2.1   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的形貌分析   图2为纳米羟基磷灰石的透射电镜图，由图可看出，纳米羟基磷灰石呈短棒状，粒径长度为60 nm左右。图3为聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的扫描电镜图，由图可看出，聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的表面会附着有纳米羟基磷灰石颗粒，微球的平均粒径为(27.77±8.38) μm，保持完整的球形。







2.2   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的成分分析   图4为纳米羟基磷灰石的X射线衍射图谱，经过与羟基磷灰石标准卡片对比，可以发现各衍射峰的相对强度和角度与标准卡片基本一致，并未出现明显的杂峰。



图5为纯聚乳酸微球、聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球和纳米羟基磷灰石的傅里叶红外光谱分析图。在图中可以看到，纯聚乳酸微球在1 758 cm-1处的强吸收峰为C=O的伸缩振动峰；1 037，1 077，1 134，1 183  cm-1处为C-O-O的伸缩振动峰，则证明了酯基的存在；1 277 cm-1的吸收峰对应CH-OH；1 386，1 459，2 881，2 946 cm-1对应-CH3的振动峰；1 369，2 881 cm-1归属于-CH的弯曲和伸缩振动峰；3 655 cm-1则是聚乳酸端羟基(-OH)的吸收峰。由此可以证明纯聚乳酸的微球成分为聚乳酸，且在制备过程中未发生化学变化。将聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球与纯聚乳酸微球、纳米羟基磷灰石的红外光谱图进行对比，发现聚乳酸1 758 cm-1处C=O和1 077 cm-1处C-O-O的伸缩振动峰强度增强，端羟基的吸收峰与纳米羟基磷灰石的吸附水峰合并成3 436 cm-1处弱宽峰，指纹区1 039，602，565 cm-1处PO43-的特征吸收峰证明了纳米羟基磷灰石的存在。纳米羟基磷灰石羟基的伸缩振动峰未发生偏移，说明纳米羟基磷灰石与聚乳酸间无氢键生成，进一步说明了纳米羟基磷灰石和聚乳酸只是单纯的物理混合，两者间没有发生任何化学变化。



由图6可以看出，Ca和P元素均匀分布在微球表面，且Ca/P为1.72，说明纳米羟基磷灰石保持其完整的状态且均匀分布在聚乳酸微球表面。



图7为纯聚乳酸微球和聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的热重曲线，当温度在380 ℃附近时，复合微球有很强的吸收峰，样品失重91.8%，说明聚乳酸此时已经分解，生成了气态产物，剩下的8.2%为纳米羟基磷灰石，与预期符合。



2.3   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的细胞毒性实验结果    实验结果见图8，实验组的细胞形态等级为1级，被认为是没有细胞毒性的。细胞活力检测结果显示，阳性对照组的细胞活力为10.79%，阴性对照组的细胞活力为97.98%，说明实验系统反应成立；实验组的细胞活力为71.43%，与空白对照组细胞活力比较≥70%，因此，复合微球浸提液被认为无潜在细胞毒性，符合生物安全性要求。



2.4   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球致敏反应实验结果   见表1，表明实验样品的极性与非极性浸提液均未引起皮肤致敏反应，致敏率均为0%，说明样品无潜在致敏性。



2.5   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球皮内反应实验结果   见表2，极性样品组的最终记分为0.00，非极样品组的最终记分为 0.02，实验样品最终记分≤1.0，无皮内刺激反应。



2.6   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的全身急性毒反应实验结果   小鼠体内注射实验样品浸提液24，48，72 h后，均未观察到小鼠出现全身毒性的任何症状，实验样品组和对照组动物体质量无明显异常，见图9，并且无任何动物死亡，对所有动物进行大体解剖检查亦未见明显异常。实验结果表明，实验材料浸提物没有导致小鼠死亡或引起小鼠全身毒性反应。



2.7   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球热源反应实验结果   实验结果表明，3只新西兰兔的体温分别升高0.1，0.2，0.1 ℃，升高温度总和为0.4 ℃，个体体温升高值均低于0.6 ℃，体温升高总和低于1.3 ℃，表明该实验样品符合热源检查规定，见表3。



2.8   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的骨植入实验结果   材料植入后1，4，26周，新西兰兔平均体质量增长基本正常，精神状态良好，外观及行为正常，植入部位组织未见血肿、水肿、炎症等病变，未发现实验样品对新西兰兔产生异常作用。兔体质量变化如图10所示。



材料植入后1周组织学观察结果如图11所示，实验组与对照组植入缺损部位骨外膜可见较规则的骨小梁和软骨形成，周围残留少量结缔组织，缺损部位骨内侧可见骨小梁和软骨形成，其间可见纤维结缔组织和炎症反应。材料植入后4周组织学观察结果如图12所示，实验组植入缺损部位骨外膜可见较规则的骨小梁和软骨形成，部分植入缺损部位骨外膜可见编织骨形成，周围残留少量纤维组织，缺损部位骨内侧可见纤维结缔组织和骨小梁形成，并伴有炎症反应；对照组植入缺损部位骨外膜可见较规则的骨小梁和编织骨形成，周围残留少量纤维组织，缺损部位骨内侧可见纤维结缔组织、骨小梁和编织骨形成，并伴有炎症反应。材料植入后26周组织学观察结果如图13所示，两组植入缺损部位可见薄层纤维包膜，缺损部位新密质骨形成，并可见轮状哈佛氏管内血管，骨内侧边缘不规则，骨厚度增加，部分缺损部位可见新的小骨髓腔，骨内侧边缘不规则。组织学半定量评分结果显示，实验组植入后1，4，26周刺激评分为1.42，0.00，0.00，刺激等级均为无刺激。











2.9   复合微球的生物相容性   由此次实验结果可知，聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球具有良好的生物相容性。

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每年因疾病和事故等造成的骨损伤病例达数百万，临床上对于骨缺损修复和骨内固定材料有大量需求[1-2]。聚乳酸是一种生物相容性良好、可降解的聚合高分子材料，具有优异的力学性能、可加工性，其降解的中间产物是乳酸，最终降解为对人体和环境无害的二氧化碳和水[3-4]。羟基磷灰石是脊椎动物牙齿和骨骼的最主要无机成分，具有优良的生物相容性和成骨活性，并且可与宿主骨组织形成良好的骨性结合，是优异的骨组织替代材料[5-6]。纳米羟基磷灰石由于具有更高的比表面积、小尺寸的特点，表现出更高的成骨活性和骨修复能力[7]。聚乳酸是疏水性材料且不具有成骨活性，其产生的酸性降解产物可能会导致无菌性炎症的发生；纳米羟基磷灰石颗粒可加工成一定结构的陶瓷支架，但高温烧结过程中会显著损失其纳米特性[8-9]。聚乳酸和纳米羟基磷灰石的复合，可将两者各自的优点结合：既保留羟基磷灰石的纳米生物特性，又保留了聚乳酸优异的力学性能，同时可缓解无菌性炎症的发生，促进细胞的附着、增殖和新骨组织生长，得到具有优异的生物可降解性、力学性能和成骨活性的骨修复材料[10-12]。
聚乳酸和纳米羟基磷灰石的复合材料可制成微球、薄膜、多孔支架、块体等形貌[9]。通常情况下，在骨组织工程应用方面，相比较于其他形貌，微球具有独特的三维结构和较大的比表面积与小尺寸的特点，可增强细胞黏附生长及增殖迁移，并且微球还具有可流动性，能够直接注射到不规则组织缺损部位[13-14]。在生物组织工程中，将聚乳酸和纳米羟基磷灰石以微球形式复合，可以通过注射等方式移植到骨缺损部位[13，15]，在骨缺损部位处复合微球可以保持自身稳定的形态，为骨组织修复提供三维结构，增强成骨细胞的增殖分化。复合微球除了自身可以作为骨修复材料之外，还可以通过热压成型、选择性激光烧结等技术制备出具有特定结构的骨组织修复支架，有助于提高有机和无机材料的复合均匀性[16]。
随着近些年纳米技术的快速发展，人们研究发现当材料的尺寸到达纳米等级之后，材料的物理和化学性能可能会发生特异性变化，使得纳米材料在医学领域中具有巨大的潜在应用前景。但是随着纳米材料的组成、形态、化学性质、植入部位以及潜在应用变得越来越复杂，临床使用的纳米材料的生物安全性已成为一个主要问题，尤其对于纳米材料以及包含纳米相的医疗器械，因为纳米材料具有尺寸小、比表面积大等独特特性，可能会引发特殊的生物效应，其生物安全性也是人们关注的重点。ISO/TR 10993-22：2017中也给出了纳米材料以及包含纳米相的医疗器械生物安全性评价的相关指导原则。
实验采用简单易于实现的乳液溶剂挥发法来制备聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球[17]，并对其微观形貌、细胞毒性、致敏反应、皮内反应、全身急性毒反应、热源反应、骨植入实验进行了研究，开展聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球生物安全性评价，为复合微球的医学应用提供生物安全性依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   材料学及医用生物材料的生物安全性评价实验。
1.2   时间及地点   材料制备和形貌成分表征实验于2021年7-10月在武汉理工大学材料复合新技术国家重点实验室完成；生物安全性评价实验委托第三方检测机构青岛科创质量检测有限公司，依据国家标准《医疗器械生物学评价》要求在2021年9月至2022年7月于山东青岛完成。
1.3   材料
1.3.1   主要试剂与材料   氯化钙(中国国药集团化学试剂有限公司)；磷酸氢二钠(上海麦克林生化科技有限公司)；外消旋聚乳酸(相对分子质量10万，济南岱罡生物工程有限公司)；二氯甲烷(中国国药集团化学试剂有限公司)；聚乙烯醇(阿拉丁试剂有限公司)；MEM 完全培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)；生理盐水(山东齐都药业有限公司)；棉籽油(山东西亚化学工业有限公司)；高密度聚乙烯树脂(山东优索化工科技有限公司)；二乙基二硫代氨基甲酸锌(上海麦克林生物化学有限公司)。
1.3.2   主要仪器   电子天平(XB220A，Precisa)；低速离心机(TD4，上海卢湘仪离心机有限公司)；聚能式超声波材料乳化分散(XO，南京先欧仪器制造有限公司)；恒温磁力搅拌器(HJ-3，常州国华电器有限公司)；恒速电动搅拌器(JJ-1B，常州澳华仪器有限公司)；磁力加热搅拌器(HJ-6，金坛区西城新瑞仪器厂)，真空冷冻干燥机(LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司)；傅里叶红外光谱仪(Thermo Scientific Nicolet iS20，赛默飞世尔科技公司)；台式恒温摇床(TS-50H，上海百典仪器设备有限公司)；扫描电子显微镜(JSM-IT200型，日本电子株式会社)；透射电子显微镜(JEM-2100F型，日本电子株式会所)。
1.3.3   实验动物   健康初成年新西兰兔18只，雄性，体质量2.0-3.0 kg，由济南西岭角养殖繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)2020 0004。健康豚鼠40只，雄性，初成年，体质量300-400 g，由济南西岭角养殖繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)2020 0004。健康KM小鼠20只，初成年，雄性，体质量32-38 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)2019 0003。
每天供给适宜的商品动物饲料，每天给予充足的清洁饮用水，饲料和饮水中的污染预计不会对实验结果有潜在的影响，温度控制在19-25 ℃范围，相对湿度控制在30%-70%范围，光照采用12 h明12 h 暗。实验经武汉理工大学实验动物伦理委员会审议批准[WHUT动(伦)2022-040号]。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   实验方法   
1.4.1   纳米羟基磷灰石的制备   采用沉淀法合成纳米羟基磷灰石，具体制备过程如下：将氯化钙溶解于超纯水中制备
0.033 4 mol/L的氯化钙溶液，将磷酸氢二钠溶解于超纯水中制备0.02 mol/L的磷酸氢二钠溶液；将等体积的磷酸氢二钠溶液迅速加入正在搅拌的氯化钙溶液中，混合溶液中Ca/P=1.67；调控反应温度为80 ℃，pH值在9-10之间，反应时间为
1 h，反应完毕后静置24 h；将白色沉淀离心(4 000 r/min离心
5 min)沉淀4次，冷冻干燥成粉末备用。
1.4.2   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的制备   采用乳液溶剂挥发法制备复合微球：将5 g的聚乳酸溶解于100 mL二氯甲烷溶剂中；将0.5 g的纳米羟基磷灰石加入到含聚乳酸的二氯甲烷溶液中，机械搅拌20 min后冰水浴超声15 min，得到油相。再将5 g的醇溶解于1 L超纯水中，在80 ℃下水浴锅中搅拌溶解1 h左右，停止加热并冷却至室温，得到水相。将含有纳米羟基磷灰石和聚乳酸的二氯甲烷溶液倒入聚乙烯醇溶液中，采用恒速电动搅拌器(转速为1 000 r/min)机械搅拌约11 h，固化得到聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球；搅拌停止后静置过夜，将白色沉淀离心(4 000 r/min离心5 min)后冷冻干燥，得到聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球粉体(纳米羟基磷灰石质量比为10%)。
1.4.3   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的形貌特征   将纳米羟基磷灰石处理后，用透射电子显微镜分析其外貌及形状。取聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球超声分散于乙醇中，处理后用扫描电子显微镜分析其外貌及形状。
1.4.4   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的成分分析   将纳米羟基磷灰石处理后用X射线衍射仪(D8 Advance)分析其相成分。在4 000-400 cm-1红外扫描波长范围内，对纯聚乳酸微球、聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球和纳米羟基磷灰石进行傅里叶红外光谱分析。选用STA449F3型同步热分析仪对干燥后的纯聚乳酸微球和聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球进行热重分析，氩气氛围下，从室温下以20 ℃/min的升温速率至1 000 ℃。取聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球超声分散于乙醇中，处理后用扫描电子显微镜进行面扫描分析。
1.4.5   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的细胞毒性   取1 g环氧乙烷灭菌的聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球样品(或高密度聚乙烯树脂、二乙基二硫代氨基甲酸锌)，置入5 mL MEM完全培养基中，于37 ℃培养箱中浸提24 h，制备材料浸提液。
将培养好的小鼠成纤维细胞(BFB细胞库)用0.25%胰蛋白酶溶液消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度为105 L-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL。置于体积分数5%CO2培养箱中37 ℃培养24 h后，弃去培养液，分4组处理：实验组加入100 μL复合微球浸提液，空白对照组加入100 μL MEM完全培养基，阴性对照组加入100 μL高密度聚乙烯树脂浸提液，阳性对照组加入100 μL二乙基二硫代氨基甲酸锌浸提液，每组设6个平行孔。置于体积分数5%CO2培养箱中37 ℃培养24 h后，弃掉浸提液，每孔中加入50 μL的MTT
(1 mg/mL)溶液，继续培养2 h后，弃掉MTT溶液，每孔中加入100 μL的异丙醇，在摇床中37 ℃、60 r/min振荡培养30 min，在酶标仪以 570 nm 波长测定吸光度值。按照标准《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》中的要求对细胞形态进行观察评级，并评判细胞活力。
细胞存活率(%)=100%×A570e/A570b
式中：A570e为实验组/阴性对照组/阳性对照组吸光度平均值，A570b为空白对照组吸光度平均值
1.4.6   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的致敏反应   取2 g环氧乙烷灭菌的聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球样品，分别置入10 mL的生理盐水(极性)和棉籽油(非极性)中，于37 ℃培养箱中浸提24 h，分别制备复合微球极性浸提液与非极性浸提液。
按照标准《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》中的方法，选用检疫合格的豚鼠40只，按照体质量大小随机分为对照组和样品组，其中阳性对照组(注射1-氯-2，4-二硝基苯)10只，极性阴性对照组(注射生理盐水)5只，极性样品组(注射复合微球极性浸提液)10只，非极性阴性对照组(注射棉籽油)5只，非极性样品组(注射复合微球非极性浸提液)10只。实验前 24 h，在豚鼠背部肩胛骨附近除毛，除毛面积3 cm×3 cm，在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位皮内注射0.1 mL各样品浸提液；皮内诱导阶段未出现刺激反应后，采用面积约8 cm2的敷贴片局部贴敷于每只动物的肩胛骨内侧部位，覆盖诱导注射点；用封闭式包扎带固定敷贴片，并于48 h后除去包扎带和敷贴片；局部诱导阶段后14 d，激发全部实验动物，并于24 h后除去包扎带和敷贴片；除去敷贴片后24，48 h，分别观察各组动物激发部位的皮肤反应，按照标准评分记录结果。将反应记分为1-3分的动物数量除以总动物数量得出致敏率。
1.4.7   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的皮内反应   取2 g环氧乙烷灭菌的聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球样品，分别置入10 mL的生理盐水(极性)和棉籽油(非极性)中，于37 ℃培养箱中浸提24 h，分别制备复合微球极性浸提液与非极性浸提液。
在3只新西兰兔脊柱左边上下侧的5个点分别皮内注射0.2 mL的样品极性浸提液(极性样品组)和样品非极性浸提液(非极性样品组)，相对应的在右边上下侧则注射0.2 mL的极性溶剂生理盐水(极性对照组)和非极性溶剂棉籽油(非极性对照组)。注射后24，48，72 h，观察各注射部位状况，根据标准《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》中关于皮内刺激实验的记分系统记录实验结果与反应评分。评分方法：将每只动物24，48，72 h后的全部红斑与水肿记分相加，除以15，计算出每只动物记分，并取平均记分；各组平均计分相加得总平均计分。实验样品组总平均记分减去对照组总平均记分可得出样品的最终记分。
1.4.8   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的全身急性毒反应  取2 g环氧乙烷灭菌的聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球样品，分别置入10 mL的生理盐水(极性)和棉籽油(非极性)中，于37 ℃培养箱中浸提24 h，分别制备复合微球极性浸提液与非极性浸提液。
给药前，先称量KM小鼠体质量，极性样品组通过尾静脉注射给予复合微球极性浸提液，给药体积均为50 mL/kg，极性对照组尾静脉等量注射生理盐水；非极性样品组通过腹腔注射复合微球非极性浸提液，给药体积均为50 mL/kg，非极性对照组腹腔注射等量棉籽油，每组5只小鼠。注射后，对每只小鼠进行观察，连续观察3 d，每天称体质量1次，观察药物对小鼠体质量的影响。观察后对小鼠进行大体解剖学检查，并记录结果。对死亡和存在大体病理改变的存活动物的器官进行病理组织学检查。
1.4.9   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的热源反应   取15 g紫外灭菌30 min的聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球样品，加入75 mL生理盐水中，于37 ℃下60 r/min摇床中浸提24 h，制备材料浸提液。
取将新西兰兔3只，在实验前1 h停止给食直到实验完毕，每隔30 min测量体温1次，共测量2次，两次体温差在0.2 ℃内，可用于实验。从新西兰兔耳缘静脉注入样品浸提液，注射剂量为10 mL/kg，每隔0.5 h测量一次体温，共测6次，以测量体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔升高温度。当新西兰兔升温为负值时，均以0 ℃计。按照《中国药典》(2020版)1142热源检查法中的要求，3只家兔中，体温升高均低于0.6 ℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3 ℃时，则认为符合热源规定；反之，则需要另取5只兔进行复试，在复试的5只兔中，体温升高0.6 ℃或高于0.6 ℃的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5 ℃或低于3.5 ℃，均判定热源检査符合规定，反之则不符合规定。

1.4.10   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的骨植入实验   称取0.02 g聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球倒入直径定制的模具中热压成型，制备出36个直径2 mm、长6 mm大小的圆柱状实验样品植入物(图1)；对照品为高密度聚乙烯棒(Hatano Research Instiute，FDSC，H-211)植入物。

实验24 h前，在12只新西兰兔后肢胫骨部位内侧除去一定面积的被毛，经静脉注射0.08 mL/kg舒泰®50(法国维克有限公司)，经肌肉注射0.08 mL/kg速眠新Ⅱ(敦化市圣达动物药品有限公司)进行全身麻醉。将兔后肢部分逐层切开，分离皮肤于皮下组织，划开骨膜，暴露出胫骨，在胫骨上钻孔进行骨制备。钻孔后用植入物填充满，左侧胫骨植入实验样品(实验组)，右侧胫骨植入对照样品(对照组)，左右各植入3个植入物。在实验期内每天观察实验动物，并记录任何异常发现，包括局部反应及异常行为，每周称体质量一次并记录。植入后1，4，26周，每个时间点以空气栓塞法处死4只兔，解剖后暴露植入部位，检查每一植入部位正常组织结构的改变，切下植入物连带足够的未受影响的骨组织，放入体积分数10%中性缓冲甲醛溶液中固定24 h以上，脱钙后将完整组织包膜与植入物一起包埋，切片，苏木精-伊红染色后进行组织病理学检查。组织学图片，从炎症(多形核白细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、巨细胞、坏死)、新血管形成、纤维化、脂肪浸润、创伤性坏死、异物碎片方面进行评分，最后取平均分，将实验组所得评分与对照组所得评分相减，减数值越小刺激越小。
1.5   主要观察指标   聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的材料学表征和生物安全性评价。
1.6   统计学分析   所得数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据以x±s表达，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经武汉理工大学统计学专家审核。

聚乳酸是具有可降解性和优异力学性能的生物材料，但其是强疏水性材料，并且聚乳酸不能够促进成骨。羟基磷灰石是人体骨骼和牙齿中的主要无机成分，具有优良的生物相容性和成骨活性，但因为其力学性能不足无法加工成型。ZHANG等[16]制备了聚乳酸/羟基磷灰石复合材料，实验结果表明，高掺量的聚乳酸/羟基磷灰石复合材料支架相比于纯羟基磷灰石支架具有更高的抗压强度。NEVADO等[18]的研究证明，加入羟基磷灰石后，聚乳酸纤维的表面粗糙度增加，促进了细胞黏附与增殖。LIU等[19]采用相分离技术制备纳米羟基磷灰石/聚乳酸复合支架，结果发现随着纳米羟基磷灰石掺入量的增加，复合支架变得更有利于细胞的黏附和增殖。尹浩月[20]通过冷冻干燥技术制备出聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合支架，该支架具备优良的孔隙率和较高的抗压强度，成骨活性良好，显示出其作为骨修复支架的应用前景。因此，将聚乳酸和羟基磷灰石复合，结合两者间的优点[19，21-22]，可以促进细胞黏附和增殖，得到具有优异生物可降解性、力学性能和成骨活性的骨修复复合材料[20]。
微球的球形态和小尺寸使其具有较高的比表面积和三维结构，从而能更好地促进细胞黏附、增殖和分化；微球具有连通微孔的粗糙表面，可使细胞黏附更加牢固，从而可以实现更好的细胞生长；同时，微球具有可流动性，能被开发成可注射试剂，能够直接注射到组织处；并且具有多孔结构和含有成骨特性，在促进骨缺损修复方面显示出巨大的潜力[23-25]。LEE等[26]的一项研究证明了在不借助生物或化学因素的情况下，海藻酸钠微球具有在体内诱导钙化的内在能力。MENG等[27]开发了壳聚糖微球复合磷酸钙骨水泥支架，将其植入兔股骨16周后，该支架与周围骨完全融合，骨与植入物界面之间未形成纤维层。KANG等[24]制备了含有羟基磷灰石的可注射聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，体外细胞培养微球时观察到大量的成骨细胞，植入小鼠背部皮下6周后有明显的骨再生现象。ZHANG等[28]研究了一种明胶/纳米羟基磷灰石复合微球，实验结果表明，该复合微球能有效促进MG63细胞的黏附和生长，还可作为注射型微支架。SONG等[29]用气流剪切法制备出一种聚乳酸-羟基乙酸共聚物/纳米羟基磷灰石复合微球，实验结果表明高掺量的纳米羟基磷灰石复合微球可促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化，当纳米羟基磷灰石掺量高时，产生更多的粗糙多孔表面来诱导骨细胞长入，对骨修复起着重要的加速作用。因此，将聚乳酸和纳米羟基磷灰石以微球形式复合，复合微球为骨组织修复提供三维结构，增强成骨细胞的黏附、增殖和分化[20，24]。复合微球除了本身可以作为骨修复材料之外，还可以通过热压制备致密的多孔结构支架或是通过选择性激光烧结制备更复杂的三维结构等[16]。
随着对纳米技术的不断研究，发现当材料的尺寸达到纳米级后，其物理化学性能会发生一些特异性变化[30-31]。根据“纳米效应”理论，单位质量的纳米粒子表面积明显大于微米粒子，其原子数目也明显增加，提高了粒子的活性，有利于组织的结合[31]。与微米材料相比，纳米材料显示出了更好的成骨活性，成为一种优良的骨修复材料[32-33]。BOOS等[34]的研究发现，纳米骨植入物具有更好的与骨组织相互作用的功能，促进骨缺损部位修复。HARMS等[35]测试了纳米晶体骨水泥在羊胫骨干骺端负重缺损模型中的成骨能力，发现纳米骨是一种高效的骨修复材料。体外实验证明纳米级的羟基磷灰石、Al2O3和TiO2材料促进成骨细胞的生长、贴附、增殖以及基质的合成，有良好的骨结合效应[7]。纳米级的羟基磷灰石比普通羟基磷灰石具有更好的物理和化学稳定性，能够快速地与骨组织结合，减少诱发骨溶解的细胞因子的产生，并增强保护性因子的表达，给早期的假体提供了稳定性，防止松动。SCHÜT等[36]曾提出“必须注意纳米材料的生物相容性，并确保其内在毒性不会超过其益处。”首先，由于尺寸极小且表面积较大，纳米材料具有不同的物理化学性质，这将使得纳米颗粒更具反应性和催化性；第二，在纳米医学领域，外源性的纳米颗粒可以在静脉注射或间质注射后不经过正常的胃肠吸收过程而被输送到人体；第三，在人体内，纳米颗粒有可能与生物分子相互作用或在人体组织或器官中积累，这些都可能会引发人体特殊的生物反应[37]。世界卫生组织和国际癌症研究机构仅根据实验动物的致癌性数据将TiO2和炭黑纳米颗粒归类为可能对人类致癌的物质[38]。SARGENT等[39]的研究表明，吸入多壁碳纳米管会导致小鼠发生肿瘤。JOHANNSEN等[40]在一项临床试验中，对10例前列腺癌患者进行了前列腺内注射纳米颗粒分散剂和使用超顺磁性纳米颗粒进行热疗，结果显示热治疗后1年，前列腺中仍可检测到纳米颗粒沉积，但未观察到全身毒性。目前大多数纳米药物产品的临床试验报告主要关注药物的治疗效果，而不是关注于纳米颗粒应用于人体的生物安全性或不良影响，因此进行生物安全性评价是纳米材料产品临床应用所必需的[41]。ISO/TR 10993-22：2017中也给出了纳米材料以及包含纳米相的医疗器械生物安全性评价的相关指导原则。
此次课题研发了一种聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球骨修复材料[17]，对其进行形貌表征和物质分析，并参照GB/T 16886标准对材料进行生物安全性评价。由扫描电镜图中可见，所制备的聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球呈现较为完整的球形。由傅里叶红外光谱分析可知，该微球的物质组成为聚乳酸和纳米羟基磷灰石的复合物，无任何化学变化，只是简单的物理混合。
采用传统的MTT法对聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球进行细胞毒性检测，实验结果表明，样品组的细胞形态为1级且细胞活力良好，不存在潜在的细胞毒性。在致敏反应实验中，采用豚鼠最大剂量法(GPMT)开展实验，实验样品浸提后，通过皮内诱导阶段和局部诱导阶段来诱发致敏，并设置对照组，实验结果显示实验样品未引起皮肤致敏反应。通过皮内注射材料浸提液，对材料在实验条件下产生的刺激反应的潜能做出评定，实验浸提后，在每只新西兰兔脊柱处注射材料浸提液和对照液，观察各个注射点皮肤红斑和水肿的组织反应。实验结果表明，极性浸提液和极性溶剂对照液在皮内注射后均未出现阳性反应；非极性浸提液和非极性溶剂对照液在皮内注射后出现阳性反应，其最终记分符合要求，因此实验样品并不能引起皮内刺激反应。实验中采用KM小鼠进行全身毒性实验。实验样品浸提后注射到小鼠体内后，未观察到该实验样品浸提液导致动物死亡或全身毒性的任何征象，实验组和对照组动物体质量无明显异常，对所有动物进行大体解剖检查亦未见明显异常，充分表明样品未引起急性毒性反应。将样品浸提液通过耳缘静脉缓缓注入新西兰兔体内，观察其潜在的热源反应，实验结果表明，新西兰兔的体温升高均在合理范围内。将样品和对照品植入新西兰兔胫骨中，术后进行体质量测定、大体观察和局部组织病理学观察，结果表明新西兰兔体质量稳定增长，两组局部组织病理反应物明显差异，因此可判定样品无刺激。
综上所述，生物安全性实验结果显示，聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的细胞毒性、致敏反应、皮内刺激实验、全身急性毒性、热源实验和骨植入实验均符合医用生物材料的要求，证明其具有良好的生物相容性和生物安全性，具有一定的骨组织修复能力，这为复合微球材料制作骨组织支架方面的未来应用打下了基础。但由于实验只对掺杂了10%纳米羟基磷灰石的聚乳酸复合微球进行了生物安全性评价，因此还需要对高掺量纳米羟基磷灰石的聚乳酸复合微球生物安全性进行评价；另外，微球尺寸大小、纳米羟基磷灰石尺寸大小对复合微球生物安全性的影响还需进一步的评价与检测。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：

全身毒性：是指有毒物质进入机体后所产生的不良反应，不仅只局限于机体与材料和器械接触部位所产生的不良反应，而是机体全身所可能产生的不良反应。
生物安全性：是对于每种生物材料的重要评价指标之一，是生物材料在临床应用之前必须评价的重要指标，评价生物材料在生物体内共存状态下对生物体有无毒性、有无致敏、有无刺激、有无致癌等不良反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

聚乳酸是一种生物相容性良好、可降解的聚合高分子材料，具有优异的力学性能、可加工性。羟基磷灰石是脊椎动物牙齿和骨骼中最主要无机成分，具有优良的生物相容性和成骨活性，并且可与宿主骨组织形成良好的骨性结合，是优异的骨组织替代材料。通过微球技术复合聚乳酸和纳米羟基磷灰石，既保留羟基磷灰石的纳米生物特性，又保留了聚乳酸优异的力学性能，同时可缓解无菌性炎症的发生，促进细胞附着、增殖和新骨组织生长，得到具有优异的生物可降解性、力学性能和成骨活性的骨修复材料。材料表征显示，该微球呈现完整的球形态且是聚乳酸和纳米羟基磷灰石的复合物；聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球无细胞毒性、无致敏性、无皮内刺激反应、无全身急性毒，热原反应符合检测规定，骨植入结果良好，表明聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球具有良好的生物安全性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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