羧甲基壳聚糖温敏凝胶诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.18.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

羧甲基壳聚糖：壳聚糖是从虾、蟹中提取的海洋生物多糖，具有安全无毒性、良好的生物降解性、生物相容性、抑菌性、无抗原性等一系列优良性质，而使其广泛应用到医药、生物工程、环保、食品等领域，尤其在生物医用材料领域引起了足够的重视。壳聚糖仅能溶解在低浓度的酸性溶液中，这严格限制了它的应用。目前很多研究旨在通过改性扩大其应用范围，羧甲基壳聚糖是壳聚糖的羧甲基化产物，不仅具有壳聚糖的一切优良性质，而且具有良好的水溶性。

Notch信号通路：Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，在进化上高度保守，通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育，由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)、CSL (CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称)DNA结合蛋白、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。

背景：壳聚糖生物材料能够诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，壳聚糖衍生物羧甲基壳聚糖是否也能够诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化尚不清楚。

目的：探讨羧甲基壳聚糖温敏凝胶对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响及其可能的机制。

方法：取传至3代的大鼠骨髓间充质干细胞用不同质量浓度(0，50，100，150，200，500 g/L)羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液培养，对照组不添加羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液。MTT法检测不同质量浓度羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对骨髓间充质干细胞增殖的影响，Western blot检测150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对骨髓间充质干细胞NSE、Nestin、GAFP、Vimentin、NF-M、MAP-2、β3-tubulin以及Notch通路信号分子Notch1，Jag1表达水平的影响。

结果与结论：①羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液促进骨髓间充质干细胞增殖，在质量浓度为150 g/L时，增殖率达到最高水平；②150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶组NSE、Nestin、GAFP、Vimentin、NF-M、MAP-2、β3-tubulin的蛋白表达水平明显高于对照组，表明羧甲基壳聚糖温敏凝胶能够诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化；③羧甲基壳聚糖温敏凝胶组Notch1和Jag1的蛋白表达水平明显低于对照组，表明其在诱导分化过程中能抑制Notch信号通路的活性。

ORCID: 0000-0003-0783-1192(李振江)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 壳聚糖, 骨髓间充质干细胞, 神经细胞, 分化, 信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Chitosan biological materials can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate toward neurons. As a derivative of chitosan, carboxymethyl chitosan has a series of excellent properties. However, whether carboxymethyl chitosan can induce the neuronal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells remains unclear.

OBJECTIVE: To investigate the effect of carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons and the possible mechanism.

METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells from rats were selected and cultured in carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel extracts in different concentrations (0, 50, 100, 150, 200, 500 g/L). Control cells were cultured in culture medium with no addition of carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel extracts. MTT assay was performed to investigate the effects of different concentrations of carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel extracts on bone marrow mesenchymal stem cell proliferation. Western blot assay was used to explore the effect of 150 g/L carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel extracts on the expression of neuron-specific enolase, Nestin, Vimentin, NF-M, microtubule associated protein 2, glial fibrillary acidic protein, β3-tubulin, Notch1 and Jag1 protein.

RESULTS AND CONCLUSION: MTT assay showed that carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel promoted the cell proliferation, and the proliferation rate reached the peak at the concentration of 150 g/L. Western blot assay showed that the cells induced by 150 g/L carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel extract had significant increases in neuron-specific enolase, Nestin, Vimentin, NF-M, microtubule associated protein 2, glial fibrillary acidic protein, and β3-tubulin protein expression, and obvious decreases in Notch1 and Jag1 protein expression in comparison with the control group. These results indicate that the carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel induces rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate toward neurons, and suppresses the activity of Notch signal pathway in the process of differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Neurons, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李振江，徐晨阳，丁炳谦，魏新亭，高明，薛亚珂，刘红林. 羧甲基壳聚糖温敏凝胶诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(18): 2870-2875.

Li Zhen-jiang, Xu Chen-yang, Ding Bing-qian, Wei Xin-ting, Gao Ming, Xue Ya-ke, Liu Hong-lin.

Carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells toward neurons [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(18): 2870-2875.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞的形态刚培养的细胞呈圆形， 24 h后部分细胞开始贴壁、逐渐伸展为多种形状，有三角形、短梭形，并逐渐转变成细长梭形。培养2 d后换液，换液后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长，见图1A。4 d后细胞形态以梭形细胞为主，见图1B。6 d后细胞排列呈漩涡状，融合度达70%左右，见图1C。8 d后融合度进一步增大，细胞排列紧密，见图1D。

2.2 不同质量浓度羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液诱导后骨髓间充质干细胞形态变化采用0，50，150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液分别作用于骨髓间充质干细胞 24 h，当质量浓度为150 g/L时，可见部分细胞胞质向核回缩，呈圆形或不规则形状，有一定的立体感，细胞体积较小，细胞表面有突起，为神经元细胞。而质量浓度为0， 50 g/L时，神经元细胞特征不明显，见图2。

2.3 羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液促进骨髓间充质干细胞增殖见图3。随着羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液质量浓度的增加，细胞增殖速度加快，在质量浓度为150 g/L时，增殖率达到最高值，之后增殖率下降。结果表明羧甲基壳聚糖温敏凝胶对骨髓间充质干细胞无明显的细胞毒性，在0- 150 g/L质量浓度范围内对细胞增殖有一定的促进作用。后续实验选用150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液进行研究。

2.4 羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化传代培养的骨髓间充质干细胞加入质量浓度为150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液培养48 h后，采用Western blot检测神经细胞的标志性蛋白NSE、Nestin、GAFP、Vimentin、NF-M、MAP-2和β3-tubulin的表达水平明显提高，见图4A和B。结果表明羧甲基壳聚糖温敏凝胶能够诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。

2.5 羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液抑制Notch信号通路活性采用Western blot检测对照组和150 g/L羧甲基壳聚糖组培养 48 h后细胞中Notch1和Jag1的表达水平，见图5A和5B，相比于对照组来说，羧甲基壳聚糖组具有较低的Notch1和Jag1表达水平，这表明羧甲基壳聚糖抑制Notch信号通路的活性。

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引言

壳聚糖是从虾、蟹中提取的海洋生物多糖，具有安全无毒性、良好的生物降解性、生物相容性、抑菌性、无抗原性等一系列优良性质，而使其广泛应用到医药、生物工程、环保、食品等领域，尤其在生物医用材料领域引起了足够的重视^[1-5]。壳聚糖仅能溶解在低浓度的酸性溶液中，这严格限制了它的应用。目前很多研究旨在通过改性扩大其应用范围，羧甲基壳聚糖是壳聚糖的羧甲基化产物，不仅具有壳聚糖的一切优良性质，而且具有良好的水溶性^[6-9]。近年来，随着羧甲基壳聚糖生产工艺的日渐成熟，其在生物医用材料领域被广泛应用。许多研究已经证实修饰过的小分子壳聚糖生物材料能够诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化^[10-12]。作为壳聚糖的衍生物，羧甲基壳聚糖生物材料是否也能够诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，目前并不清楚。

骨髓间充质干细胞是除造血干细胞之外的另一种干细胞，存在于骨髓中。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定条件下可分化为成脂肪细胞、肌肉细胞、骨细胞、成软骨细胞等^[13-15]。近年来，研究报道骨髓间充质干细胞在二甲基亚砜-巯基乙醇等化学试剂的作用下能分化为神经细胞^[16]。成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞，对治疗神经退行性疾病以及修复中枢神经系统损伤具有非常重要的意义。化学诱导剂具有一定的毒性，在诱导过程中往往伴随着细胞不同程度的损伤，因此寻找安全高效的诱导剂，是细胞应用于临床治疗的前提。实验首先将羧甲基壳聚糖与β-甘油磷酸钠互配，制备出羧甲基壳聚糖温敏凝胶，观察羧甲基壳聚糖是否能诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞，探讨其中可能的作用机制。

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材料方法

1.1 设计细胞分子生物学实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至12月在河南大学淮河医院神经外科、病理科完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物成年雄性SD大鼠6只，体质量200- 250 g，由河南大学提供。

1.3.2 主要材料、试剂及仪器羧甲基壳聚糖购自青岛海生生物工程公司，批号：050706，呈原白色粉末，脱乙酰度 > 80%，相对分子质量为1×10⁵左右。DMEM培养基、DMEM/B27、胎牛血清(南京三生生物技术有限公司)；胰蛋白酶(广州市达晖生物技术有限公司)；NSE抗体、Nestin抗体、GAFP抗体、Vimentin抗体、NF-M抗体、MAP-2抗体、β3-tubulin抗体、Notch1抗体、Jag1抗体、β-Actin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗(英国Abcam公司)，一抗为鼠抗，多克隆抗体，1︰1 000；二抗1︰10 000；倒置显微镜(美国Becton Dickinson公司)；二甲亚砜、MTT(上海国药集团)；酶标仪(美国Molecular Devices公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 羧甲基壳聚糖温敏凝胶的制备称取5 g羧甲基壳聚糖加入20 mL 0.1 mol/L盐酸溶液中，搅拌溶解。称取 0.5 g β-甘油磷酸钠溶解于5 mL纯水中，在连续搅拌下，缓慢滴加入羧甲基壳聚糖溶液中，得到清澈透明的配合物溶液，再继续搅拌15 min混合均匀，备用。将装有温敏性羧甲基壳聚糖/β-甘油磷酸钠配合物溶液的试管置于30- 70 ℃水浴中，达到初始凝胶化温度后，恒温一定时间，得到羧甲基壳聚糖温敏凝胶。将羧甲基壳聚糖温敏凝胶用含体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基配制成终质量浓度分别为0，50，100，150，200，500 g/L的羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液。

1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养将成年SD大鼠麻醉处死，于无菌条件下取出股骨，清除骨周围的肌肉及结缔组织，用眼科剪剪开骨两端，插入注射器针头，小心搅动，然后吸取培养液(含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液)缓慢注入冲洗骨髓腔，收集骨髓液，离心，去上清，将沉淀重悬到细胞培养液中，接种于6孔培养板，置于体积分数为5% CO₂，37 ℃饱和湿度培养箱中进行培养，前1周不更换培养基，以后每2 d换液1次，待原代培养的细胞生长至约80%融合度时，用胰蛋白酶消化细胞，按适当比例进行传代培养。

1.4.3 倒置显微镜下观察细胞状态取传至3代的大鼠骨髓间充质干细胞，用胰酶消化后接种于24孔细胞培养板中，待细胞生长至80%融合时，去除培养基，加入不同质量浓度(0，50，150 g/L)羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液，继续培养24 h，于倒置显微镜下观察细胞生长情况，并拍照。

1.4.4 MTT法测定骨髓间充质干细胞的增殖率实验分为对照组和不同质量浓度羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液组(0，50，100，150，200，500 g/L)，每组设置5个复孔，将融合度约为80%的细胞制成单细胞悬液，以3 000个/孔的密度接种到96孔培养板中，分别培养到24 h和48 h时，每孔加20 μL MTT溶液，继续培养5 h，小心吸弃孔内培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，均匀振荡10 min，酶标仪测定490 nm波长处各孔吸光度。

1.4.5 羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液诱导骨髓间充质干细胞分化实验分为对照组和质量浓度为150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液组，细胞培养至80%融合时，更换培养基，加入质量浓度为150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液，继续培养。

1.4.6 Western blot检测相关蛋白表达水平诱导48 h后，PBS冲洗细胞，提取细胞总蛋白，检测NSE、Nestin、GAFP、Vimentin、NF-M、MAP-2、β3-tubulin以及Notch通路的信号分子Notch1，Jag1的表达水平。具体步骤：使用10%的分离胶进行电泳，于冰浴下100 V转膜2 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相对应的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，最后压片，进行显影、定影。

1.5 主要观察指标 ①不同质量浓度羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对骨髓间充质干细胞增殖的影响；②150 g/L羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对骨髓间充质干细胞分化的影响。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0软件处理，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

干细胞作为组织工程的上游研究对未来的组织器官修复与替代具有非常重要的意义^[17]。干细胞分为3种类型：第一类为全能干细胞，是来源于胚胎早期原始生殖细胞或内细胞群的细胞，例如胚胎干细胞；第二类为多能干细胞，存在于成年组织中；第三类为专能干细胞，也存在于成年组织中。胚胎干细胞具有最广阔的应用前景，但是由于自身的成瘤性和相关伦理学问题使其应用受到严重的限制。因此，成体干细胞受到了广泛关注，其中最具代表性的成体干细胞是骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能。Brazelton等^[18]和Mezey等^[19]在2000年观察到外源性骨髓间充质干细胞在小鼠脑内可转变为神经元，提示可用骨髓间充质干细胞治疗神经退行性疾病和修复中枢神经系统损伤。骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究多集中于诱导分化前后细胞形态特性、表面标志物表达的变化和诱导分化条件^[20-24]。Woodbury等^[25]使用2-巯基乙醇、丁羟回醚、2%二甲基亚砜等化学试剂作为诱导剂培养骨髓间充质干细胞，发现诱导培养0.5 h后即可检测到神经细胞特异性标志NSE的表达，5 h后即有神经干细胞特异性标志巢蛋白的表达。Sanchez-Ramos等^[26]在培养液中加入表皮生长因子和血小板源性生长因子等生长因子培养人骨髓间充质干细胞，结果有极少量的细胞分化为不成熟的神经细胞或胶质细胞。虽然化学试剂能成功诱导骨髓间充质干细胞分化成神经细胞，但是由于其本身对细胞具有一定的毒性，往往在细胞成功分化的同时伴随着不同程度的损伤。因此寻找安全高效的诱导剂，是目前的紧要任务。羧甲基壳聚糖是壳聚糖的一种衍生物，其在生物医用材料领域被广泛应用。郭苗苗等^[27]报道水溶性O-羧甲基壳聚糖止血海绵的平均止血时间较市售可吸收明胶海绵明显缩短，止血效果可靠。贺斌等^[28]报道羧甲基壳聚糖对氧化应激诱导许旺细胞凋亡具有保护作用。陈乃玲等^[29]和王丹等^[30]分别报道了羧甲基壳聚糖水凝胶诱导NIH3T3细胞和牙周膜细胞向成骨细胞分化。作者研究中发现羧甲基壳聚糖温敏凝胶对骨髓间充质干细胞无明显毒性，并诱导其向神经样细胞分化。实验又进一步探索了其诱导分化的机制。Notch信号通路进化保守，调控一些复杂高级程序以保证机体正常运行，如细胞的增殖、分化、存活和凋亡^[31-34]。有研究证实，Notch信号通路的活化状态对胚胎干细胞、神经干细胞向神经细胞分化起关键作用^[35-36]。近期也有研究表明人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中Notch通路活性降低^[37]，并且靶向抑制Notch通路能够促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化^[38]，这些结果表明Notch通路参与骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程。实验发现在羧甲基壳聚糖温敏凝胶诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中，Notch信号通路活性降低，这表明羧甲基壳聚糖温敏凝胶可能是通过抑制Notch信号通路活性诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。这些发现表明羧甲基壳聚糖温敏凝胶可作为一个安全高效的诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，为治疗神经退行性疾病以及修复中枢神经系统损伤提供了新的思路。

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