镁基合金支架负载兔源性骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨复合支架

doi:10.12307/2023.726

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨髓间充质干细胞：具有多向分化潜能，可向成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞及神经细胞等方向分化，植入机体内的骨髓间充质干细胞可促进血管再生和成骨，进一步促进骨再生过程中新生组织生长。骨髓间充质干细胞来源充足，体外易分离、获取，并且具有一定可塑性和自我更新能力，是组织工程的理想种子细胞。
镁基合金支架：镁合金具有优良的机械性能、良好的生物相容性及可降解性能，在医学和材料学领域均得到广泛关注与研究。表面改性或合金化技术为优化镁合金特性提供了新的手段。镁-锌-钙合金支架具备良好的力学性能，同时又具备一定抗菌性能，是理想的无机仿生植入物。

背景：随着组织工程学的深入研究与快速发展，组织工程支架为骨组织修复提供了新的契机。
目的：探讨骨髓间充质干细胞与镁基合金支架共培养后的细胞增殖情况，为组织工程化骨支架构建提供新思路，进而为组织工程支架临床应用提供依据。
方法：无菌条件下抽取兔骨髓液，使用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，进行流式细胞学鉴定和成骨分化能力检测。将第3代骨髓间充质干细胞分别接种于镁基合金支架和壳聚糖-聚已内酯-磷酸三钙支架，第3，10天进行激光共聚焦扫描观察细胞生长情况，第1，4，7，10，14天行MTT检测细胞增殖情况。

结果与结论：①分离培养的细胞高表达CD44和CD90，几乎不表达CD34；②经成骨诱导后，细胞形态逐渐变为多角形，Von Kossa染色可见细胞之间钙结节染成黑色，碱性磷酸酶活性较未诱导对照组升高(P < 0.05)；③镁基合金与骨髓间充质干细胞共培养后，共聚焦显微镜扫描显示细胞可在支架上黏附并呈团块状生长，随着时间延长，镁基合金支架较壳聚糖-聚已内酯-磷酸三钙支架上负载的细胞增殖活跃，细胞数量明显增多，MTT检测显示两种材料与骨髓间充质干细胞共培养至10 d时，细胞生长达峰值；④结果表明，兔源性骨髓间充质干细胞具有良好的成骨潜能，与镁基合金支架共培养后，细胞在支架表面生长良好，成功构建了组织工程化镁基种植体。

https://orcid.org/0000-0002-8513-7158 (周悦彬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 镁基合金, 组织工程化骨, 细胞增殖, 支架, 共培养

Abstract: BACKGROUND: With the in-depth research and rapid development of tissue engineering, tissue-engineered scaffolds provide a new opportunity for bone tissue repair.
OBJECTIVE: To explore the cell proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells after co-culture with the magnesium-based alloy scaffolds, to provide a new idea for the construction of tissue-engineered bone scaffolds and provide a basis for the clinical application of tissue-engineered scaffolds.
METHODS: The bone marrow fluid of rabbits was extracted under sterile conditions. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured and isolated by the whole bone marrow adherent method. Bone marrow mesenchymal stem cells were identified by flow cytometry and osteogenic differentiation ability was tested. Bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were seeded on magnesium-based alloy scaffolds and chitosan polycaprolactone tricalcium phosphate scaffolds respectively. The cell growth was observed by laser confocal scanning on days 3 and 10, and cell proliferation was detected using an MTT assay on days 1, 4, 7, 10 and 14, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The cultured cells highly expressed CD44 and CD90, but hardly CD34. (2) The morphology gradually changed to polygonal after osteogenesis induction. Von Kossa staining showed that the calcium nodules between the cells were stained black, and the alkaline phosphatase activity was significantly higher than that of the control group (P < 0.05). (3) After co-culture of magnesium-based alloy and bone marrow mesenchymal stem cells, confocal scanning showed that the cells could adhere to the scaffold and grow in clusters. With the extension of time, the magnesium-based alloy scaffold was more active in proliferation than the seed cells loaded on the chitosan polycaprolactone tricalcium phosphate scaffold, and the number of cells was significantly increased. MTT assay showed that when the two materials were co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells for 10 days, the cell growth reached its peak. (4) These results indicate that rabbit-derived bone marrow mesenchymal stem cells have a good osteogenic potential. After co-cultured with magnesium-based alloy scaffolds, the cells adhered and grew well on the surface of the scaffolds, indicating that the tissue-engineered magnesium-based implants were successfully constructed.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, magnesium-based alloy, tissue-engineered bone, cell proliferation, scaffold, coculture

中图分类号:

周悦彬, 郭洪刚. 镁基合金支架负载兔源性骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5491-5496.

Zhou Yuebin, Guo Honggang. Construction of tissue-engineered bone composite scaffolds by loading rabbit-derived bone marrow mesenchymal stem cells on magnesium-based alloy scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(34): 5491-5496.

图/表（结果） 9

2.1 骨髓间充质干细胞生长趋势及流式细胞鉴定结果原代及传代培养细胞形态学见图1。第3代骨髓间充质干细胞生长曲线呈典型的倒S形。传代1-3 d为生长滞缓期，第3天起细胞大量增殖，第7天达到增长峰值，此后增殖缓慢进入平台期。第5代细胞增殖能力比第3代差，生长曲线同第3代骨髓间充质干细胞，见图2。

流式细胞测定显示CD34抗体阳性细胞占细胞总数的0.045%，而CD90抗体阳性细胞占细胞总数的94.5%，CD44抗体阳性细胞占细胞总数的97.9%，见图3。

2.2 骨髓间充质干细胞成骨诱导能力经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞形态发生明显变化，逐渐由长梭形变为三角形、多角形等成骨细胞样形态。倒置相差显微镜下观察：成骨诱导后第3天，部分细胞形态由长梭形逐渐变为多角形，体积增大，随诱导时间延长，多角形细胞比例增高。经成骨诱导后，Von Kossa染色可见钙化结节，见图4。成骨诱导组细胞碱性磷酸酶吸光度值为4.277±0.402，非诱导细胞组细胞碱性磷酸酶吸光度值为1.900±0.428，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.3 两种支架大体形貌及理化性征
2.3.1 镁基合金支架大体形貌及理化性征镁基合金支架成分为镁、锌、钙按(96.8∶3∶0.2)分子质量分数比混合而成，统一为高8 mm，直径1.8 mm，具体形貌为具备微槽的棒状金属物，微槽间距排列规整，结构致密，见图6。镁基合金支架力学性能测试以弹性模量、抗拉强度以及延伸率为检测指标，弹性模量为45 GPa，接近骨弹性模量值，抗拉强度为336 MPa，延伸率为17.85%。

2.3.2 聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架大体形貌及理化性征聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架为课题组前期实验所制备[14-15]，其中聚已内酯与磷酸三钙质量比为2∶4，直径为10 mm，高为12 mm，为表面粗糙的圆柱状物，其弹性模量为8.0 MPa，见图7。

2.4 骨髓间充质干细胞与镁基合金支架共培养后激光共聚焦显微镜观察结果骨髓间充质干细胞与镁基合金支架共培养第3天时，细胞数量与聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架相差无几，细胞黏附可，排列不规整，细胞骨架清晰，而在培养至第10天时，镁基合金支架上细胞数量明显高于聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架，镁基合金支架上细胞呈三维性生长，细胞骨架清晰，细胞核深染，排列较第3天时规整，见图8。

2.5 骨髓间充质干细胞与支架共培养后细胞增殖活性在培养第1，4，7，10，14天MTT法检测细胞在490 nm处吸光度值，结果显示镁基合金支架与聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架在培养起始细胞增殖活性相差无几；随培养时间延长，镁基合金组较聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙组细胞增殖活性高(P < 0.05)，培养至第10天左右，细胞增殖达高峰，见图9。

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引言

组织工程是一个新兴的多学科交叉领域，涉及生物人工植入物开发、组织重塑、修复或增强组织器官功能[1]。生物人工构建体一般由细胞和生物材料组成，因此组织工程是主要涉及细胞和生物材料的学科。组织工程植入物的核心功能元件是活的功能细胞。骨髓间充质干细胞来源充足、黏附性强，并且取材方便，体外培养时易分离、获取，具有一定可塑性及多向分化潜能[2-3]。自体骨髓间充质干细胞具有强大的再生和免疫应答调节功能[4]，更适合作为移植物移植。
近年来，随着骨诱导性无机仿生支架材料的不断优化，部分金属材料也在组织工程领域崭露头角。镁是骨骼的重要微量元素，也是人体中第4丰富的阳离子，它具有较高的生物相容性，使其成为植入物的最佳选择之一[5-6]。镁是生物活性元素，过量的镁可以随尿液或粪便排出，目前尚无关于镁离子毒副作用的报道[7]。镁的生物力学性能与骨骼相似，具备生物降解性，并且其降解产物可促进骨的愈合。然而纯镁存在力学强度不足、降解速度过快等问题[8]，难以直接取代传统医用金属材料，特别是用于受力部位的植入材料。近年研究表明合金化技术可改善镁及其合金的力学性能，这一技术的应用使得镁合金在医用材料领域广泛推展开来。在种植体-骨界面整合过程中，内植物的性能起着重要作用。对于骨科内植物而言，承受物理负荷的是内植物基体，但与骨组织直接接触的界面同样重要[9]。镁-锌-钙(Mg-Zn-Ca)合金由于其生物相容性、生物降解性和与人骨相似的力学性能，在生物医学植入物应用特别是骨修复方面受到越来越多的关注[10]。镁-锌-钙合金降解产生的离子和弱碱性环境可促进成骨相关细胞增殖及分化，进而促进新骨形成[11]。ZHANG等[12]使用镁-锌-钙合金修复小鼠股骨骨缺损，发现其能促进成骨和骨愈合，同时证明镁-锌-钙在促进骨修复的同时具有抗菌活性。
该研究旨在探讨与镁基合金支架共培养后骨髓间充质干细胞的增殖情况，验证组织工程学模式构筑新型组织工程支架的可行性，进而为组织工程支架临床应用提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照，细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2017年8月至2018年8月在中国医学科学院血液病研究所实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂和仪器聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙(CS-PCL-TCP)支架为天津大学化工学院通过熔融沉积成型技术制备[13-15]。α-MEM培养基(BI公司)；胰蛋白酶-EDTA混合液(北京雷根生物科技有限公司)；CCK-8(南京恩晶生物科技有限公司)；CD90、CD44单克隆抗体(Thermo Scientific)；大鼠CD34抗兔抗体(Thermo Scientific)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；DAPI(Thermo Scientific)；罗丹明-鬼笔环肽(Thermo Scientific)；二甲基亚砜(北京索莱宝科技有限公司)；共聚焦显微镜(Olympus)。纯度为99.95%的镁粉(中国有色金属工业华北供销公司)、99.99%锌粉(天津市华北实验仪器有限公司)及99.8钙粉(天津市华北实验仪器有限公司)。
1.3.2 实验动物骨髓液取自4只新西兰大白兔，雌雄不限，体质量1.5-2.0 kg，由天津医科大学实验动物中心提供。实验动物机构许可证号：SYXK(津)2017-0032。实验方案经过天津医科大学总医院伦理委员会批准，批准号为2017-0035。
1.4 实验方法
1.4.1 兔骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定
(1)骨髓间充质干细胞的分离纯化及培养：严格无菌条件下取兔骨髓血5 mL，在超净台上将无菌抽取的骨髓血移入离心管中，加入等体积无菌PBS，1 200 r/min离心6 min，弃去上清液，用10 mL PBS重复洗涤离心1次，加入少量α-MEM完全培养基重悬，将细胞悬液接种至25 cm2培养瓶置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，48 h后首次全量换液，除去未贴壁细胞，以后每隔3 d更换1次培养基，待细胞融合达80%-90%时，消化传代。
(2)骨髓间充质干细胞生长趋势测定：将培养至第3代的骨髓间充质干细胞消化离心后，取10 μL细胞悬液(约含5×103个细胞)接种至96孔板，96孔板四角不接种细胞，只加入α-MEM完全培养基，以免培养基挥发。接种完毕后，每孔加入100 μL α-MEM完全培养基，置于培养箱中培养，分别于培养后第1，3，5，7，9天，各取10孔，避光条件下每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱内孵育两三个小时，酶标仪测定450 nm处吸光度值。
(3)流式细胞学鉴定：取培养至第3代的骨髓间充质干细胞，消化离心后加入400 μL PBS重悬，各取100 μL细胞悬液移入流式管中，编号设置阴性对照组和实验组，避光条件下实验组分别加入CD34、CD90、CD44抗体5 μL，振荡器混匀后避光孵育30 min，各流式管中分别加入3 mL PBS，1 200 r/min离心8 min，弃去上清液，再分别加入300 μL PBS，避光条件下上机进行检测。

1.4.2 骨髓间充质干细胞成骨诱导将培养至第3代的骨髓间充质干细胞消化、离心后，取20 μL细胞悬液约5×104 个细胞接种至6孔板中，加入α-MEM完全培养基混匀后置于培养箱中培养，观察细胞贴壁后，更换为成骨诱导液，轻轻摇匀后置于细胞培养箱中培养，每3 d换液1次，共培养21 d。

碱性磷酸酶测定：诱导21 d后，取成骨诱导组细胞及非诱导组细胞培养液1 mL，按ELISA碱性磷酸酶试剂盒步骤进行操作，酶标仪测定450 nm波长下的吸光度值，重复5组，取其平均值，依此定量分析细胞内碱性磷酸酶水平。
Von Kossa 染色：取成骨诱导21 d细胞，PBS冲洗2遍，加入体积分数为4%甲醛固定液固定30 min，弃去固定液，PBS冲洗2遍，加入预先配好的染液，紫外线灯下照射2 h，PBS冲洗2遍后置于倒置显微镜下观察。
1.4.3 镁基合金支架制备及力学性能检测将镁、锌、钙粉末按其分子质量称重，再次研碎后低温烘干，过200目滤网后充分混合，将一定配比的合金粉末加入到行星式球磨机中进行球磨混料，再次过筛后冷压成型，将冷压成型后的合金试样进行真空烧结。按照上述设计由天津理工大学材料学院制备镁基合金支架，钴60照射消毒后备用。利用MTS858Bionix材料实验机进行支架生物力学测试，得出其弹性模量、抗拉强度及延伸率。
1.4.4 骨髓间充质干细胞与支架体外共培养镁基合金支架经PBS冲洗3次，于α-MEM完全培养基中浸泡，置于细胞培养箱中过夜，然后取出置于24孔板中，沥干后置于培养箱中备用。将第3代骨髓间充质干细胞消化、离心后，以1×1010 L-1细胞浓度分别接种于镁基合金和聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架上，每孔10 μL，将接种了细胞的支架材料置于细胞培养箱中培养4-6 h，使大部分细胞能够在支架上黏附，取出24孔板沿边缘滴加α-MEM完全培养基使得液体能够刚刚淹没材料表面为宜，及时补充培养基使培养基始终能够覆盖材料表面。
1.4.5 MTT法检测细胞增殖活性培养1，4，7，10，14 d各取出部分细胞复合支架材料，弃去培养基，移入24孔板，滴加MTT液2 mL，培养箱中培养3 h，取出后每孔加入二甲基亚砜2 mL，10 min后各取100 μL液体转移至96孔板中，测定490 nm处吸光度值，绘制生长曲线。
1.4.6 骨髓间充质干细胞与支架共培养后激光共聚焦显微镜观察骨髓间充质干细胞与支架材料复合培养后第3，10天，将接种细胞的支架用PBS浸泡冲洗2次，体积分数4%甲醛固定15 min，再次PBS浸泡冲洗2次，之后按1∶100比例加入0.25%Triton X-100使细胞膜破裂，静置30 min后再次PBS浸泡冲洗2次，冲洗完毕后以1∶100比例避光条件下加入罗丹明以使细胞骨架着色，室温条件下孵育2 h后，PBS冲洗浸泡2次，在避光条件下以1∶250比例加入DAPI使细胞核着色，室温条件下孵育5 min，经PBS浸泡冲洗2次后，以少量PBS覆盖支架，以刚刚覆盖住支架表面为宜。将准备好的复合支架避光条件下携带至转盘式激光共聚焦显微镜下观察细胞增殖情况。
1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞原代培养、成骨诱导后形态学观察；②骨髓间充质干细胞与镁基合金支架共培养后激光共聚焦显微镜观察及细胞增殖活性检测。
1.6 统计学分析使用SPSS 23.0统计分析软件对所得数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料数据以x±s表示，采用t检验进行比较，组间差异采用方差分析，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过天津医科大学医学统计学专家审核。

讨论

组织工程植入物的核心功能元件是活的细胞。骨髓间充质干细胞具有稳定的传代能力，且其自身具备多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等[16]。骨髓间充质干细胞成骨分化潜能使其在组织工程研究中具有显著优势：植入机体内的骨髓间充质干细胞可促进血管再生和成骨，进一步促进骨再生过程中新生组织生长[17]。骨髓间充质干细胞来源充足，取材较方便，体外培养时易分离、获取，具有一定可塑性和自我更新能力。自体骨髓间充质干细胞免疫原性低，更适合作为移植物。该实验通过流式细胞学技术对第3代兔骨髓间充质干细胞进行表面抗原检测，证明所培养细胞符合骨髓间充质干细胞表面标志物特征；通过碱性磷酸酶水平检测及Von Kossa染色证实了在成骨诱导条件下骨髓间充质干细胞成功向成骨细胞分化。
支架材料的选择同样是骨组织工程的关键环节之一。镁是骨骼中的重要微量元素，同时也是人体代谢的必需物质，健康成年人每日镁的需要量在250-350 mg之间[18]。与普通的惰性金属植入物相比，其弹性模量与骨骼接近，可有效降低宿主组织周围的应力集中与遮挡[19]。更重要的是镁离子可增强成骨细胞活性，促进新骨组织形成，同时以一种安全、可控的方式被人体降解吸收，从而避免了二次手术移除植入物的需要[20-21]。ABED等[22]研究证明细胞外基质中的镁离子可刺激骨细胞中MAPK受体的基因表达，并且能提高骨钙素水平。纯镁及镁合金的上述优点，使其可用作无机仿生植入物修复骨组织，而合金化技术的出现改善了镁合金的力学性能。有研究证明锌元素可通过固溶、强化时效析出大幅度提高镁合金的力学性能，同时可提高镁的耐腐蚀性及抗菌性能[23-24]。SEONG等[25]证明在镁合金中加入钙元素能达到相同效果。
利用镁合金通过合金化技术或表面改性修饰技术构筑组织工程化支架的实验已大范围开展，而将种子细胞与镁基合金支架共培养构筑组织工程化骨的实验研究相对较少。诱导骨髓间充质干细胞成骨分化是促进骨组织修复的有效途径。镁离子是调节骨髓间充质干细胞成骨分化的关键因素。研究证明，镁离子的加入可以激活多种细胞分化的相关途径，包括Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白4
等[26-27]。另外，ZHANG等[28]研究发现调控镁基合金支架中镁离子浓度可使生物材料具有良好的骨免疫调节特性，诱导M2巨噬细胞表型极化从而产生抗炎环境，并激活骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2信号通路，从而促进成骨分化。LIU等[29]使用硫代聚乙二醇和镁离子制作可注射水凝胶支架，通过对镁的控释可提高骨髓间充质干细胞的增殖和成骨活性，虽然这种水凝胶体系具有较好的膨胀率和降解率，但其力学性能不及合金支架，不能用于承重部位骨缺损或骨坏死区域的修复。WANG等[30]发现含镁培养基及含镁-锌培养基可显著促进人骨髓间充质干细胞成骨分化，表现为碱性磷酸酶水平升高、钙结节形成增强，证实了镁及镁-锌提取物显著促进人骨髓间充质干细胞中MAPK信号的激活，这一实验为镁基合金支架与种子细胞共培养构筑组织工程化骨提供了理论及实验基础。ZHANG等[12]研究证明骨髓间充质干细胞在镁基合金支架上黏附密度明显高于纯镁，且镁基合金支架可促进骨髓间充质干细胞成骨，体外实验证实了这种组织工程化骨的良好抗腐蚀性能及抗菌性能。为优化种植体-骨界面整合，为验证组织工程学模式构筑新型组织工程支架的可行性，该实验分离提取兔源性骨髓间充质干细胞，进行流式细胞检测及成骨化诱导后，将其与镁基合金支架共培养，共聚焦显微镜显示细胞可在镁基合金支架上黏附并增殖，与聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架相比，细胞增殖更显著。另外MTT检测显示，镁基合金支架与种子细胞共培养前期，细胞增长迅速，吸光度值呈线性增长，培养后期细胞增长放缓，甚至出现下降情况，这符合目前细胞培养的一般规律。该实验结果显示镁基合金支架无明显细胞毒性，适合种子细胞生长增殖，初步表明运用这一组织工程学手段构筑新型组织工程化骨方法可行，未来可在这种方法基础上进一步拓宽组织工程化骨构建的新思路。
该实验从兔骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞具有干细胞特性，由于其良好的生长增殖及多向分化特性，被广泛用于细胞生物学研究。该实验用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，分别与镁基合金、聚已内酯-壳聚糖-磷酸三钙支架共培养来检验支架生物性能。研究结果证明骨髓间充质干细胞可在镁基合金支架上黏附、增殖，为无机金属负载种子细胞构筑组织工程化骨提供了理论及实验依据。由于骨髓间充质干细胞的诸多优势及镁基合金支架表面修饰及改性工艺的提升，作者推测镁基合金负载骨髓间充质干细胞构筑的组织工程支架将很有可能成为临床修复骨坏死及骨缺损的生物医学植入物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程