脊髓损伤模型大鼠软脊膜下注射2型腺相关病毒免疫荧光染色分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1481

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (31): 4979-4985.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1481

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脊髓损伤模型大鼠软脊膜下注射2型腺相关病毒免疫荧光染色分析

柏秋实1，2，苏胜1，2，王亮佳1，2，郑洋洋2，康娟娟2，徐金影2，池光范2

(1吉林大学白求恩医学部临床医学院，吉林省长春市 130021；2吉林大学基础医学院病理学系病理生物学教育部重点实验室，吉林省长春市 130021)

收稿日期:2019-05-17 出版日期:2019-11-08 发布日期:2019-11-08
通讯作者: 池光范，博士，博士生导师，副教授，吉林大学基础医学院病理学系，吉林省长春市 130021
作者简介:柏秋实，男，1997年生，山东省济南市人，汉族，吉林大学白求恩医学部临床医学院在读本科。并列第一作者：苏胜，男，1997年生，吉林省吉林市人，汉族，吉林大学白求恩医学部临床医学院在读本科。
基金资助:
国家自然科学基金(81571199)，项目负责人：池光范

Immunofluorescence staining of adeno-associated virus type 2 after subpial injection in rat models of spinal cord injury

Bai Qiushi1, 2, Su Sheng1, 2, Wang Liangjia1, 2, Zheng Yangyang2, Kang Juanjuan2, Xu Jinying2, Chi Guangfan2

(1School of Clinical Medicine, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; 2Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Pathophysiology, Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China)

Received:2019-05-17 Online:2019-11-08 Published:2019-11-08
Contact: Chi Guangfan, MD, Doctoral supervisor, Associate professor, Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Pathophysiology, Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
About author:Bai Qiushi, School of Clinical Medicine, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Pathophysiology, Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China Su Sheng, School of Clinical Medicine, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Pathophysiology, Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China Bai Qiushi and Su Sheng contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81571199 (to CGF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
软脊膜：软脊膜是一富有血管的薄膜，由2层组成。内层由网状纤维和弹力纤维形成的致密网，紧贴于脊髓表面，并发出纤维隔进入脊髓，血管沿此小隔进出神经组织，它形成血管周围间隙的外壁；血管周围间隙位于血管外膜和软膜延伸部之间，此间隙可延伸到小动脉和小静脉移行于毛细血管的地方；软脊膜内层无血管，其营养由脑脊液来供给。软脊膜外层是由胶质纤维束组成的疏松网，并和蛛网膜小梁相连；外层内有脊髓血管，还有不规则的腔隙与蛛网膜下腔相通，走向深部，通入血管周围间隙。
钳夹型脊髓损伤模型：通过医用颅内动脉瘤夹制备的大鼠脊髓损伤模型。动脉夹可固定钳夹力，其损伤机制和病理生理变化与临床类似，能够模拟临床脊髓损伤中最常见的挤压损伤机制和病理生理变化，并且能够按照实验需求调整钳夹力度、角度、时间、节段部位和夹闭程度，模型具有相似性、可重复性、可靠性和可控性等特点。

摘要
背景：经软脊膜下注射腺相关病毒的方法可将病毒局限于以注射点为中心的较小范围内，全身毒副作用小，节省病毒的用量，但目前尚无将此方法应用于脊髓损伤大鼠的相关报道，对损伤部位星形胶质细胞和神经细胞的转染情况尚不明确。
目的：探讨通过软脊膜下注射2型腺相关病毒对脊髓损伤部位的星形胶质细胞和神经细胞的转染效果及手术过程的技术要点。
方法：实验方案经吉林大学动物实验伦理委员会批准。24只Wistar大鼠随机分为2组：腺相关病毒组和模型组，均使用钳夹法构建脊髓损伤模型。腺相关病毒组经软脊膜下注射60 μL病毒溶液；模型组经软脊膜下注射等量5%右旋糖酐溶液。于术后7，14和21 d取脊髓标本，进行免疫荧光染色，观察星形胶质细胞分布情况和2型腺相关病毒转染情况。
结果与结论：①经软脊膜下注射病毒后，病毒溶液最终均匀分布于损伤部位上下约1 cm的范围内；②术后7，14 d仅有微量绿色荧光蛋白在脊髓损伤区域表达，直至术后21 d，在脊髓损伤空洞周围可见有大量反应性星形胶质细胞，其在脊髓空洞周边部表达最为强烈，出现明显的胶质界膜；同时发现，2型腺相关病毒可稳定转染星形胶质细胞和神经细胞，其中星形胶质细胞集中分布于脊髓空洞周边部，而神经细胞散在分布于病毒转染范围内，注射范围以外正常组织仅见微量2型腺相关病毒转染；③该方法具有能将病毒局限于损伤部位，可靶向性转染星形胶质细胞和神经细胞，具有注射量病毒量低，全身毒副作用小，成本节约等优点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5022-4115(柏秋实)；0000-0001-9107-079X(苏胜)

Abstract:

BACKGROUND: The method of injecting adeno-associated virus subpial can limit the virus to a small area centered on the injection point, with less systemic toxicity and side effects, and save the amount of virus. However, there are no reports on the application of this method in spinal cord injury rats, and the transfection of astrocytes and neurons at the injured site is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the transfection effect of subpial injection of adeno-associated virus 2 on astrocytes and neurons in the spinal cord injury site and the technical points of the surgical procedure.
METHODS: The study was approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Jilin University. Twenty-four Wistar rats were randomly divided into two groups: adeno-associated virus group and model group. Rats in both groups were used to establish the spinal cord injury model using the clamp method. The adeno-associated virus group received 60 μL of virus solution by subpial injection, and the model group received an equal amount of 5% dextran solution. At postoperative 7, 14, and 21 days, spinal cord specimens were taken for immunofluorescence staining to observe the distribution of astrocytes and the transfection of adeno-associated virus 2.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After subpial injection of the virus, the virus solution evenly distributed in the range of about 1 cm above and below the injured site. (2) At 7 and 14 days after surgery, only a small amount of green fluorescent protein was expressed in the spinal cord injury area. Until day 21, a large number of reactive astrocytes were observed around the spinal cord injury cavity. The strongest expression was in the periphery of the spinal cord cavity, with obvious glial boundary membrane. It was also found that adeno-associated virus 2 could stably transfect astrocytes and neurons, in which astrocytes were concentrated around the periphery of the spinal cord cavity, while neurons were scattered within the scope of virus transfection. Only trace adeno-associated virus 2 transfection was found in normal tissues outside the scope of injection. (3) The method has the advantages of confining the virus to the injured site, targeting astrocyte and nerve cell transfection, low viral dosage, low systemic toxicity and side effects, and low cost.

Key words: adeno-associated virus 2, spinal cord injury using the clamp method, subpial injection, astrocyte, neurocyte, green fluorescent protein, glial fibrillary acidic protein, neurofilament-H, immunohistochemistry, immunofluorescence, glial scar

中图分类号:

柏秋实，苏胜，王亮佳，郑洋洋，康娟娟，徐金影，池光范 . 脊髓损伤模型大鼠软脊膜下注射2型腺相关病毒免疫荧光染色分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 4979-4985.

Bai Qiushi1, 2, Su Sheng1, 2, Wang Liangjia1, 2, Zheng Yangyang2, Kang Juanjuan2, Xu Jinying2, Chi Guangfan2. Immunofluorescence staining of adeno-associated virus type 2 after subpial injection in rat models of spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(31): 4979-4985.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析实验24只Wistar大鼠均进入结果分析，中途无脱失。

2.2 脊髓损伤模型评价完成钳夹脊髓损伤的大鼠术后均出现截瘫、尿潴留，部分出现血尿、肠梗阻。术后因泌尿系统感染及膀胱破裂死亡3只，其中腺相关病毒组1只，模型组2只，另外有不明原因死亡2只，腺相关病毒组1只，模型组1只，均用同体质量雄性Wistar大鼠补充。

2.3 病毒溶液分布情况在聚乙烯导管插入脊髓损伤上方0.3 cm并开始注射后，可观察到无色透明病毒溶液借助流速将导管上方约0.2 cm的脊髓组织与软脊膜分离开并均匀分布包裹整个脊髓组织。随导管缓慢向外抽出，病毒溶液最终均匀分布于损伤部位上下各0.5 cm的范围内。在聚乙烯导管拔出后观察到极少量病毒溶液附于导管壁上随拔出过程带出，导管拔出后仅观察导管遗留空洞处，并无明显溢出。最终可见以损伤部位为中心上下共约1 cm范围内软脊膜轻微隆起，其内为无色透明样液体。模型组与腺相关病毒组所见相同。

2.4 脊髓组织病理变化模型组与腺相关病毒组均在剥离脊髓标本时发现与周围组织粘连严重，且损伤部位与未损伤脊髓部位的白色相比颜色呈淡黄色。2组粘连情况与颜色无明显区别。

2.5 免疫荧光法观察胶质纤维酸性蛋白在脊髓损伤区域的表达模型组和腺相关病毒组脊髓纵切面可见钳夹处较正常部位脊髓横径略短，脊髓结构排列混乱，灰白质界限不清，形成脊髓空洞。在脊髓空洞周围可见有大量表达胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，胞体呈星形，向周围发出许多长的突起，其在脊髓空洞周边部表达最为强烈，出现明显的胶质界膜。见图2。

2.6 2型腺相关病毒转染脊髓星形胶质细胞与神经细胞情况与模型组比较发现，术后7，14 d仅有微量绿色荧光蛋白在脊髓损伤区域表达，至21 d在低倍镜下可见2型腺相关病毒携带的绿色荧光蛋白集中分布于脊髓损伤周边部，而远处仅可见微量绿色荧光蛋白表达。经与胶质纤维酸性蛋白表达情况比较发现，发现较多红色荧光与绿色荧光重合区域集中分布于脊髓空洞周边部，即受2型腺相关病毒转染的星形胶质细胞。见图3。经与NF-H表达情况比较发现，发现较多红色与绿色荧光重合区域散在分布于病毒转染范围内，即受2型腺相关病毒转染的神经细胞。见图4。

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引言

脊髓损伤是一种常见的脊柱外科损伤，可造成严重的感觉及运动功能障碍，且预后较差，严重损害了患者的自理能力和生活质量，但是目前尚无有效治疗的方法^[1-4]。星形胶质细胞是脊椎动物中枢神经系统中神经胶质细胞的主要组成部分，在中枢神经系统损伤时星形胶质细胞活化为反应性星形胶质细胞^[5]。脊髓损伤后会出现典型的以星形胶质细胞活化、反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕和囊腔的形成为主要特点的病理表现^[6-7]。脊髓损伤后大量反应性星形胶质细胞合成分泌以硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)为主要成分的细胞外基质，并且与小胶质细胞等炎症细胞在脊髓损伤区域边缘共同形成了致密的胶质瘢痕，其构成物理屏障抑制轴突跨越损伤部位，阻碍轴突再生、延长和融合，使得神经无法再生修复^[8]。因此，如何抑制星形胶质细胞的活化和胶质瘢痕的生成是治疗中枢神经系统损伤亟待解决的问题^[9-12]。

在目前抑制星形胶质细胞活化和胶质瘢痕生成的各种手段之中，以病毒为载体上调或下调星形胶质细胞相关基因是最为重要的方法之一^[13]。各种研究的争论点主要在于如何选择合适的载体与递送载体的方法来提高转染星形胶质细胞的效率。传统用于转基因表达的慢病毒因具有易被体内核糖核酸酶降解、分布性差、具有免疫原性、致突变性、细胞毒性及无靶向性等缺点，故不是最佳递送载体^[14-16]。近年来有研究发现，腺相关病毒具有在有丝分裂后的细胞中稳定长效表达、神经元趋向性、降低插入突变的风险和减少免疫应答等优点，可作为中枢神经系统疾病治疗的理想基因载体^[17]。在过去的几年里，已经发现了12种天然血清型和超过100种腺相关病毒(Adeno- associated Virus，AAV)变异型^[18]，其中2型腺相关病毒具有无致病性、宿主范围广、目的基因持久表达等优点，研究发现其在中枢神经系统的靶细胞主要为星形胶质细胞和神经细胞^[19-21]。因此，可利用2型腺相关病毒这一细胞嗜性，将其递送至脊髓损伤部位，观察其在脊髓损伤条件下转染星形胶质细胞和神经细胞的情况。但是病毒递送至成年哺乳动物深部脑或脊髓实质的能力有限^[22]，这限制了该方法的有效利用。

目前，国内外学者递送病毒到损伤的脊髓处常用的途径有静脉注射、蛛网膜下腔注射和直接局部注射3种途径。然而，这3种途径各有优缺点：静脉注射，该途径显然能避免很多不必要的损伤，但是细胞注射到血液中，只有很少一部分能迁移到脊髓内，到达损伤局部的更是微乎其微，这将难以取得理想的治疗效果^[23-25]；蛛网膜下腔注射，病毒会弥散在脑脊液中，并进而扩散进入全身的血液循环，病毒转染范围过大，无法靶向转染损伤部位的细胞，且会造成严重的全身不良反应，同时也增加了病毒的用量^[26]；损伤部位直接注射，该方法能将病毒毫无损失地移植到脊髓内，但是需要在脊髓损伤后再次暴露脊髓，增加了感染和出血的概率。更严重的是，重新剪开已经愈合的皮肤和肌肉，并在损伤原位进行注射，所有这些操作将导致脊髓损伤进一步的加重，而且无法控制个体之间处理上的差异，增加了对结果的干扰因素，对于临床应用来说手术创伤大，对患者功能的恢复造成第二次损害。所以，对于移植修复脊髓损伤目前仍需要探索出更合理有效的方法^[27-28]。

最近有研究首次证明了软脊膜下注射具有将病毒局限于注射部位、注射病毒量低、全身不良反应小及成本节约等优点^[29-30]，但该研究并未涉及脊髓损伤的大鼠。此次实验拟通过构建大鼠脊髓损伤模型，经软脊膜下注射的方式将2型腺相关病毒靶向递送至脊髓损伤部位，在预设的时间点通过免疫荧光法观察损伤部位星形胶质细胞与神经细胞分布的情况和2型腺相关病毒转染星形胶质细胞和神经细胞的情况。有研究发现，一些特异基因或蛋白表达可以拮抗星形胶质细胞在脊髓损伤后形成胶质瘢痕过程中的负面作用^[31-32]，所以此实验同时为下一步构建重组2型腺相关病毒或AAV-BBB 2.0(汉恒科技)介导星形胶质细胞特有的胶质纤维酸性蛋白启动子下过表达特定基因来抑制胶质瘢痕形成的研究打下实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年3月至2019年2月在吉林大学病理生物学教育部重点实验室进行。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组选取24只成年Wistar大鼠，雄性，体质量250-300 g，清洁级，饲养条件：室温(23±2) ℃，光照控制12 h(7：00-19：00)，自由饮食水。动物由吉林大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(吉)2013-0005。将大鼠随机分为2组，每组12只：模型组去除椎板后行脊髓夹闭建立脊髓损伤模型+软脊膜下注射5%右旋糖酐溶液；腺相关病毒组去除椎板后行脊髓夹闭建立脊髓损伤模型+软脊膜下注射腺相关病毒。

1.3.2 实验用主要试剂与仪器携带绿色荧光蛋白的2型腺相关病毒(AAV2-GFP)(1×10¹² v.g./mL)(汉恒生物科技(上海)有限公司)；右旋糖酐粉末(华中海威(北京)基因科技有限公司)；一抗：鸡来源抗绿色荧光蛋白抗体(abcam公司)、兔来源抗GFAP抗体(abcam公司)、小鼠来源抗Neurofilament-H 抗体(NF-H，Cell Signaling公司)；二抗：山羊抗兔红色荧光二抗(abcam公司)、山羊抗鸡绿色荧光二抗(Invitrogen公司)、山羊抗小鼠红色荧光二抗(Cell Signaling公司)；手术显微镜(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；聚乙烯导管(0.20 mm I.D. x0.51 mm O.D.,SAI公司)；微血管夹子(20-30 g，FST公司)；G18尖头针头(BD公司)；OmnicanU40胰岛素注射器(德国BRAUN)；冰冻切片机(thermo fisher scientific公司)；蠕动泵(兰格恒流泵有限公司)；免疫荧光分析仪器(Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 术前准备开始手术前，解冻病毒(AAV2-GFP；30 μL等分试样)。通过在蒸馏水中混合右旋糖酐粉末来制备5%右旋糖酐溶液。用5%右旋糖酐溶液1∶1混合病毒溶液至最终右旋糖酐浓度为2.5%。将病毒溶液置于冰上(4 ℃)。

1.4.2 建立脊髓损伤模型 Wistar大鼠按每100 g体质量0.35 mL体积分数10%水合氯醛生理盐水溶液进行腹腔内注射麻醉。麻醉满意后，于术区备皮，俯卧位固定于手术台，常规消毒，铺巾。于T₁₀节段正中纵向切开皮肤，切口长4.0-5.0 cm，逐层切开皮下组织，暴露棘突，钝性分离椎旁肌肉，放置牵开器暴露椎板；剪掉T₉-T₁₁棘上韧带和棘间韧带，切除T₉-T₁₁棘突，用咬骨钳咬除T₉-T₁₁椎板，打开硬脊膜，暴露目标脊髓段。对模型组和腺相关病毒组分别用微血管夹子对脊髓T₉段进行钳夹损伤，观察大鼠痉挛性摆尾、双后肢抽动，表明脊髓损伤模型制作成功，在钳夹30 s后取出脊髓损伤夹子见图1A。

1.4.3 干预在手术显微镜下用眼科剪剪开蛛网膜，用细针将T₁₁节段的软脊膜打开一直径约1 mm的圆形孔洞。将聚乙烯导管一端与胰岛素注射器相连，另一端插入18 G尖头针头内。助手靠近术者手持胰岛素注射器，同时术者一手持18 G针头将其头部斜面前半部轻轻插入软脊膜与脊髓间的空隙中，使聚乙烯导管可通过针头插入软脊膜下，另一手缓慢推动聚乙烯导管至损伤部位以上0.3 cm处，轻轻从软脊膜下退出18 G尖头针头，使聚乙烯导管留于软脊膜下而18 G针头在软脊膜外。此过程中避免胰岛素注射器和聚乙烯导管分离，见图1B。通过双盲法，将胰岛素注射器连接至聚乙烯导管上，腺相关病毒组将60 μL病毒在 2 min中内匀速注入软脊膜下间隙，并在注射过程中缓慢向外抽出聚乙烯导管，使抽出过程与注射过程同时结束，使注入的病毒均匀分布于脊髓损伤位置上下约0.5 cm范围内。模型组则用相同方法注入60 μL 5%右旋糖酐溶液。逐层缝合肌肉、皮下筋膜、皮肤，让动物在加热垫上恢复。

1.4.4 术后评估鼠麻醉清醒后评估脊髓损伤模型，以BBB(Basso Beattie Bresnahan)运动功能评分为0，双下肢完全瘫痪，无法站立，下肢关节无活动，脚掌向上，尾完全下垂可判定造模成功。术后大鼠分笼饲养，隔日更换垫料，自由饮食，按摩膀胱每日3次辅助排尿，直至大鼠恢复自主排尿。定期会阴消毒，肌肉注射青霉素针预防感染10×10⁴ U/只，连续3 d，预防术后感染。

1.4.5 组织与形态学观察在注射2型腺相关病毒后的7，14和21 d各取模型组和腺相关病毒组4只进行心脏灌注、取材。取体积分数10%水合氯醛生理盐水溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉满意后固定于解剖手术台，分离皮下组织，充分暴露胸腔，将灌注针(18 G)插入左心室并送入升主动脉内，同时剪开右心耳，用蠕动泵依次灌注生理盐水和40 g/L多聚甲醛，生理盐水快速灌注至流出的血液变为清亮液体即停止，然后用40 g/L多聚甲醛缓慢灌注固定脊髓，直至大鼠四肢僵硬且轻微抽搐即可停止。完整取出脊髓，以损伤部位为中心，保留约2.5 cm长脊髓组织，并将其置于 40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h。48 h取出后依次置于15%、30%蔗糖溶液中进行脱水。脱水完成后进行OCT包埋，在低温恒温器上切割冠状冷冻切片(14 μm厚)，切片待自然晾干后储存在-20 ℃冰箱中。

1.4.6 免疫荧光法检测星形胶质细胞生成情况复苏免疫冰冻切片后，PBS漂洗组织切片，0.1%-0.2%的Triton-X 100打孔40 min；用10%正常山羊血清孵育组织切片 20 min(37 ℃)。甩去血清，滴加GFAP一抗(1∶1 000)4 ℃冰箱孵育过夜。次日恢复室温后，PBS漂洗后再分别加入绿色荧光蛋白抗兔二抗，常温孵育40 min。弃二抗，PBS充分漂洗后水性封片剂封固。以体积分数1%山羊血清代替一抗作为阴性对照。荧光显微镜下观察并拍照。

1.4.7 免疫荧光法检测损伤区病毒转染情况复苏免疫冰冻切片后，PBS漂洗组织切片，0.1%-0.2%的Triton-X 100打孔40 min；用10%正常山羊血清孵育组织切片 20 min(37 ℃)。甩去血清，将各组切片随机分为2组，分别行GFP(1∶2 000)-GFAP(1∶1 000)和GFP(1∶2 000)- NF-H(1∶400)共染4 ℃过夜。PBS漂洗后再分别加入相应的二抗，37 ℃孵育1 h。弃二抗，PBS充分漂洗后水性封片剂封固。以体积分数1%山羊血清代替一抗作为阴性对照。荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 主要观察指标 ①脊髓组织的病理变化；②免疫荧光检测损伤脊髓组织中胶质纤维酸性蛋白和NF-H表达情况；③免疫荧光检测2型腺相关病毒转染的范围以及转染的星形胶质细胞和神经细胞的分布情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

目前，临床上主要采用药物干预、外科手术以及现代康复训练等一系列综合措施治疗脊髓损伤，但尚未取得理想的疗效^[35]。因此，需要在深入探索脊髓损伤病理机制的基础上寻找有效的治疗策略，特别是寻找有效的治疗靶细胞^[36]。研究发现，脊髓损伤发生后脊髓内神经传导通路被破坏，神经细胞受到继发性炎症反应的影响而持续死亡，损伤部位周边部的星形胶质细胞反应性活化、增生，同时内源性神经干细胞增殖分化为星形胶质细胞并迁移到损伤处，形成胶质瘢痕^[37-38]。所以，以病毒为载体介导特异性因子上调或下调星形胶质细胞相关基因，抑制星形胶质细胞反应性活化、增生，进而抑制胶质瘢痕的生成成为了治疗脊髓损伤的重要方法之一。该方法能否有效实施主要取决于病毒能否靶向转染脊髓损伤部位的星形胶质细胞，并且尽可能减少对周围正常脊髓组织的损伤。其中星形胶质细胞的特异性蛋白为胶质纤维酸性蛋白，而NF-H是神经细胞的一种特异性蛋白，因此可利用胶质纤维酸性蛋白特异性抗体、NF-H特异性抗体进行免疫化学实验来探究该方法转染星形胶质细胞和神经细胞的情况。

通过免疫荧光染色结果可以总结出，胶质纤维酸性蛋白在脊髓损伤后表达存在数量-时空关系，即胶质纤维酸性蛋白的表达主要集中在星形胶质细胞的树突之中，其表达量在脊髓损伤后开始上升，在损伤后21 d左右达到较高水平，这种现象在脊髓损伤周边部尤为明显。同时免疫组织化学荧光结果显示，病毒携带的绿色荧光蛋白仅表达于注射范围内，在注射范围外表达量微乎其微。说明经软脊膜下注射病毒这一递送方法，可将病毒的转染范围局限于损伤区域，在导管拔出过程中附于管壁带出的极少量病毒并不影响实验结果，这样既避免了鞘内注射和尾静脉注射等方法的转染范围过大这一问题，又节约了病毒用量，降低了实验成本；同时，该方法仅破坏小部分软脊膜，手术过程不会伤及脊髓，避免了脊髓损伤部位直接注射会造成二次损伤这一问题。应用2型腺相关病毒转染脊髓损伤部位的细胞也是该实验的创新点之一，经结果显示，2型腺相关病毒在3周后可稳定转染中枢神经系统的星形胶质细胞和神经细胞，无致病性和致突变性，优于传统的慢病毒。

2型腺相关病毒相较于传统的慢病毒，在损伤部位的表达量不会在短时间内突然增加，而是一个表达量逐步提高的过程，直至21 d左右才可达到对星形胶质细胞和神经细胞的高水平转染。经研究发现，脊髓损伤存在急性期和慢性期两个阶段，急性期持续时间为1周左右，在此期间，星形胶质细胞活化的主要作用是限制损伤范围的扩大，是脊髓损伤的一种保护性因素^[39-40]。而在急性期之后的慢性期，胶质瘢痕构成物理屏障会抑制轴突跨越损伤部位，阻碍轴突再生、延长和融合，使得神经无法再生修复^[41-42]。若应用重组2型腺相关病毒治疗脊髓损伤，靶向阻断星形胶质细胞中的具体信号通路来抑制胶质瘢痕的生成，恰恰是利用2型腺相关病毒较长的转染周期这一特点，较少的抑制急性期星形胶质细胞的活化，而主要抑制慢性期胶质瘢痕的生成。

近期研究发现，1型、5型、6型腺相关病毒也可被用于转染中枢神经系统细胞，但2型腺相关病毒相较于其他腺相关病毒来说，是研究较为成熟的腺相关病毒，已被广泛应用于中枢神经细胞的转染之中，而且目前已发现了较为明确的解决2型腺相关病毒载体不足和缺点的方案^[19]。对接下来的实验指导意义更大，因为构建在胶质纤维酸性蛋白启动子下携带有抑制反应性星形胶质细胞相关基因的重组2型腺相关病毒，并用此重组2型腺相关病毒转染脊髓损伤处的细胞，对病毒载体的稳定性、无致病性要求更高，而2型腺相关病毒相较于其他血清型在这些方面已经得到了较为全面的研究且符合此次实验的要求。所以，在实验中选用研究较为成熟的2型腺相关病毒，是为下一步构建胶质纤维酸性蛋白启动子下高表达目的基因的2型腺相关病毒或AAV-BBB 2.0(汉恒科技)并进行软脊膜下注射该病毒靶向抑制星形胶质细胞胶质瘢痕形成的实验打下了基础。

实验也存在一定的不足：由于条件所限，实验未对脊髓损伤21 d之后局部胶质纤维酸性蛋白的表达情况进行观察，所以严格意义上说只能保证在有限的观察期内，实验的结论是合理和有意义的，全面而有意义的结论仍有待于进一步的延长动物饲养的时间来观察和总结。其次，实验手术过程要求较为精细，比如在将18 G针头轻轻插入软脊膜下的过程中易损伤脊髓，造成脊髓的二次损伤。但临床上可通过使用更加精密且稳定性好的仪器，应用更精细的导管等多种方法来极大程度的解决二次损伤的问题。

在注射病毒溶液时速度的把握也是影响实验结果的一个重要因素。术者在进行该实验前进行过多次预实验，观察到在2 min左右完成60 μL病毒溶液的注射较为合理。这是因为需要借助病毒溶液的流速将聚乙烯导管上方一小段距离的软脊膜与脊髓分离，注射速度过慢无法达到这一效果，而注射速度过快会导致软脊膜与脊髓分离范围扩大，甚至导致软脊膜破裂。

综上所述，经软脊膜下注射2型腺相关病毒可以稳定转染脊髓损伤部位的星形胶质细胞，且不良反应小。下一步可通过研究星形胶质细胞反应性活化、增生形成胶质瘢痕的具体发生机制，构建在胶质纤维酸性蛋白启动子下携带有抑制反应性星形胶质细胞相关基因的重组2型腺相关病毒或AAV-BBB 2.0(汉恒科技)，靶向阻断星形胶质细胞中的具体信号通路来抑制胶质瘢痕的生成，实现治疗脊髓损伤的目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

脊髓损伤模型大鼠软脊膜下注射2型腺相关病毒免疫荧光染色分析

Immunofluorescence staining of adeno-associated virus type 2 after subpial injection in rat models of spinal cord injury

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