纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架的制备与表征

doi:10.12307/2023.459

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (25): 3956-3963.doi: 10.12307/2023.459

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纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架的制备与表征

李绍萍1，杨雨晴1，萧文云登1，尹璐璐2，刘溧博2，刘莹2，孙一凡2，陈志宇1

1河北医科大学口腔医学院·口腔医院修复科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北省石家庄市 050017；2河北医科大学口腔医学院，河北省石家庄市 050017

收稿日期:2022-06-15 接受日期:2022-07-18 出版日期:2023-09-08 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 陈志宇，博士，河北医科大学口腔医学院·口腔医院修复科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北省石家庄市 050017
作者简介:李绍萍，女，1996年生，汉族，河南省信阳市人，河北医科大学在读硕士，主要从事骨组织工程的研究。
基金资助:
河北省“三三三人才工程”资助项目(A202102010)，项目负责人：陈志宇；河北省政府资助临床医学优秀人才培养项目：(361029)，项目负责人：陈志宇

Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/aspirin/polyvinyl alcohol/gelatin/sodium alginate hydrogel scaffolds

Li Shaoping1, Yang Yuqing1, Xiao Wenyundeng1, Yin Lulu2, Liu Libo2, Liu Ying2, Sun Yifan2, Chen Zhiyu1

1Department of Prosthodontics, School of Stomatology · Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Hebei Provincial Key Laboratory of Stomatology, Hebei Provincial Clinical Research Center for Oral Diseases, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China; 2School of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China

Received:2022-06-15 Accepted:2022-07-18 Online:2023-09-08 Published:2023-01-17
Contact: Chen Zhiyu, PhD, Department of Prosthodontics, School of Stomatology · Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Hebei Provincial Key Laboratory of Stomatology, Hebei Provincial Clinical Research Center for Oral Diseases, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China
About author:Li Shaoping, Master candidate, Department of Prosthodontics, School of Stomatology · Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Hebei Provincial Key Laboratory of Stomatology, Hebei Provincial Clinical Research Center for Oral Diseases, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China
Supported by:
Hebei Provincial Talents Project, No. A202102010 (to CZY); Hebei Provincial Government Funded Clinical Medical Talents Training Project, No. 361029 (to CZY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

阿司匹林：是一种应用广泛、价格低廉、不良反应低的解热镇痛药，可显著提高冠心病患者的骨密度、调节骨质疏松患者的骨代谢。低浓度阿司匹林可促进成骨细胞的增殖与分化，降低破骨细胞活性，并可调节巨噬细胞炎症表型的极化。
纳米羟基磷灰石：是一种与自然骨无机矿物成分近似的无机材料，纳米羟基磷灰石释放的Ca2+和PO43-可调节成骨细胞的增殖、迁移和分化，在骨组织工程领域得到了广泛应用。

背景：阿司匹林是经典非类固醇抗炎药物，合适剂量的阿司匹林可调节免疫、促进成骨。制备出可缓释阿司匹林、调控骨缺损区免疫微环境和加速骨缺损修复的骨组织工程材料是目前的研究热点。
目的：制备可调控免疫微环境和加速骨缺损修复的新型水凝胶支架。
方法：制备含有质量分数0%，10%和20%纳米羟基磷灰石的纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架，对水凝胶支架的微观结构、孔隙率、化学成分、晶相结构、药物缓释性能、力学性能、溶胀性能和降解性能进行表征。通过细胞增殖和细胞毒性实验评价水凝胶支架的生物相容性。

结果与结论：①扫描电镜和孔隙率检测结果表明，0%，10%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架具有更仿生的层级多孔结构、孔隙通联性和孔隙率；②傅里叶红外光谱和X射线衍射结果表明，水凝胶支架内各原料以物理、化学双交联方式结合，且不会破坏纳米羟基磷灰石的晶相结构；③力学性能结果表明，10%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架具有最佳的压缩模量和压缩强度；④药物释放性能结果显示，随着纳米羟基磷灰石质量的增加，水凝胶支架的阿司匹林累计释放率降低，但是药物突释率降低、缓释时间延长；⑤溶胀性能和降解性能结果表明，随着纳米羟基磷灰石质量的增加，水凝胶支架的溶胀率和降解率下降；⑥采用水凝胶支架浸提液培养小鼠前成骨细胞，细胞增殖和细胞毒性实验结果表明，水凝胶支架浸提液可促进细胞增殖，无细胞毒性；⑦结果表明，10%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架具有更佳仿生的表征和生物相容性，有望作为骨组织工程支架进行成骨和调节免疫潜力的进一步研究。

https://orcid.org/0000-0001-9457-7154(李绍萍)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 双交联, 纳米羟基磷灰石, 水凝胶支架, 阿司匹林, 免疫, 缓释, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: Aspirin is a classic non-steroidal anti-inflammatory drug. Appropriate doses of aspirin can regulate immunity and promote osteogenesis. The preparation of bone tissue engineering materials, which can release aspirin, regulate the immune microenvironment of the bone defect area and accelerate the repair of the bone defect, and is a current research focus.
OBJECTIVE: To prepare a novel hydrogel scaffold that can modulate the immune microenvironment and quickly repair the bone defect area.
METHODS: Hydrogel scaffolds containing 0%, 10% and 20% of nano-hydroxyapatite/aspirin/polyvinyl alcohol/gelatin/sodium alginate were prepared. The microstructure, porosity, chemical composition, crystal structure, drug release properties, mechanical properties, swelling properties and degradation properties of the hydrogel scaffolds were characterized. The biocompatibility of the hydrogel scaffolds was evaluated by cell proliferation and cytotoxicity experiments.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscope and porosity results showed that hydrogel scaffolds in the 0% nano-hydroxyapatite group and 10% nano-hydroxyapatite group had better biomimetic hierarchical porous structure, pore connectivity, and porosity. (2) The results of Fourier transform infrared spectroscopy and X-ray diffraction showed that the raw materials in the hydrogel scaffold were combined by physical and chemical double cross-linking, and the crystal phase structure of nano-hydroxyapatite was not be destroyed. (3) The results of mechanical properties showed that the 10% nano-hydroxyapatite group had the best compressive modulus and compressive strength. (4) The results of drug release properties showed that the cumulative release rate of aspirin decreased with the increase of nano-hydroxyapatite, but the drug burst release rate decreased and the sustained release time prolonged. (5) The results of swelling properties and degradation properties showed that with the increase of nano-hydroxyapatite, the swelling rate and degradation rate of hydrogel scaffolds of each group decreased. (6) Using the hydrogel scaffold extract to culture mouse pre-osteoblasts, the results of cell proliferation and cytotoxicity experiments showed that the hydrogel scaffold extract could promote cell proliferation, without cytotoxicity. (7) It is concluded that 10% nano-hydroxyapatite hydrogel scaffolds have better bionic characterization and biocompatibility, and are expected to be used as bone tissue engineering scaffolds for further studies of osteogenesis and immunomodulatory potential.

Key words: double cross-linking, nano-hydroxyapatite, hydrogel scaffold, aspirin, immune, sustained-release, tissue engineering

中图分类号:

李绍萍, 杨雨晴, 萧文云登, 尹璐璐, 刘溧博, 刘莹, 孙一凡, 陈志宇. 纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架的制备与表征[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 3956-3963.

Li Shaoping, Yang Yuqing, Xiao Wenyundeng, Yin Lulu, Liu Libo, Liu Ying, Sun Yifan, Chen Zhiyu. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/aspirin/polyvinyl alcohol/gelatin/sodium alginate hydrogel scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 3956-3963.

图/表（结果） 11

2.1 各组水凝胶支架的宏观外形及微观结构各组水凝胶支架在室温下呈固态，0%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架呈透明色，10%，20%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架呈乳白色，见图1，表明纳米羟基磷灰石均匀混入和分散。各组水凝胶支架与制备过程中所用容器形状相符(以24孔板为例)，结果表明水凝胶支架具有形态可塑性和稳定性。

在低倍和高倍扫描电镜下观察到，各组水凝胶支架内部均具有大小各异的三维网状多孔结构。0%，10%，20%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架的孔径范围分别为70-220，70-170，20-280 μm。0%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架内部多孔分布均匀且相互通联，孔壁表面光滑；10%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架层级多孔结构明显且互相通联，高倍镜下可见孔壁上纳米羟基磷灰石附着，孔壁粗糙度和厚度增加；20%纳米羟基磷灰石组孔径大小差距进一步增大，出现纳米羟基磷灰石的团聚，内部结构稳定性和通连率减小，见图2。

2.2 各组水凝胶支架的孔隙率 0%，10%，20%纳米羟基磷灰石组的水凝胶支架的孔隙率分别为(53.84±0.83)%，(54.83±0.76)%，(59.10±0.40)%，0%纳米羟基磷灰石和10%纳米羟基磷灰石组支架孔隙率无明显差别(P > 0.05)，20%纳米羟基磷灰石组支架的孔隙率大于0%，10%纳米羟基磷灰石组(P < 0.05)，见图3。

2.3 水凝胶支架的傅里叶红外光谱分析明胶的特征吸收峰酰胺Ⅰ带(C=O的伸缩振动峰)、酰胺Ⅱ带(N-H的弯曲振动峰)、酰胺Ⅲ带(C-N的伸缩振动峰)分别位于1 627，1 521，1 234 cm-1。聚乙烯醇的特征吸收峰位于3 273，2 904，1 085 cm-1处，分别为O-H、C-O伸缩振动和C-H的伸缩振动峰。海藻酸钠位于1 751 cm-1处的特征吸收峰为C=O的伸缩振动峰，在1 600 cm-1处为COO-的反对称收缩峰、1 410 cm-1处为对称收缩峰。阿司匹林的特征吸收峰为O-H、C=O和C=C的伸缩振动峰，分别位于3 490，1 750，1 605 cm-1处。在0%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架的红外光谱中，O-H峰位移到3 277 cm-1处，宽度明显增加，1 627 cm-1处(酰胺Ⅰ带)的峰明显增宽，1 521 cm-1处(酰胺Ⅱ带)的峰蓝移至1 550 cm-1处以及阿司匹林、海藻酸钠在指纹区的微弱小峰在水凝胶支架中的消失证实了聚乙烯醇、明胶、海藻酸钠、阿司匹林之间相互作用并形成氢键[13，20]；海藻酸钠中C=O吸收峰从1 751 cm-1处移动至1 734 cm-1处变成微弱的小峰，证明了海藻酸钠与明胶之间强烈的静电引力[21-22]；海藻酸钠中COO-由1 400 cm-1移动至1 413 cm-1处，证明Ca2+与COO-化学交联形成蛋壳结构[23]，见图4。纳米羟基磷灰石的特征吸收峰为PO43-的伸缩振动峰，位于1 024 cm-1和965cm-1处，以及PO43-的变形振动峰，位于603，555 cm-1处，-OH伸缩振动峰为3 600 cm-1处、弯曲振动峰为633 cm-1处。水凝胶支架中加入纳米羟基磷灰石后，在603，555 cm-1处出现了纳米羟基磷灰石特征峰，965 cm-1处特征峰消失、1 024 cm-1处峰值红移至1 019 cm-1处且峰增宽这可能由于纳米羟基磷灰石中的PO43-(1 024 cm-1)与聚乙烯醇发生相互作用形成氢键[24]，见图4。因此聚乙烯醇、海藻酸钠、明胶、阿司匹林、纳米羟基磷灰石之间存在着物理和化学双交联的形式，但未出现成分的丢失，加入纳米羟基磷灰石可以使支架更加紧密、提高机械性能、持续缓慢释放药物，使支架能够适应和调节骨缺损修复的微环境。

2.4 各组水凝胶支架的X射线衍射分析纳米羟基磷灰石在2θ=25°，31.4°，32.1°，32.7°，39.4°，46.2°，53.1°和64.1°具有特征衍射峰，与纳米羟基磷灰石的标准卡片一致(JCPDS-09-0432)，0%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架未见纳米羟基磷灰石的特征衍射峰，而在10%，20%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架中出现纳米羟基磷灰石的特征峰，且位置接近纳米羟基磷灰石的标准卡片，见图5，这证明双交联方法不会破环纳米羟基磷灰石的晶相结构[25]。

2.5 各组水凝胶支架药物的缓释性能分析阿司匹林的线性回归方程为：y=0.003 14x+0.007 81，R2=0.999 9，表明阿司匹林在0-400 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，见图6。

体外释放曲线可见，各组水凝胶支架均可持续释放阿司匹林，最初48 h阿司匹林呈爆发性释放，之后释放曲线逐渐平缓；0%纳米羟基磷灰石持续释放药物150 h，累计释放率为(85.13±1.53)%，10%及20%纳米羟基磷灰石组持续缓慢释放300 h，累计释放率分别为(82.75±1.06)%和(78.72±0.67)%，各组之间累计释放率比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。结果表明水凝胶支架可装载、缓释药物，加入纳米羟基磷灰石显著可降低药物突释率，延长药物缓释时间。

2.6 各组水凝胶支架的力学性能分析如图8所示为各组水凝胶支架的力学性能比较，0%，10%及20%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架的压缩模量分别为(2.60±0.09)，(18.47±0.42)，(19.99±1.14) MPa，各组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；最大抗压强度分别为(0.92±0.03)，(2.56±0.03)，(2.30±0.07) MPa，各组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，20%纳米羟基磷灰石组的最大抗压强度低于10%纳米羟基磷灰石组。结果表明，加入适量纳米羟基磷灰石可以有效提升水凝胶支架的力学性能。

2.7 各组水凝胶支架的溶胀性能分析 0%，10%，20%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架在前4 h快速溶胀，4 h后溶胀曲线平缓，分别于4，10，16 h达到溶胀平衡，平衡溶胀率分别为(397.71±1.28)%，(349.18±6.34)%和(257.45±7.86)%，各组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9A。随着纳米羟基磷灰石质量分数的增高，溶胀率依次降低，但各组支架均具有良好的溶胀性能。
2.8 各组水凝胶支架的降解性能分析各组水凝胶支架的降解率随着时间延长，呈增加趋势，0%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架第21天的降解率为(82.33±0.77)%，第28天支架结构崩解，降解率为100%；加入纳米羟基磷灰石后水凝胶支架降解速率显著下降，10%，20%纳米羟基磷灰石组第28天的降解率分别为(41.04±0.03)%，(29.99±0.17)%，各组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9B。结果表明，水凝胶支架加入纳米羟基磷灰石可显著降低降解速率，并与骨组织再生速度相匹配。

2.9 各组水凝胶支架生物相容性分析
2.9.1 细胞增殖结果随培养时间延长，各组细胞均呈现增殖趋势，培养1，3，5 d时，0%，10%及20%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架浸提液培养的细胞吸光度值均高于对照组(P < 0.05)，见图10，表明水凝胶支架可促进细胞增殖。

2.9.2 细胞毒性检测结果培养1，3，5 d后倒置荧光显微镜下观察各组细胞，绿色荧光代表具有活力的细胞，红色荧光代表死亡的细胞，镜下各组细胞分布均匀，形态呈多角形，活细胞数目随着培养时间延长而增加，细胞形态无明显变化，见图11，这与细胞增殖实验结果相一致，死细胞数目虽也增加，但所占比例均小于1%，结果表明水凝胶支架无明显的细胞毒性。

参考文献

[1] ESPOSITO M, GRUSOVIN MG, WORTHINGTON HV, et al. Interventions for replacing missing teeth: bone augmentation techniques for dental implant treatment. Cochrane Database Syst Rev. 2006;25(1):CD003607.
[2] SCHMITZ JP, HOLLINGER JO. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clin Orthop Relat Res. 1986;(205):299-308.
[3] HEGDE R, PRASAD K, SHROFF K. Maxillary sinus augmentation using sinus membrane elevation without grafts - A Systematic Review. J Indian Prosthodont Soc. 2016;16(4):317-322.
[4] OGUNDIPE OK, GBOLAHAN OO. Immediate iliac bone graft reconstruction of post ablative defect of benign mandibular pathology - a systematic review. Plast Aesthet Res. 2017;4(8):137-143.
[5] ELAKKIYA S, RAMESH AS, PRABHU K. Systematic analysis on the efficacy of bone enhancement methods used for success in dental implants. J Indian Prosthodont Soc. 2017;17(3):219-225.
[6] MOUNIR M, MOUNIR S, ABOU-ELFETOUH A, et al. Assessment of vertical ridge augmentation in anterior aesthetic zone using onlay xenografts with titanium mesh versus the inlay bone grafting technique: A randomized clinical trial. Int J Oral Maxillofac Surg. 2017;46(11): 1458-1465.
[7] ELNAYEF B, MONJE A, GARGALLO-ALBIOL J, et al. Vertical Ridge Augmentation in the Atrophic Mandible: A Systematic Review and Meta-Analysis. Int J Oral Maxillofac Implants. 2017;32(2):291-312.
[8] 邢飞,吴岐佑,者漫,等.无机生物材料在骨修复中的骨免疫调节作用[J].中国修复重建外科杂志,2022,36(4):517-522.
[9] 娄静扬,耿欣荣,高慧萌,等.含铜钛合金调控巨噬细胞极化的研究进展[J].口腔疾病防治,2022,30(5):377-380.
[10] MA A, YOU Y, CHEN B, et al. Icariin/Aspirin Composite Coating on TiO2 Nanotubes Surface Induce Immunomodulatory Effect of Macrophage and Improve Osteoblast Activity. Coatings. 2020;10(4):427.
[11] FANG X, LEI L, JIANG T, et al. Injectable thermosensitive alginate/β-tricalcium phosphate/aspirin hydrogels for bone augmentation. J Biomed Mater Res Part B Appl Biomater. 2018;106(5):1739-1751.
[12] ZHANG Y, DING N, ZHANG T, et al. A Tetra-PEG Hydrogel Based Aspirin Sustained Release System Exerts Beneficial Effects on Periodontal Ligament Stem Cells Mediated Bone Regeneration. Front Chem. 2019; 7:682.
[13] ZHANG X, MIAO F, NIU L, et al. Berberine carried gelatin/sodium alginate hydrogels with antibacterial and EDTA-induced detachment performances. Int J Biol Macromol. 2021;181:1039-1046.
[14] KIM B, BAN E, KIM A. Gelatin-Alginate Coacervates Optimized by DOE to Improve Delivery of bFGF for Wound Healing. Pharmaceutics. 2021;13(12):2112.
[15] WANG X, LI S, YU H, et al. The Biocompatibility of Multi-Source Stem Cells and Gelatin-Carboxymethyl Chitosan-Sodium Alginate Hybrid Biomaterials. Tissue Eng Regen Med. 2022;19(3):491-503.
[16] AMR M, DYKES I, COUNTS M, et al. 3D printed, mechanically tunable, composite sodium alginate, gelatin and Gum Arabic (SA-GEL-GA) scaffolds. Bioprinting. 2021;22:e00133.
[17] CHARRON PN, JACOBS JI, YAO SX, et al. Effects of cryo-processing on the mechanical and biological properties of poly(vinyl alcohol)-gelatin theta-gels. Biointerphases. 2020;15(5): 051004.
[18] 徐冉,陈星羽,李志强.羟基磷灰石复合支架负载抗菌性药物：药物与支架的相互作用机制[J].中国组织工程研究,2022,26(27): 4411-4416.
[19] CHOCHOLATA P, KULDA V, DVORAKOVA J, et al. Biological Evaluation of Polyvinyl Alcohol Hydrogels Enriched by Hyaluronic Acid and Hydroxyapatite. Int J Mol Sci. 2020;21(16):5719.
[20] YANG L, YANG J, QIN X, et al. Ternary composite films with simultaneously enhanced strength and ductility: Effects of sodium alginate-gelatin weight ratio and graphene oxide content. Int J Biol Macromol. 2020;156:494-503.
[21] ANAMIZU M, TABATA Y. Design of injectable hydrogels of gelatin and alginate with ferric ions for cell transplantation. Acta Biomater. 2019; 100:184-190.
[22] 闫慧敏,杨光,杨波,等.明胶/海藻酸钠/沙蒿胶复合水凝胶的制备及表征[J].工业微生物,2022,52(1):24-33.
[23] YUAN L, WU Y, GU QS, et al. Injectable photo crosslinked enhanced double-network hydrogels from modified sodium alginate and gelatin. Int J Biol Macromol. 2017;96:569-577.
[24] GONZALEZ JS, ALVAREZ VA. Mechanical properties of polyvinylalcohol/hydroxyapatite cryogel as potential artificial cartilage. J Mech Behav Biomed Mater. 2014;34:47-56.
[25] XU M, QIN M, ZHANG X, et al. Porous PVA/SA/HA hydrogels fabricated by dual-crosslinking method for bone tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed. 2020;31(6):816-831.
[26] KOUSER R, VASHIST A, ZAFARYAB M, et al. Biocompatible and mechanically robust nanocomposite hydrogels for potential applications in tissue engineering. Mater Sci Eng C. 2018;84:168-179.
[27] GARNICA-PALAFOX IM, SANCHEZ-AREVALO FM, VELASQUILLO C,
et al. Mechanical and structural response of a hybrid hydrogel based on chitosan and poly(vinyl alcohol) cross-linked with epichlorohydrin for potential use in tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed. 2014; 25(1):32-50.
[28] 张杰,张元晶,丁玉琴,等.生物医用高分子材料研究热点[J].高分子材料科学与工程,2021,37(9):182-190.
[29] YOSHIKAWA T, NAKAJIMA H, UEMURA T, et al. In vitro bone formation induced by immunosuppressive agent tacrolimus hydrate (FK506). TISSUE Eng. 2005;11(3-4):609-617.
[30] PEREZ RA, MESTRES G. Role of pore size and morphology in musculo-skeletal tissue regeneration. Mater Sci Eng C. 2016;61:922-939.
[31] Vo TTN, Morgan S, McCormick C, et al. Modelling drug release from polymer-free coronary stents with microporous surfaces. Int J Pharm. 2018;544(2):392-401.
[32] MAGNUSSEN RA, GUILAK F, VAIL TP. Cartilage degeneration in post-collapse cases of osteonecrosis of the human femoral head: Altered mechanical properties in tension, compression, and shear. J Orthop Res. 2005;23(3):576-583.
[33] BOBBERT F, LIETAERT K, EFTEKHARI AA, et al. Additively manufactured metallic porous biomaterials based on minimal surfaces: A unique combination of topological, mechanical, and mass transport properties. Acta Biomater. 2017;53:572-584.
[34] 高泽,石志良,李锋,等.材料和孔隙率对可降解支架内骨形成的影响[J].医用生物力学,2021,36(4):582-588.
[35] MA P, WU W, WEI Y, et al. Biomimetic gelatin/chitosan/polyvinyl alcohol/nano-hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering. Mater Des. 2021;207:109865.
[36] 任泽宇,姜宏,石永芳.3D打印PLLA/HA复合组织工程骨支架及性能表征[J].燕山大学学报,2022,46(2):116-122.
[37] 杨怡天,王璐,姚蔚,等.生物支架与巨噬细胞在骨再生中的相互影响及应用[J].中国组织工程研究,2023,27(7):1071-1079.
[38] REEVES AR, SPILLER KL, FREYTES DO, et al. Controlled release of cytokines using silk-biomaterials for macrophage polarization. Biomaterials. 2015;73:272-283.
[39] LECH M, ANDERS H. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2013;1832(7): 989-997.
[40] LIU Y, FANG S, LI X, et al. Aspirin inhibits LPS-induced macrophage activation via the NF-κB pathway. Sci Rep. 2017;7(1):11549.
[41] ZHANG Y, DOU X, ZHANG L, et al. Facile fabrication of a biocompatible composite gel with sustained release of aspirin for bone regeneration. Bioact Mater. 2022;11:130-139.
[42] LI Y, LI Q, LI H, et al. An effective dual‐factor modified 3D‐printed PCL scaffold for bone defect repair. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2020;108(5):2167-2179.
[43] 陈甜甜,王聪,刘婉嫕,等.pH响应性纤维素纳米纤丝/海藻酸钠基水凝胶的制备及其释药性研究[J]. 中国造纸学报,2022,37(1): 16-21.
[44] ZHANG J, WANG Q, WANG A. In situ generation of sodium alginate/hydroxyapatite nanocomposite beads as drug-controlled release matrices. Acta Biomater. 2010;6(2):445-454.
[45] BAJPAI AK, SAINI R. Preparation and characterization of biocompatible spongy cryogels of poly(vinyl alcohol)-gelatin and study of water sorption behaviour. Polym Int. 2005;54(9):1233-1242.
[46] BÖLGEN N, PLIEVA F, GALAEV IY, et al. Cryogelation for preparation of novel biodegradable tissue-engineering scaffolds. J Biomater Sci Polym Ed. 2007;18(9):1165-1179.
[47] ZOU Z, WANG L, ZHOU Z, et al. Simultaneous incorporation of PTH(1–34) and nano-hydroxyapatite into Chitosan/Alginate Hydrogels for efficient bone regeneration. Bioact Mater. 2021;6(6):1839-1851.

引言

种植义齿成功的重要前提是具有充足且高质量的骨以形成骨结合[1]。临床常见因创伤、感染、肿瘤等原因造成大面积牙槽骨、颌骨缺损的情况[2]，影响种植义齿的修复效果，甚至导致种植修复无法施行[3]。自体骨移植、异体骨移植、人工骨粉填充等骨增量方法存在供体来源有限、疾病传播、机体免疫排斥、成骨能力有限和骨粉流失等问题[4-7]，影响最终骨增量效果。因此，研制一种能够高度仿生、调控免疫环境、高效修复骨缺损的骨组织工程材料具有重要的临床意义。
成骨细胞功能、炎症微环境、机体免疫反应影响骨再生速度和质量[8]，巨噬细胞在骨愈合的炎症期和修复期发挥关键作用[9]。阿司匹林可解热、镇痛、抗炎，且已有细胞和动物研究表明载有阿司匹林的种植体可诱导巨噬细胞发挥免疫调节功能，形成有利于骨形成的免疫微环境[10]。低浓度阿司匹林可增强人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性，以及成骨相关基因的表达[11]。但修复颌骨、牙槽骨缺损时口服阿司匹林会产生系统不良反应，定时局部注射给药可行性差，有研究证明水凝胶支架可作为阿司匹林等药物的载体[12]，持续缓释并维持局部有效药物浓度。
单一材料制备的支架具有骨组织仿生局限性，多种材料进行混合并交联可提高支架的仿生效果和成骨性能。海藻酸钠和明胶是天然有机高分子化合物，具有热敏性、吸水性和细胞相容性[13-15]，还可递送药物和生长因子，但存在降解速率太快、机械性能与骨组织不匹配等缺点[16]。聚乙烯醇是人工合成的有机高分子化合物，虽细胞亲和力较低，但其具有稳定的化学性质、优异的水溶性和机械性，有学者通过循环冻融的方法制备了具有优异弹性和生物相容性的聚乙烯醇/明胶软组织工程支架[17]。
纳米羟基磷灰石可负载药物[18]，调节成骨细胞的增殖、迁移和分化，是具有优异成骨潜能的无机骨修复材料，但单独使用的纳米羟基磷灰石脆性大[19]、可塑性差，且存在团聚等缺点，因此需要与有机材料混合使用进行优势互补，提高水凝胶支架的仿生效果，从而获得更加理想的成骨潜能。
目前尚无研究采用聚乙烯醇、明胶、海藻酸钠负载阿司匹林和纳米羟基磷灰石，且能够同时调控骨组织免疫微环境并快速修复骨缺损的水凝胶支架。该实验采用物理、化学双交联的方法制备含有不同质量分数(0%，10%，20%)纳米羟基磷灰石的载药水凝胶支架，并评价水凝胶支架的微观结构、化学成分、晶相结构、力学、药物缓释、溶胀和降解性能以及生物相容性，以期为开发修复牙槽骨及颌骨缺损提供一种制作简便、仿生性高、兼备调控免疫微环境和加速骨缺损修复的新型骨组织工程材料提供科学依据，为后续实验及临床转化奠定基础，从而提高种植义齿修复适应证和成功率。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料和体外细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年2-6月在河北医科大学口腔医院、河北省口腔医学重点实验室完成。
1.3 材料聚乙烯醇(广东光华科技股份有限公司，中国)；阿司匹林、明胶、海藻酸钠、无水氯化钙(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)；纳米羟基磷灰石(南京埃普瑞纳米材料有限公司，中国)；PBS、青链霉素混合液(100×)、CCK-8试剂盒、活/死细胞染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，中国)；胎牛血清、ɑ-MEM培养基(Biological Industries，以色列)；HWCL-5集热式恒温磁力搅拌浴(郑州长城科工贸有限公司，中国)；FD-1A-50冷冻干燥机(博医康仪器有限公司，中国)；IS 50全反射傅里叶红外光谱仪(Thermo，美国)；TU-1950 双光束紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司，中国)；Bruker D8 X射线衍射仪(Advance，德国)；RGM-2100电子万能力学试验机(广州瑞格尔有限公司，中国)；GLSAQUA 12PLUS恒温水浴摇床(Grant，英国)；S-4800扫描电子显微镜(日立高新技术公司，日本)；NU-543-500S超净台(NUAIR，美国)；SpectraMax M2酶标仪(Molecular Devices，美国)；小鼠前成骨细胞MC3T3-E1(武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 水凝胶支架的制备 ①称取2.0 g聚乙烯醇，倒入加热至95 ℃的50 mL超纯水中，磁力搅拌器下搅拌2 h，直至聚乙烯醇完全溶解，静置，待溶液冷却至37 ℃，称取2 g海藻酸钠加入聚乙烯醇溶液中，磁力搅拌器下不断搅拌2 h；②称取200 μg阿司匹林、4 g明胶加入30 mL超纯水中，37 ℃下磁力搅拌器不断搅拌2 h；③称取0，10，20 g的纳米羟基磷灰石，分别加入20 mL超纯水中，室温下不断搅拌2 h，超声2 h除泡并将纳米羟基磷灰石充分震碎；④分别将①②所得溶液混合；①②③所得溶液混合在一起，制得含有不同质量分数纳米羟基磷灰石的水凝胶支架溶液，倒入模具-20 ℃中放置18 h，常温下放置4 h，循环冻融3次；⑤将水凝胶支架浸泡于2%无水氯化钙溶液中24 h，超纯水冲洗支架3遍，除去表面残留溶液，冷冻干燥72 h后，所有支架用25 kGy 60Co辐射灭菌。将质量分数为0%，10%，20%的纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架分别命名为0%纳米羟基磷灰石组、10%纳米羟基磷灰石组、20%纳米羟基磷灰石组，真空包装，于室温下储存备用。
1.4.2 扫描电镜观察将制备好的水凝胶支架在液氮环境下淬断，固定并喷金，在电压为15 kV的扫描电镜下观察其纵剖面的微观形貌。
1.4.3 孔隙率测试将水凝胶支架浸没于体积V1的无水乙醇中，静置48 h；当水凝胶支架完全浸透无水乙醇且表面无气泡时，记录体积V2；将水凝胶支架取出，记录剩余无水乙醇体积 V3，孔隙率的计算公式为：孔隙率=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。
1.4.4 傅里叶红外光谱测试将水凝胶支架磨碎，加入溴化钾研磨，混合均匀后压片，在4 cm-1的分辨率，4 000-400 cm-1的范围内扫描32次，得出水凝胶支架的傅里叶红外光谱图，分析内部化学结构。
1.4.5 X射线衍射测试将水凝胶支架按1.4.4的方法压片，在10°-80°的扫描角度、2 (°)/min的速度下扫描，得出X射线衍射图，对水凝胶支架进行物相分析。
1.4.6 药物释放性能测试将20 mg阿司匹林溶解在100 mL PBS中，用紫外分光光度机在200-400 nm波长范围内进行扫描，检测出阿司匹林在274 nm处具有最大吸收光度值，作为测定波长。精密称取4 mg阿司匹林溶于10 mL PBS中，进行梯度稀释，制作浓度标准液，采用紫外分光光度计测量0，12.5，25，50，100，200，400 μg/mL阿司匹林的吸光度值，绘制阿司匹林的标准曲线，并计算出回归方程。
将体积为3 mL的水凝胶支架浸泡在10 mL PBS中，在37 ℃条件下置于摇床中，以75 r/min的速率持续振荡，分别于相应时间点吸出3 mL液体，离心后取上清液，测量其吸光度，并补充新鲜PBS至10 mL，计算出阿司匹林的累计释放率。
1.4.7 力学性能测试在室温和相对湿度52%的条件下，将直径8 mm、高度10 mm的水凝胶支架放置于万能力学试验机平台上，以5 mm/min的速度沿水凝胶支架长轴进行压缩，压缩至形变100%时停止并得到最大压缩强度和压缩模量。
1.4.8 溶胀性能测试取直径15 mm、高度2 mm的水凝胶支架，称质量(m0)；浸泡在3 mL PBS中，放置于37 ℃恒温水浴锅中，在不同时间点将支架取出，滤纸吸去表面水分，再次称质量(m1)，直至水凝胶支架达到溶胀平衡。溶胀率=(m1-m0)/m0×100%。
1.4.9 降解性能测试取直径为8 mm、高度为10 mm的水凝胶支架，称质量(m0)；放入4 mL PBS中，置入37 ℃恒温摇床内以75 r/min振荡，每2 d更换PBS；在相应时间点将水凝胶支架取出，冷冻干燥后称质量(m1)。降解率=(m0-m1)/m0×100%。
1.4.10 生物相容性测试将水凝胶支架在25 kGy 60Co下辐照灭菌，按照10 mg/mL将水凝胶支架浸泡在完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的ɑ-MEM培养基)中，在37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中浸提24 h，用0.22 μm的过滤器进行过滤除菌，制得各组水凝胶支架的浸提液，并以完全培养基作为对照组。
水凝胶支架浸提液对细胞增殖的影响：将MC3T3-E1细胞以3 000个/孔的密度接种于96孔板，培养箱中培养24 h后弃去原培养液，用PBS清洗1次，分别加入完全培养基(对照组)和各组水凝胶支架浸提液各100 μL，继续培养。于1，3，5 d取出相应培养板，弃去原培养基和浸提液，向每孔中加入100 μL完全培养基和10 μL CCK-8试剂液，细胞培养箱中避光孵育1 h，采用酶标仪在波长450 nm条件下读取吸光度值(A)。
水凝胶支架浸提液对细胞的毒性检测：按上述实验方法培养细胞，于1，3，5 d取出相应培养板，弃去原培养基和浸提液，向每孔中加入100 μL活/死细胞染色试剂，于细胞培养箱中避光反应30 min，荧光激发下钙黄绿素(AM)将细胞染成绿色，碘化丙啶(PI)将细胞染成红色，倒置荧光显微镜下观察并拍照，并分析水凝胶支架的毒性。
1.5 主要观察指标各组水凝胶支架的宏观和微观结构、孔隙率、化学成分、药物缓释、力学、溶胀、降解性能，以及对MC3T3-E1细胞的生物相容性。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行分析。以x±s表示数据，采用单因素方差分析进行组间比较，认为P < 0.05时差异有显著性意义。采用Origin 2021、Image-Pro Plus进行绘图。该文统计学方法已经河北医科大学统计学专家审核。

讨论

材料的选择在支架仿生效果中占据主导地位，理想的骨组织工程支架具有与骨组织匹配的机械性能、降解速率和亲水性，提供成骨细胞和骨组织长入的空间，能模拟细胞外基质，促进细胞黏附、增殖[26-27]，还能调控骨再生的免疫微环境[28]，加速骨缺损的修复。此次实验通过物理、化学双交联方法制备了具有调控免疫微环境、促进成骨潜力的纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架，并比较了不同质量分数纳米羟基磷灰石对水凝胶支架的表征和生物相容性能的影响。有研究表明支架孔径大于50 μm可增强骨传导性，100-500 μm是最适合骨组织形成的孔径[29]，孔隙率大于50%利于骨组织生长[30]。扫描电镜和孔隙率的测试结果显示，此种双交联的制备方法成功制备出具有层级多孔结构的负载阿司匹林和纳米羟基磷灰石的水凝胶支架，此结构利于药物的负载和缓释，类似于天然细胞外基质，为成骨细胞附着和骨组织的长入提供空间[31]。加入10%质量分数纳米羟基磷灰石可增加水凝胶支架内部稳定性、保持支架内合适孔径大小和孔隙通连率。骨组织支架材料力学性能影响骨组织生长速度和质量，力学测试结果显示，10%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架的力学性能最佳，最大压缩强度为(2.56±0.03) MPa，满足松质骨2-12 MPa的基本力学强度要求[32]，压缩模量(18.47±0.42) MPa也在松质骨10-2 000 MPa的范围内[33]，在达到支撑作用的同时，也可随着骨组织再生而发生应力变化加速骨形成[34]。
傅里叶红外光谱结果表明，水凝胶支架各材料以物理、化学双交联方式混合使得各材料均匀紧密结合。各材料分子间在循环冻融过程中以氢键相互作用[25，35]，明胶与海藻酸钠之间具有强烈的静电引力，海藻酸钠与Ca2+形成蛋壳结构[25]，从而构成了水凝胶支架内部层级多孔结构。阿司匹林苯环与其他成分通过氢键结合，还可使药物缓释时间延长。X射线衍射结果表明，双交联方式不破环纳米羟基磷灰石的晶相结构，但由于纳米羟基磷灰石的高表面能，过多纳米羟基磷灰石的加入可能出现纳米羟基磷灰石的团聚现象，且无机物过多可能会阻碍水凝胶支架内有机物的结合、连续相的减少进而导致支架内部断裂[36]，因此20%纳米羟基磷灰石组水凝胶支架孔隙率、微观结构和力学性能与预期结果不符。
骨组织工程支架作为外来植入物，植入体内会引发宿主免疫反应，形成免疫微环境[36]。植入体植入后，骨缺损区的巨噬细胞和成骨细胞发挥关键作用[37]，巨噬细胞M1表型和M2表型分别发挥促炎和抗炎作用[38-39]，成骨细胞的增殖分化功能决定骨缺损修复的速度和质量。研究表明，在0.1-10 mmol/L浓度范围内的阿司匹林拥有优异的抗炎、免疫调节和成骨能力。阿司匹林可抑制炎症早期脂多糖诱导的炎性巨噬细胞M1表型的分化，下调诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子ɑ的表达[40]，促进体内骨再生。ZHANG等[41]发现缓释阿司匹林的壳聚糖/共价四臂聚乙二醇水凝胶可促进单核细胞表达趋化蛋白1，并上调巨噬细胞募集和M2表型的原位极化，从而促进新骨再生。有研究证实支架内缓释阿司匹林的脂质体和生长因子可发挥协同作用，提高细胞的成骨分化效率，刺激骨诱导过程，加速骨形成[42]。此次实验成功制备出含有200 μg/mL阿司匹林的双交联阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架。相比于陈甜甜等[43]制备的海藻酸钠载药水凝胶，此次实验在水凝胶支架内引入能有效结合药物分子的纳米羟基磷灰石[44]，结果表明纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架的药物缓释时间延长，释放曲线更加平缓，这使支架在骨缺损植入区内发挥持续的免疫调节和促成骨功能。
水凝胶支架的稳定性、输送营养物质的能力、药物缓释时间等物理特性，促进细胞附着、代谢和新骨再生等生物学特性受溶胀和降解性能的影响。此次实验采用亲水性能优异的聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架作为装载阿司匹林的载体，明胶形态具有可逆性，促进支架内部形成多孔网络，从而使支架具有良好的亲水性[45]。而加入亲水性小的无机纳米羟基磷灰石粒子后，原材料与纳米羟基磷灰石相互结合，水凝胶支架内部的孔径减小，内部结构更加紧密，孔壁厚度增加，水分子自由通过的空间变小，能够结合的水减少，平衡溶胀率和降解率随之降低[25，46]。一方面，适量纳米羟基磷灰石的加入保留了支架良好的吸水性能，而合适的溶胀性能可增加水凝胶支架与骨缺损修复区域形态和体积的匹配性；另一方面，临床工作中通常在种植义齿骨增量术后3个月评价新骨质量和骨结合强度，此次实验制备的水凝胶支架前7 d的降解速率较高，但加入纳米羟基磷灰石的水凝胶支架在7 d后降解速率平缓均匀，且28 d降解速率与骨组织再生速度相匹配[47]；最初7 d支架的降解速率可促进阿司匹林的释放，维持骨缺损区域有效药物浓度，从而起到调控早期骨缺损修复区域免疫微环境，招募成骨细胞聚集，加速修复骨缺损的作用。
优异的生物相容性是骨组织工程支架修复骨缺损的前提，细胞增殖和细胞毒性结果表明各组水凝胶支架浸提液无明显毒性，具有优异的生物相容性，并促进MC3T3-E1细胞的伸展和增殖。此次实验初步分析表明，10%纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架满足骨组织工程仿生表征和生物相容性的基本要求，下一步将对水凝胶支架对免疫调节的能力和成骨潜能进行深入研究，进而为加速骨缺损修复，提高新骨质量和临床转化提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

纳米羟基磷灰石/阿司匹林/聚乙烯醇/明胶/海藻酸钠水凝胶支架的制备与表征

Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/aspirin/polyvinyl alcohol/gelatin/sodium alginate hydrogel scaffolds

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[1]	孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[2]	高煜, 韩佳慧, 葛新. 脊髓缺血再灌注损伤后的免疫炎性微环境[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1300-1305.
[3]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[4]	袁虎成, 丁永国, 马雪花, 马文鑫, 孙建民, 王自立, 金卫东. 载抗结核药吡嗪酰胺、卷曲霉素、莫西沙星及阿米卡星骨水泥的体外缓释性能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1017-1022.
[5]	徐星星, 文超举, 孟茂花, 王勤英, 陈镜桥, 董强. 口腔种植中的碳纳米材料[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1062-1070.
[6]	杨怡天, 王璐, 姚蔚, 赵彬. 生物支架与巨噬细胞在骨再生中的相互影响及应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1071-1079.
[7]	李诚, 郑国爽, 蒯贤东, 于炜婷. 海藻酸盐支架修复关节软骨[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1080-1088.
[8]	史业弘, 王成, 陈世玖. 小口径人工血管的早期血栓形成与预防[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1110-1116.
[9]	唐昊天, 廖荣东, 田京. 压电材料修复骨缺损的应用及设计思路[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1117-1125.
[10]	许言, 李平, 赖春花, 朱培君, 杨烁, 徐淑兰. 血管化骨再生中压电生物材料的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1126-1132.
[11]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[12]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
[13]	张岐剑, 徐希明. 外胚层间充质干细胞的获取及应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 928-934.
[14]	袁博, 谢利德, 付秀美. 许旺细胞源性外泌体促进损伤周围神经的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 935-940.
[15]	秦宇星, 任前贵, 李子龙, 全嘉星, 沈佩锋, 孙韬, 王浩宇. 骨微血管内皮细胞在股骨头坏死中的作用机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 955-961.