨，并获得海量的数据[30-33]。
基因芯片因出现较早及技术比较完善而被广泛应用，受到了研究者的青睐，尤其是其结合生物信息学技术，能够分析出宏量的结论来支持相关领域中研究者的研究并提供预测信息为未来的研究指明方向[34-36]。在继往的研究中，学者可能更多的是关注阳性结果，也就是激活或者抑制状态明确的信号通路，而对于阴性结果，激活或者抑制状态不明确的信号通路则研究较少，但是这些信号通路也存在研究价值，可能因为标本选择、组织细胞的个体异质性等原因造成这些信号通路的状态不明确，但是其可为后续研究提供一定线索。此次研究在小鼠ATDC5软骨细胞中将SIRT1基因敲减后，应用Affymetrix公司的小鼠基因表达谱芯片GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array进行mRNA编码基因的检测，并通过后续的生物信息学技术分析，对相关疾病或功能模块进行预测，寻找到激活或者抑制状态不明确的信号通路，以及其中部分通路中存在的因子。作者认为与激活或抑制比较明确的信号通路相比，可能这些状态不明确的信号通路也有一定的研究价值，通过对其研究也有助于阐明SIRT1基因敲减对软骨缺损修复的作用机制。
此次研究结果发现，SIRT1基因敲减后，小鼠ATDC5软骨细胞中有肝纤维化/肝星状细胞活化、GADD45信号及成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞在类风湿性关节炎中的作用等245条信号通路的激活或抑制状态不明确，这些信号通路中包含了IGFBP4、TGFBR1、CTGF、COL4A5、LHX2、IL1RL1等因子。而根据-log(P-value)值进行排序，发现细胞生长和增殖、生物体存活、细胞死亡与存活等14个疾病和功能模块变化最为显著；根据差异基因数量排序，发现生物体损伤和异常、癌症和细胞死亡与存活这3个疾病和功能模块变化最为显著；根据-log(P-value)与差异基因数量综合排序，固有免疫应答这一疾病和功能模块被显著激活。作者以固有免疫应答为例分析了SIRT1基因敲减后ATDC5软骨细胞中基因功能网络。作者认为软骨细胞中SIRT1基因敲减后产生变化的疾病和功能模块，可能是这一条件下软骨缺损合并其他疾病，或这一条件下软骨缺损直接影响/被影响的疾病和功能模块的可能研究方向的预测，而245条激活或抑制状态不明确的信号通路可能对这一过程产生影响，并与这些通路中包含的因子关系最为密切。由于机制学研究中信号通路之间存在密切的联系[37-38]，同一因子可能存在于多条信号通路中，而不同的信号通路中又存在串扰现象[39-41]，从信号通路中的某些因子出发，探究状态不明确信号通路在此文叙述的条件下实际所起的作用，可能有助于揭示SIRT1基因在软骨缺损中的作用。
当然，研究也存在一定的局限性：首先，研究只是从宏观角度找到了一些可供后人研究的靶点，而缺乏进一步的qPCR、Western Blot、免疫组化等传统分子生物学检测的结果；其次，所使用的小鼠ATDC5软骨细胞与原代软骨细胞可能存在一定的区别，并不能完全反映原代软骨细胞中mRNA变化的结果；最后，只是进行了细胞层面的初步研究，缺少动物层面的研究。这些均是后续可以进一步研究的内容。
综上所述，在SIRT1基因敲减的小鼠ATDC5软骨细胞中发现了245条激活或抑制状态不明确的信号通路，并总结了其中20条信号通路相关的因子，结合此次发现的疾病和功能模块变化情况可为软骨缺损相关研究奠定基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

软骨细胞中SIRT1基因敲减后作用状态不明确信号通路及对相关疾病或功能的影响

Exploration of signaling pathways with unclear action status and possible effects on related diseases or functions after knockdown of silencing information regulator 1 gene in chondrocytes

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