上调长链非编码RNA SNHG12表达减轻过氧化氢诱导的神经细胞活性下降及细胞凋亡和过度自噬

doi:10.12307/2023.681

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3773-3779.doi: 10.12307/2023.681

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上调长链非编码RNA SNHG12表达减轻过氧化氢诱导的神经细胞活性下降及细胞凋亡和过度自噬

郑羽晨，章健，张睿，陈晓生，蓝涛，周文钰

深圳大学第一附属医院(深圳市第二人民医院)脊柱科，广东省深圳市 518035

收稿日期:2022-08-04 接受日期:2022-10-18 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-18
通讯作者: 周文钰，硕士，主任医师，深圳大学第一附属医院(深圳市第二人民医院)脊柱科，广东省深圳市 518035
作者简介:郑羽晨，男，1985年生，广东省博罗县人，汉族，2012年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱退变方面的研究。
基金资助:
广东省基础与应用基础研究基金项目(2021A1515110311)，项目负责人：章健

Up-regulation of long non-coding RNA SNHG12 expression attenuates hydrogen peroxidation-induced decline in neuronal cell activity, apoptosis and excessive autophagy

Zheng Yuchen, Zhang Jian, Zhang Rui, Chen Xiaosheng, Lan Tao, Zhou Wenyu

Department of Spine, The First Affiliated Hospital (Shenzhen Second People’s Hospital) of Shenzhen University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

Received:2022-08-04 Accepted:2022-10-18 Online:2023-08-28 Published:2023-01-18
Contact: Zhou Wenyu, Master, Chief physician, Department of Spine, The First Affiliated Hospital (Shenzhen Second People’s Hospital) of Shenzhen University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
About author:Zheng Yuchen, Master, Attending physician, Department of Spine, The First Affiliated Hospital (Shenzhen Second People’s Hospital) of Shenzhen University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Province Basic and Applied Basic Research Fund Project, No. 2021A1515110311 (to ZJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

自噬：是在应激下大量胞质降解和有效更新的主要途径之一，它可以降解受损的细胞器或病理蛋白，在维持细胞稳态方面起着重要作用。在中枢神经系统，神经元的维护需要低水平的基础自噬。脊髓损伤后，过度自噬可以增强凋亡性神经细胞死亡。
氧化损伤：是脊髓损伤加重的原因之一，主要由活性氧介导。正常生理条件下，机体的氧化-抗氧化能力保持相对的稳态。脊髓损伤后，较小的髓内血管和毛细血管容易受损，导致脊髓缺氧和能量供应不足，线粒体功能障碍造成活性氧产生过多，引发神经细胞的氧化损伤和后续凋亡。

背景：脊髓损伤后的继发性损伤被认为是其致残率高的主要因素。抑制氧化应激和细胞凋亡的病理级联反应，延缓疾病进程，是减轻脊髓损伤的一大治疗方向。长链非编码RNA SNHG12被认为与细胞的氧化还原稳态具有相关性，其能否调控过氧化氢过载引起的神经细胞氧化损伤目前仍未知。
目的：探究长链非编码RNA SNHG12在过氧化氢诱导神经细胞HT22氧化损伤中的作用及机制。
方法：①100 μmol/L过氧化氢干预HT22细胞6 h，建立细胞氧化损伤模型。②通过转染提升HT22细胞中SNHG12表达水平，采用CCK-8、锥虫蓝染色、TUNEL染色和蛋白质免疫印迹实验评估SNHG12表达水平对HT22细胞活力、凋亡和自噬的影响。③采用荧光素酶实验验证SNHG12/miR-320a/SIRT5的靶向关系。④通过转染分别促进HT22细胞中miR-320a和SIRT5上调，采用逆转实验探讨miR-320a和SIRT5在SNHG12发挥保护作用中的调控作用。

结果与结论：上调SHNG12表达可以减轻过氧化氢诱导的细胞活性下降、细胞凋亡和过度自噬。荧光素酶实验证实SHNG12/miR-320a/SIRT5三者之间存在结合关系。miR-320a过表达可以逆转上调SNHG12对以上各指标的影响，而SIRT5过表达可以逆转上调miR-320a对以上各指标的影响。结果表明：SNHG12通过调控miR-320a/SIRT5轴抑制HT22细胞自噬和凋亡，减缓细胞氧化损伤。

https://orcid.org/0000-0003-3905-2361 (郑羽晨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: SNHG12, 神经细胞, 氧化损伤, miR-320a, SIRT5

Abstract: BACKGROUND: After spinal cord injury, secondary injury is considered to be a major factor in its high morbidity rate. Inhibiting the pathological cascade of oxidative stress and apoptosis and delaying the disease process are the primary therapeutic direction for alleviating spinal cord injury. The long non-coding RNA SNHG12 is thought to be related to cellular redox homeostasis, and its function on regulating the oxidative damage in neurons caused by H2O2 overload remains unknown.
OBJECTIVE: To investigate the function and mechanism of long non-coding RNA SNHG12 in H2O2-induced oxidative damage of HT22 cells.
METHODS: (1) The HT22 cells were exposed to 100 μmol/L H2O2 for 6 hours to establish the cellular oxidative damage model. (2) The expression level of SNHG12 in HT22 cells was increased by transfection. The influences of SNHG12 expression on HT22 cell viability, apoptosis level, and autophagy were evaluated using CCK8 assay, Tryphenol blue staining, TUNEL staining, and western blot analysis. (3) Luciferase assay was used to verify the targeting relationship between SNHG12/miR-320a/SIRT5. (4) The upregulation of miR-320a and SIRT5 in HT22 cells was induced by transfection, respectively, and the regulation of miR-320a and SIRT5 in the protective role of SNHG12 was explored by reverse experiments.
RESULTS AND CONCLUSION: SHNG12 overexpression could alleviate the decline in cell viability, apoptosis, and excessive autophagy caused by H2O2. Luciferase reporter assay confirmed the binding relationship among SHNG12/miR-320a/SIRT5. miR-320a overexpression could reverse the effects of elevated SNHG12 on the above aspects, whereas SIRT5 overexpression can reverse the effect of up-regulation of miR-320a on the above indicators. It is concluded that SNHG12 suppressed autophagy and apoptosis of HT22 cells and alleviated oxidative damage via regulating miR-320a /SIRT5 axis.

Key words: SNHG12, nerve cell, oxidative damage, miR-320a, SIRT5

中图分类号:

郑羽晨, 章健, 张睿, 陈晓生, 蓝涛, 周文钰. 上调长链非编码RNA SNHG12表达减轻过氧化氢诱导的神经细胞活性下降及细胞凋亡和过度自噬[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3773-3779.

Zheng Yuchen, Zhang Jian, Zhang Rui, Chen Xiaosheng, Lan Tao, Zhou Wenyu. Up-regulation of long non-coding RNA SNHG12 expression attenuates hydrogen peroxidation-induced decline in neuronal cell activity, apoptosis and excessive autophagy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3773-3779.

图/表（结果） 4

2.1 SNHG12过表达减轻H2O2对细胞的损伤实时荧光定量PCR实验结果表明，H2O2处理后HT22细胞内SHNG12的表达水平应激性显著升高(P < 0.05)，见图1A。细胞分别转染Ov-NC和Ov-SHNG12载体后，实时荧光定量PCR实验结果表明，转染Ov-SHNG12的细胞中SHNG12表达水平显著上调(P < 0.05)，见图1B。CCK-8实验和锥虫蓝染色结果表明，与Ov-NC组比较，SNHG12过表达可以显著增加HT22细胞的存活率(P < 0.05)，见图1C，D。TUNEL实验结果表明，SNHG12过表达可以逆转H2O2引发的凋亡(P < 0.05)，见图1E。蛋白质免疫印迹实验结果表明，H2O2促进了自噬蛋白LC3-Ⅱ及Beclin-1的表达，抑制了p62的表达；而与H2O2+Ov-NC组相比，H2O2+Ov-SNHG12组LC3-Ⅱ和Beclin-1表达降低，p62表达升高，见图1F。

2.2 SNHG12调节miR-320a/SIRT5轴实时荧光定量PCR实验结果表明，H2O2处理后HT22细胞内miR-320a的表达水平显著降低(P < 0.05)，见图2A。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验结果表明，H2O2处理后HT22细胞内SIRT5的表达水平显著升高(P < 0.05)，见图2B，C。利用在线数据库Starbase 3.0预测miR-320a分别与SNHG12和SIRT5的结合位点。为了验证miR-320a与SNHG12之间的关系，在293T细胞中共转染miR-320a mimics及带有miR-320a结合位点(SNHG12-WT)或突变位点(SNHG12-MUT)的荧光素酶报告基因载体，实验结果表明，转染miR-320a mimic可以显著减弱SNHG12-WT组的荧光素酶活性(P < 0.05)，见图2D，而对SNHG12-MUT组的荧光素酶活性没有明显影响。同样的，为了验证miR-320a与SIRT5之间的关系，共转染之后检测各组的荧光素酶活性，实验结果表明，转染miR-320a mimic可以减弱SIRT5-WT组的荧光素酶活性(P < 0.05)，见图2E，对SIRT5-MUT组的荧光素酶活性没有明显影响。实时荧光定量PCR实验表明，SNHG12过表达可以显著下调miR-320a的表达(P < 0.05)，见图2F，实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验表明，miR-320a过表达可以显著下调SIRT5的表达(P < 0.05)，见图2G和2H。

2.3 SNHG12通过调节miR-320a减轻H2O2诱导的细胞应激损伤 CCK-8细胞活性实验和锥虫蓝染色结果表明，SNHG12过表达可以减轻H2O2引起的细胞活性下降，而miR-320a过表达又使得细胞活性下降(P < 0.05)，见图3A，B。TUNEL细胞实验结果表明，SNHG12过表达可以减轻H2O2引起的细胞凋亡，而miR-320a过表达又促进了细胞的凋亡，见图3C。蛋白质免疫印迹实验结果表明，SNHG12过表达可以减轻H2O2引起的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1水平的提升，以及p62的下降，而miR-320a过表达又提升了自噬蛋白表达水平，见图3D。

2.4 miR-320a通过调节SIRT5促进H2O2诱导的细胞应激损伤实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验结果表明，转染Ov-SIRT5的HT22细胞内SIRT5的表达水平显著上调(P < 0.05)，见图4A，B。CCK-8细胞活性实验和锥虫蓝染色结果表明，miR-320a过表达可以促进H2O2引起的细胞活性下降，而SIRT5过表达可以抑制细胞活性的下降(P < 0.05)，见图4C，D。TUNEL细胞实验结果表明，miR-320a过表达可以促进H2O2引起的细胞凋亡，而SIRT5过表达可以抑制细胞凋亡的升高，见图4E。蛋白质免疫印迹实验结果表明，miR-320a过表达可以促进H2O2引起的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1水平的提升，以及p62的下降，而SIRT5过表达可以抑制自噬蛋白表达水平的升高，见图4F。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验。①CCK-8、锥虫蓝染色、TUNEL、蛋白质免疫印迹实验，观察SNHG12过表达对细胞活性、凋亡和自噬的影响，分为对照组、H2O2组、H2O2 + Ov-NC组、H2O2 + Ov-SNHG12组。②CCK-8、锥虫蓝染色、TUNEL、蛋白质免疫印迹实验，观察SNHG12和miR-320a表达水平对细胞活性、凋亡和自噬的影响，分为对照组、H2O2组、H2O2 + Ov-NC + mimic-NC组、H2O2 + Ov-SNHG12 + mimic-NC组、H2O2+ Ov-SNHG12 + miR-320a mimic组。③CCK-8、锥虫蓝染色、TUNEL、蛋白质免疫印迹实验，观察miR-320a和SIRT5表达水平对细胞活性、凋亡和自噬的影响，分为对照组、H2O2组、H2O2+ mimic-NC + Ov-NC组、H2O2 + miR-320a mimic + Ov-NC组、H2O2+ miR-320a mimic + Ov-SIRT5组。
1.2 时间及地点实验于2020年2月至2021年11月在南方医科大学附属第三医院实验中心完成。
1.3 材料小鼠海马神经元细胞系HT22购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清、胰酶消化液、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Thermo Fisher公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8细胞增殖活性试剂盒、RIPA细胞裂解液购上海碧云天生物技术公司；体积分数3%H2O2购自上海生工生物科技公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国普洛麦格生物科技公司；总RNA提取试剂盒、M-MLV反转录试剂盒、miRNeasy Mini Kit和SYBR Green qPCR mix购自北京天根生物科技公司；兔抗Beclin-1、p62、β-actin抗体购自美国Abcam公司；兔抗LC3抗体购自美国CST公司，HRP山羊抗兔IgG抗体购自天津三箭生物科技公司；ECL化学发光底物购自德国默克密理博科技公司。过表达质粒pcDNA3.1-SNHG12、空质粒pcDNA3.1-NC以及荧光素酶报告基因质粒SNHG12、SNHG12-mut、SIRT5、SIRT5-mut购自北京合成基因科技公司；miR-320a模拟物(mimic)以及阴性对照mimic-NC由上海吉玛基因公司合成。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养及处理 HT22细胞培养使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基，放置于37 ℃ CO2培养箱中传代培养。

H2O2诱导细胞损伤模型建立：将HT22细胞接种在6孔细胞培养板中生长至对数期，加入浓度为100 μmol/L的H2O2[21]，继续将细胞放置在CO2培养箱中孵育6 h。

细胞转染：使用Lipofectamine 2000转染过表达质粒pcDNA3.1-SNHG12，pcDNA3.1-SIRT5或miRNA-320a mimic，转染操作依照产品使用手册进行。转染前1 d，细胞铺板，正常条件培养过夜。细胞密度约70%时，将质粒与转染试剂混合并加入细胞培养板。转染36 h后，通过实时荧光定量PCR分析转染效力。

1.4.2 细胞活性实验 HT22细胞经转染后，胰酶消化，离心收集细胞，使用DMEM完全培养基重悬细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔3×103个细胞，放置于CO2培养箱中培养12 h，待细胞充分贴壁后，加入终浓度为100 μmol/L的H2O2，继续培养6 h，弃掉培养基，加入10 μL CCK-8反应液，放置于37 ℃孵育4 h后，利用酶标仪检测490 nm吸光度值，并计算细胞活力(%) = (实验组吸光度值-空白吸光度值)/(对照组吸光度值-空白吸光度值)×100%。
1.4.3 锥虫蓝染色 HT22细胞经转染及100 μmol/L H2O2处理后，于DMEM完全培养基中重悬。在100 μL细胞悬液中加入100 μL的2×锥虫蓝染色液，染色3 min，用血球计数器进行细胞计数，蓝染细胞为死细胞。
1.4.4 细胞凋亡测定 HT22细胞经转染及100 μmol/L H2O2处理后制作涂片，浸入40 g/L多聚甲醛中固定20 min，接着用预冷的1% Triton X-100通透处理5 min，用体积分数3% H2O2封闭10 min后依据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书加入反应液，最后加入DAB显色液。细胞核使用苏木素进行复染，封固后显微镜200倍下观察细胞凋亡情况。

1.4.5 实时荧光定量PCR HT22细胞经转染及100 μmol/L H2O2处理后，经胰酶消化并收集，使用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，使用M-MLV反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为检测SNHG12、SIRT5表达水平的模板，并以β-actin作为内参对照；使用miRNeasy Mini Kit将miRNAs反转录为cDNA，作为miR-320a表达水平的模板，并以U6作为内参对照。使用SYRB green qPCR mix对cDNA进行定量PCR检测，所需引物序列见表1。

1.4.6 蛋白质免疫印迹实验 HT22细胞经转染及100 μmol/L H2O2处理后，弃掉培养基，加入2 mL磷酸盐缓冲液漂洗2次，随后加入500 μL预冷的RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解20 min，然后用移液器反复吹打，并将细胞裂解液转移至1.5 mL离心管，在4 ℃条件下，12 000 r/min离心10 min，收集细胞裂解液上清，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，最后加入100 μL 6×SDS上样缓冲液，沸水加热10 min，得到变性的细胞总蛋白样品。每孔加入25 μg细胞总蛋白样品，利用SDS-PAGE凝胶电泳法分离蛋白样品；电泳结束后，将蛋白样品转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭
30 min，随后加入1∶1 000稀释的Beclin-1、p62、LC3和β-actin一抗，放置于4 ℃条件下孵育过夜；膜用TBST充分漂洗后，加入1∶5 000稀释的二抗室温孵育45 min，最后加入ECL底物，利用凝胶成像仪拍摄蛋白质印迹。
1.4.7 荧光素酶报告基因实验使用Starbase 3.0在线工具预测miR-320a分别与SNHG12和SIRT5的结合位点，并将带有SNHG12或SIRT5结合位点或结合位点突变的UTR序列连到带有CMV启动子的pGL4载体Luciferase CDS的末端，与miR-320a mimic或mimic-NC共同转染至HT22细胞。转染24 h后离心收集细胞，并加入细胞裂解液，室温裂解30 min，最后使用荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性。
1.5 主要观察指标 ①SNHG12过表达是否影响H2O2对HT22细胞活性、凋亡和自噬的作用；②SNHG14/miR-320a/SIRT5调节轴是否成立；③miR-320a过表达是否影响SNHG12对HT22细胞活性、凋亡和自噬的调节；④SIRT5过表达是否影响miR-320a对HT22细胞活性、凋亡和自噬的调节。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析，实验数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素或多因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过南方医科大学附属第三医院实验中心生物统计学专家审核。

讨论

脊髓损伤是一种严重的神经系统疾病，继发性损伤被认为是此疾病致残率高的主要因素[22]，这多源于炎症和氧化应激所引起的神经元受损[23]。及时抑制炎症[24-25]、氧化应激[26]、细胞凋亡的病理联级反应[27]，延缓疾病进程，是减轻脊髓损伤的一大治疗方向。此外，自噬作为全身应激反应的关键组成部分，在机体遭受脊髓损伤时反应明显[28]。有效地调节神经细胞自噬，对脊髓损伤功能恢复可起到促进作用[29]。
已有文献表明，许多长链非编码RNA参与神经损伤的响应[30-32]。例如，长链非编码RNA H19在脑卒中患者血清中表达水平上调，抑制H19的表达可以减轻缺氧引起的神经损伤[33]。在葡萄糖剥夺/复氧导致的神经损伤中，Lnc-D63785表达水平下调，并通过调控miR-422a表达影响神经细胞死亡[34]。该研究在H2O2诱导的HT22神经细胞氧化损伤模型中发现SNHG12在细胞响应氧化损伤应激过程中表达水平应激性上调，SNHG12过表达可以逆转H2O2对HT22细胞活性和凋亡的影响。
在自噬过程中，LC3、Beclin1和p62均可反映自噬的发生和强度，是检测自噬的标志蛋白[35]。研究结果显示，H2O2诱导LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和Beclin1表达量均明显升高，p62表达量明显下降，表明H2O2诱导后细胞自噬被激活，而SNHG12过表达可以抑制细胞自噬。这些结果提示SNHG12在H2O2过载环境中通过抑制细胞凋亡和过度自噬来减少神经细胞氧化损伤。此前，SNHG12在缺血再灌注的细胞模型中也被发现可通过抑制自噬增强细胞活力，提示了SNHG12在脑缺血再灌注损伤中潜在的积极作用[36]。最新研究揭示SNHG12在1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridium，MPP+)诱导的细胞损伤模型中可减少氧化应激，为帕金森病提供新的治疗靶点[37]，这说明SNHG12不仅可以保护神经细胞抵抗氧化损伤，还可有效抵抗毒性损伤。
为了进一步研究SNHG12调控HT22细胞氧化损伤的机制，该研究利用生物信息学手段预测到miR-320a分别与SNHG12和SIRT5的结合位点，并利用荧光素酶报告基因，实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验证实了这三者的互相调控表达水平。该研究发现miR-320a过表达逆转了SNHG12对HT22神经细胞的保护作用。一项关于脑缺血的研究表明，向缺血大鼠脑室内注射抗miR-320a，miR-320a的水平下降可以引起水通道蛋白的增加，从而减少脑缺血梗死体积[38]。miR-320a被认为是治疗脑缺血的潜力靶点，而该研究暗示了靶向miR-320a在治疗神经系统疾病方面也同样具有潜力。正如上述所说，miR-320a通过调节水通道蛋白发挥功能，miRNAs一般通过与靶基因的mRNA相互作用，影响下游蛋白的转录来实现调控目的[39-40]。该研究发现miR-320a可以与去乙酰化酶SIRT5 3’UTR区域结合，并抑制SIRT5的表达。有研究表明，SIRT5能够通过抑制过氧化物酶体诱导的氧化应激抑制肝癌的发展[41]。SIRT5可以降低SH-EP神经母细胞瘤细胞中氧化应激水平并减少细胞凋亡[42]。此外，SIRT5通过保护线粒体抗氧化能力改善帕金森病小鼠黑质纹状体多巴胺能变性，减少运动障碍[43]。这些研究提示SIRT5是重要的氧化应激调控因子，在多种疾病中起积极作用。该研究揭示SIRT5过表达可以逆转miR-320a对HT22细胞的不利影响，一定程度上促进细胞的存活。
综上所述，该研究揭示了SNHG12/miR-320a/SIRT5在H2O2诱导的神经细胞氧化损伤中的作用及调控机制，即神经细胞内H2O2的积累可以促进细胞SNHG12的表达上调，SNHG12可以通过与miR-320a结合抑制其活性，进而促进SIRT5的表达，抑制细胞自噬和凋亡。SNHG12/miR-320a/SIRT5调控轴的发现有助于加深对神经损伤疾病中神经细胞氧化还原稳态的调控机制的理解，为脊髓损伤的治疗提供新的靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

上调长链非编码RNA SNHG12表达减轻过氧化氢诱导的神经细胞活性下降及细胞凋亡和过度自噬

Up-regulation of long non-coding RNA SNHG12 expression attenuates hydrogen peroxidation-induced decline in neuronal cell activity, apoptosis and excessive autophagy

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