共培养方法诱导3种间充质干细胞向神经细胞分化的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.015

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2714-2721.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.015

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

共培养方法诱导3种间充质干细胞向神经细胞分化的比较

徐丽丽¹，王洪元²，李学达³，刘兵⁴，郑方芳¹，杨乃龙¹

青岛大学附属医院，¹内分泌与代谢病科，²综合部，³介入医学中心，⁴血管外科，山东省青岛市 266000

修回日期:2017-02-16 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 杨乃龙，硕士，主任医师，青岛大学附属医院内分泌与代谢病科，山东省青岛市 266000
作者简介:徐丽丽，女，1982年生，山东省日照市人，汉族，2009年青岛大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞和骨质疏松症方面的研究。并列第一作者：刘兵，男，1982年生，山东省淄博市人，汉族，2017年山东医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事血管内皮分化研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划项目(2009年第 HW027号)

Comparison of three kinds of mesenchymal stem cells differentiating into nerve cells under co-culture induction

Xu Li-li¹, Wang Hong-yuan², Li Xue-da³, Liu Bing⁴, Zheng Fang-fang¹, Yang Nai-long¹

¹Department of Endocrinology and Metabolic Disease, ²Comprehesive Department, ³Interventional Center, ⁴Department of Vascular Surgery, Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Revised:2017-02-16 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Yang Nai-long, Master, Chief physician, Department of Endocrinology and Metabolic Disease, Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Xu Li-li, Master, Attending physician, Department of Endocrinology and Metabolic Disease, Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China Liu Bing, M.D., Attending physician, Department of Vascular Surgery, Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China Xu Li-li and Liu Bing contributed equally to this work.
Supported by:
the Medical and Health Science Development Plan of Shandong Province in 2009, No. HW027

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
共培养：是人们为了建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖。细胞共培养技术是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，由于其具有更好地反映体内环境的优点，被广泛应用于现代细胞研究中。
神经元特异性烯醇化酶：是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，存在于神经组织和神经内分泌组织中。神经元特异性烯醇化酶在脑组织细胞的活性最高，外周神经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中，特别是小细胞肺癌中有过量的神经元特异性烯醇化酶表达，导致血清中神经元特异性烯醇化酶明显升高。

摘要
背景：尝试创建更加类似于人体的微环境，从而可以诱导人骨髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人脐血间充质干细胞定向分化。
目的：观察与神经细胞共培养诱导人骨髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人脐血间充质干细胞向神经细胞分化的可行性。
方法：体外分离培养人骨髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人脐血间充质干细胞，采用Transwell共培养装置建立与神经细胞共培养体系，观察3种细胞的形态变化，在共培养四五天后用免疫荧光染色方法检测3种细胞中神经元特异性烯醇化酶的表达，以单纯低糖DMEM培养基培养的间充质干细胞为对照组。
结果与结论：①3种间充质干细胞生长伸展，形成突起，并可互相形成连接。神经元特异性烯醇化酶阳性表达率：脐血间充质干细胞>胎盘间充质干细胞>骨髓间充质干细胞；②对照组中3种间充质干细胞均没有神经样形态结构，神经元特异性烯醇化酶表达阴性；③结果表明，神经细胞提供的共培养微环境对3种间充质干细胞分化为神经元均具有诱导和促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0333-9400(徐丽丽)

关键词: 干细胞, 分化, 共培养, 骨髓间充质干细胞, 胎盘间充质干细胞, 脐血间充质干细胞, 诱导分化, 神经细胞

Abstract:

BACKGROUND: Scholars have been trying to create a microenvironment similar to the human body, which can induce the directional differentiation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, placenta and umbilical cord blood.
OBJECTIVE: To compare the neuronal differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells, human placental mesenchymal stem cells and human umbilical cord blood mesenchymal stem cells induced by co-culture with nerve cells.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells, human placental mesenchymal stem cells and human umbilical cord blood mesenchymal stem cells cultured in vitro were co-cultured with nerve cells using the Transwell system. The morphological changes of three kinds of cells in the co-culture system were detected. After co-culture for 4-5 days, immunofluorescence staining was used to measure the expression of neuron-specific enolase in cells. Mesenchymal stem cells only cultured in low glucose DMEM medium were used as controls.
RESULTS AND CONCLUSION: These three kinds of mesenchymal stem cells were extended, and interconnected processes were detective. The positive expression of neuron-specific enolase was highest in the human umbilical cord blood mesenchymal stem cells followed by human placental mesenchymal stem cells and human bone marrow mesenchymal stem cells in order. In the control group, none of the three kinds of mesenchymal stem cells have neuronal morphology, and the expression of neuron specific enolase was negative for the immunofluorescence staining. To conclude, microenvironment provided by nerve cells can induce these three kinds of mesenchymal stem cells to differentiate into neurons.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Coculture Techniques, Neurons, Cell Transdifferentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

徐丽丽，王洪元，李学达，刘兵，郑方芳，杨乃龙. 共培养方法诱导3种间充质干细胞向神经细胞分化的比较[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2714-2721.

Xu Li-li, Wang Hong-yuan, Li Xue-da, Liu Bing, Zheng Fang-fang, Yang Nai-long. Comparison of three kinds of mesenchymal stem cells differentiating into nerve cells under co-culture induction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2714-2721.

图/表（结果） 2

2.1 人骨髓间充质干细胞形态 细胞在第2天时开始贴壁生长，细胞两端有较长的突起，细胞核呈卵圆形，细胞克隆样生长，集落大小不一，细胞刚开始生长较缓慢，2周时融合可达85%左右。传代之后细胞生长均匀分布，为长梭形形态(图1)，有两三天的倍增时间。经过反复传代，其纯度可超过90%。

2.2 人骨髓间充质干细胞表面标志物表达 通过流式细胞仪检测，人骨髓间充质干细胞CD44强表达，阳性率大于99%；不表达CD34，阳性率<1% (图2)。

2.3 人胎盘间充质干细胞的形态 在第7天可见少量的细胞贴壁生长，第10天可见贴壁细胞增多(图3A)，第18天可见细胞融合约75%，细胞呈梭形、圆形和不规则形等形态，并混杂其他细胞杂质，传代之后细胞生长速度显著增快，三四天可传1代。传代之后细胞形态比较均一，以长梭形、平行生长为主，也有细胞表现为火焰、漩涡状生长，第3代之后细胞的纯度显著增高(图3B)。

2.4 人胎盘间充质干细胞表面标志物表达 通过流式细胞仪检测，人胎盘间充质干细胞CD44及CD29强表达，两者阳性率均大于99%；CD34、CD106不表达，阳性率均< 1%(图4，5)。

2.5 人胎盘间充质干细胞超微结构 通过透射电镜可看到细胞为长梭形，核仁较明显，核异染色质比较少，胞浆中有扩张的微管、微丝以及粗面内质网，且可看到内质网分泌微丝；少数细胞的核质比较大，胞浆较少，胞浆中的细胞器较少，符合间充质干细胞的特点(图6)。

2.6 脐血间充质干细胞形态 细胞在第2天开始贴壁生长，细胞核呈卵圆形，细胞两端有较长的突起，克隆样生长，集落形成大小不一，细胞一开始生长较慢，2周后融合可达85%左右。细胞的形态呈多样化，如星形、小圆形、不规则形等。形态与人骨髓间充质干细胞相似，但体积较小，随着培养时间的延长，细胞的体积会逐渐变大并伸展生长(图7)。

2.7 脐血间充质干细胞表面标志物表达 通过流式细胞仪检测，脐血间充质干细胞CD44及CD29均呈强表达；CD34不表达，符合间充质干细胞的特征。

2.8 脐血间充质干细胞超微结构 通过透射电镜可见脐血间充质干细胞的细胞核呈类圆形以及不规则形，核膜清晰，核仁明显，染色质较粗且位于核膜周围。细胞质中细胞器的种类及数量众多，如微管、微丝、线粒体、粗面内质网等。通过扫描电镜可以看到在盖玻片表面贴壁生长的间充质干细胞，细胞呈长梭形，突起较长，可在细胞的表面看见微绒毛(图8)。

2.9 神经细胞形态 培养第2天，大部分神经细胞已经贴壁，胞体形态多呈纺锤形，伸出小的突起。有些细胞的胞体形态呈体积较大的扁平形，并伸出数量不等的棒状大突起，表现为胶质细胞。培养6 d后，神经细胞胞体变大，细胞呈圆形及椭圆形，胞体周围伸展延长而成为单极、双极或者多极的突起(图9)。神经元特异性烯醇化酶染色阳性。

2.10 共培养细胞形态变化

2.10.1 人骨髓间充质干细胞与神经细胞共培养结果 共培养体系中，在第3天即可观察到人骨髓间充质干细胞的形态变化，扁平的细胞缩小，胞体多呈圆形并形成较多突起，细胞形态逐渐成为星状(图10)。第4天之后星状细胞变多，并且可以互相连接，形态具有神经样特征，免疫荧光染色显示神经元特异性烯醇化酶表达阳性(图11)，阳性率平均为(32.7±11.5)%，表现为神经样细胞的特征；对照组培养约8 d后，大部分人骨髓间充质干细胞的形态仍旧扁而宽，没有形成神经样形态结构，免疫荧光染色显示神经元特异性烯醇化酶表达阴性。

2.10.2 人胎盘间充质干细胞与神经细胞共培养结果 共培养体系中，在第3天即可观察到人胎盘间充质干细胞逐渐由之前的扁平变得细长，且可以看见丝状突触，部分细胞呈星状(图12)，对照组人胎盘间充质干细胞没有显著的改变。共培养4 d后免疫荧光染色显示神经元特异性烯醇化酶表达阳性(图13)，阳性率平均(35.3±13.5)%，表现出神经样细胞特性。

2.10.3 脐血间充质干细胞与神经细胞共培养结果 共培养体系中，在第3天可见脐血间充质干细胞由之前的扁平形逐渐缩小，胞体多数呈圆形，并且形成了突起，部分细胞形态呈星状或者网格状(图14)。第6天之后星状细胞逐渐变多并互相连接，表现出神经样细胞的特征，免疫荧光染色显示神经元特异性烯醇化酶表达阳性(图15)，阳性率平均(37.5±12.7)%，具有神经样细胞的特性；而对照组脐血间充质干细胞培养第8天时，大多数细胞仍是长梭样形态，没有形成神经样的形态结构，免疫荧光染色显示神经元特异性烯醇化酶表达阴性。

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引言

骨髓间充质干细胞是一种在骨髓腔内存在的多潜能干细胞，是中胚层发育早期阶段的细胞^[1]，因具有多向分化潜能以及高度自我更新能力，被广泛运用于再生医学范畴^[2-3]。近年来有研究发现骨髓间充质干细胞可以被诱导分化为神经元样细胞^[3]。骨髓间充质干细胞能在受损的脑组织中生存、增殖、迁移及分化成神经样细胞^[4-5]。Sanchez-Ramos等^[6]发现神经营养因子Ⅴ在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中起着重要的作用，用以神经营养因子Ⅴ为基础的培养体系诱导7-14 d后，发现有骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞。Woodbury等^[7-8]发现人骨髓间充质干细胞能于体外培养存活和扩增，并且在一定条件下可被诱导分化为神经样细胞，被诱导分化的骨髓间充质干细胞可以达到80%左右。Kopen等^[9]将骨髓间充质干细胞植入新生鼠的侧脑室中，发现被移植的细胞能够广泛分布于大脑及小脑，神经元相对丰富的区域如嗅球、海马回嗅觉小岛、小脑的颗粒层也聚集了大量的移植细胞，说明干细胞移植后的存活及趋化作用很大程度上取决于移植区域的内环境。

人胎盘间充质干细胞具有向多个胚层及多种组织细胞分化的能力^[10]，Zhang等^[11]通过颈静脉、颈动脉和侧脑室植入被标记的人胎盘间充质干细胞，发现大部分迁移至海马区的人胎盘间充质干细胞可以分化成为神经元。胎盘间充质干细胞在体外如何通过定向分化诱导得到适于临床应用的神经细胞仍然是一个有待解决的关键问题。

新近研究表明脐血中同样含有间充质干细胞，具有造血支持和多向分化功能。脐血间充质干细胞与其他来源的干细胞相比免疫原性弱、采集方便、来源广泛且无伦理问题，可以作为许多疾病细胞疗法的细胞来源^[12]。最新研究表明，脐血间充质干细胞在体外培养诱导后能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，经体外培养后移植入大鼠脑内，能在体内表达神经元标志物并改善神经相关功能，这预示着用脐血间充质干细胞治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的可能性。

实验使用Transwell共培养装置建立人骨髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人脐血间充质干细胞与神经细胞共培养体系，比较3种间充质干细胞向神经细胞分化能力。

材料方法

1.1 设计 根据对照原则、随机原则、重复原则等进行完全随机设计。

1.2 时间及地点 实验于2015年10月至2016年8月在青岛大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料 ①骨髓来源于青岛大学附属医院自体干细胞移植治疗糖尿病患者10例；胎盘来源于青岛市立医院妇产科10例产妇，采集符合以下标准：足月剖宫产胎儿，胎儿无畸形，产妇无传染性疾病及遗传性疾病；脐血来源于青岛市立医院妇产科10例产妇，采集符合以下标准：足月正常分娩，无遗传性疾病及传染性疾病；神经细胞取自分娩时窒息死亡的新生儿脑组织。以上标本采集严格无菌操作。实验材料的获取均取得患者、供者或家属同意，并签署知情同意书。研究方案经过青岛大学附属医院伦理委员会批准；②主要试剂：荧光二抗、胶原酶Ⅱ(Sigma公司)；低糖型DMEM培养基(Gibco公司)；CD29、CD34，CD44(eBioscience公司)；NSE抗体(武汉博士德公司)；Transwell培养皿(Corning Costar公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离、纯化与扩增培养 在无菌条件下抽取糖尿病患者骨髓液0.5 mL，肝素抗凝后将骨髓液与1.5 mL PBS混匀，然后按1︰1的比例缓慢加入2 mL Percoll淋巴细胞分层液中，2 000 r/min离心10 min，取中间界面白膜层，PBS冲洗，1 000 r/min离心10 min，共2次，去上清，沉淀细胞加入含体积分数为5%胎牛血清的LG-DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，培养3 d后首次全量换液弃去未贴壁细胞，之后每3 d换液1次，当细胞汇合90%时胰蛋白酶消化传代培养。

1.4.2 人胎盘间充质干细胞分离、纯化与扩增培养 无菌条件下获取胎盘，取胎儿面胎盘组织并剥除羊膜、绒毛膜和蜕膜组织，用眼科剪剪碎后，加入0.1%胶原酶Ⅱ消化45 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS重悬后加入等量人淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心10 min，吸取白膜层，用体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。培养7 d后弃去未贴壁细胞，之后每三四天换液1次。当细胞汇合90%时胰蛋白酶消化传代培养。

1.4.3 脐血间充质干细胞分离、纯化与扩增培养 采集脐血标本，肝素抗凝，在2 h内分离培养脐血间充质干细胞。将脐血用PBS按1︰1比例稀释混匀，然后缓慢加入等体积的Percoll淋巴细胞分层液中，2 000 r/min离心10 min，小心吸取云雾状白膜层，即单个核细胞层。用PBS冲洗稀释后1 000 r/min离心10 min，共2次。弃上清，沉淀细胞加入体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，培养3 d后更换培养液弃去未贴壁细胞，以后每3 d换液1次。当细胞汇合90%单层细胞后，加入胰蛋白酶消化、离心，按1︰1比例传代培养。

1.4.4 细胞表面标志物鉴定 分别取3种第3代细胞，胰酶消化后调整细胞浓度为1.0×10⁹ L^-¹，每个离心管中分装0.2 mL，分别加入鼠抗人抗体CD44抗体、CD34抗体进行免疫荧光鉴定。对照组加入Fitc、PE各0.04 mL、0.02 mL，4 ℃避光反应30 min，1 500 r/min离心后加入多聚甲醛0.2 mL避光保存，应用流式细胞仪检测。

1.4.5 神经细胞的分离培养 无菌条件下取窒息死亡的新生儿脑组织，D-Hank’s液洗涤3次，于解剖显微镜下留取大脑皮质组织，去脑膜后于完全培养液中剪切、吹打，过40 μm滤网；完全培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为(5-10)×10⁵ L^-¹，接种于100 mL培养瓶中，37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养，该单细胞悬液培养24 h后有部分细胞贴壁，接种培养24 h后换液去除非贴壁细胞，可见贴壁细胞呈网络状生长；每两三天半量换液1次，5-7 d传代，免疫荧光观测神经特异性烯醇化酶的表达。

1.4.6 共培养 将第3代神经细胞按1×10⁶的密度接种于Transwell双层培养皿的底层，同时将Transwell的insert置于孔中，insert中接种间充质干细胞，insert内的培养液与6孔板中的培养液可互通融合，从而建立间充质干细胞与神经细胞的共培养体系，共同培养基为LG-DMEM；对照组Transwell双层培养皿的底层及insert内接种的都是间充质干细胞，单纯LG-DMEM培养。观察细胞形态变化及免疫荧光观测神经特异性烯醇化酶的表达。实验重复进行5次。

1.5 主要观察指标 ①3种间充质干细胞的形态及表面标志物的表达；②神经细胞形态；③3种间充质干细胞与神经细胞共培养后神经元特异性烯醇化酶表达。

讨论

CD34是选择性表达于内皮细胞及造血祖/干细胞表面的跨膜糖蛋白^[13]，而CD29、CD44为间质细胞和基质细胞表面特异的跨膜糖蛋白^[14-15]，对于调节细胞的黏附、迁移和分化等起到重要作用。CD44被看作是间充质干细胞的一个表面标志，不仅参与干细胞的归巢，而且影响干细胞的分化。因此CD44、CD34和CD29的表达可以被当作间充质干细胞的鉴定手段之一^[16-17]。实验采用流式细胞仪检测显示3种间充质干细胞CD44、CD29表达阳性，不表达CD34。

目前，人们已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用来治疗心肌梗死和骨组织缺损等疾病^[18-20]，体现了骨髓间充质干细胞具有广泛的临床治疗前景。王志勇等^[21]研究表明脑红蛋白基因修饰的骨髓间充质干细胞可为损伤脊髓及时提供稳定高水平的脑红蛋白，明显地促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。王昌铭等^[22]研究表明骨髓间充质干细胞颈内动脉移植后可透过血脑屏障明显改善血管性痴呆大鼠胆碱能系统的功能，促进缺血损伤后脑组织的修复与再生，增强学习记忆能力。陈玉玺等^[23]研究表明骨髓间充质干细胞侧脑室移植可减少局灶性脑缺血大鼠脑星形胶质细胞的形成，减轻脑损伤，具有神经保护作用，其机制可能与降低骨形态发生蛋白4的表达有关。

间充质干细胞源自于外胚层和中胚层的早期阶段，而胎盘的主体为羊膜及绒毛膜的中胚层，从而说明了胎盘中可能含有间充质干细胞。胎盘间充质干细胞在临床实践中也发挥了重要作用，它可被用于烧烫伤、心肌损伤、神经系统疾病等多种疾病的康复治疗。刘明等^[24]研究表明三维球体胎盘来源间充质干细胞移植可改善脑缺血再灌注后神经运动功能，其机制可能与下调脑组织Nogo-A及其受体NgR水平有关。丁红芳等^[25]研究表明胎盘间充质干细胞移植能够改善新生缺氧缺血性脑病大鼠的神经功能和发育，可能是通过部分上调Nrf2/ARE/ HO-1通路发挥作用。

目前将脐血间充质干细胞诱导分化为神经样细胞的研究较少，但随着临床移植医学及组织工程医学的发展，脐血间充质干细胞有生物学的优势性和来源的多样性，且包含分离简单、无伦理性、低免疫原性等众多优点，脐血间充质干细胞将成为间充质干细胞研究的热门领域^[26]。赵俊暕等^[27]研究表明在未应用免疫抑制剂的情况下，经尾静脉注射的人脐血间充质干细胞可迁移至免疫功能健全的大鼠脑创伤灶周边区，促进VEGF、VEGF-R2和VEGF mRNA表达及血管新生，利于神经功能修复。陈镭等^[28]研究表明人脐血间充质干细胞可明显改善脑创伤后神经功能的恢复，并能很好替代骨髓间充质干细胞而用于干细胞移植。颜小华等^[29]研究表明脐血间充质干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤，能有效透过血脑屏障，在病灶脑组织周围迁移、扩散、整合，移植时间选择缺氧缺血性脑损伤后1周时有良好疗效，移植治疗过程中未见植入反应和其他不良反应。

神经元特异性烯醇化酶是一种在脑神经中存在的蛋白酶，作为神经元以及神经内分泌细胞特异性识别的抗体，常被用来研究神经元发育时的生长情况，或者检测干细胞是否能诱导分化为神经样细胞，诱导的条件越理想神经元特异性烯醇化酶阳性表达率就越高^[30-32]，所以实验采用神经元特异性烯醇化酶作为检测神经细胞的指标。

共培养是利用细胞之间相互接触，创造了神经系统的微环境，该系统下细胞因子可互通，相互支持，从而促进间充质干细胞分化成为神经样细胞，间充质干细胞自身分泌的营养因子又可以更加促进神经细胞的增殖生长，比传统的化学诱导法优势明显^[33-35]。实验为了创造出更贴近人体神经系统的微环境，对传统神经细胞的分离培养方法进行了改进，分离时轻轻吹打并部分分散细胞克隆球，使细胞的机械损伤尽量减少来维持原来细胞之间的联系，发现细胞的死亡率明显下降，而且克隆球形成的速度更快。

实验尝试用Transwell装置来建立神经细胞共培养体系，这种装置为一种双层的培养皿，有直径3 μm的微孔在上下两层培养皿之间使其能够相互连通，细胞不能通过微孔，但是一些细胞的分泌物可以通过微孔，这样就可以将间充质干细胞与神经细胞共培养，利用神经细胞可能分泌的物质来诱导产生类似于人体的微环境，从而诱导间充质干细胞分化^[36-38]。

实验发现神经细胞共培养系统中的间充质干细胞形态逐渐成为星状，且星状细胞的数目逐渐增多，细胞之间可以互相连接，说明细胞表现为神经样的形态结构，免疫荧光染色显示神经元特异性烯醇化酶表达阳性。而在对照组中，单纯LG-DMEM培养的间充质干细胞没有神经样形态结构，免疫荧光染色显示神经元特异性烯醇化酶表达阴性。由此作者推断神经细胞生长过程中分泌了可以诱导间充质干细胞分化为神经样细胞的物质，由此生成的微环境能一定程度上促进间充质干细胞诱导分化为神经样细胞。在体外通过与神经细胞共培养来诱导间充质干细胞分化为神经细胞，为将来应用间充质干细胞辅助治疗神经系统疾病提供了一定的理论支持。实验结果表明，向神经细胞诱导分化的阳性率：脐血间充质干细胞>胎盘间充质干细胞>骨髓间充质干细胞，提示脐血作为神经损伤细胞疗法的细胞来源可以作为值得下一步研究的对象，为开展临床工作奠定基础。

总之，在体外通过与神经细胞共培养来诱导间充质干细胞分化为神经样细胞^[39-46]，为神经元损伤的修复带来了希望，为将来应用间充质干细胞辅助治疗神经系统疾病提供了一定的理论支持。

共培养方法诱导3种间充质干细胞向神经细胞分化的比较

Comparison of three kinds of mesenchymal stem cells differentiating into nerve cells under co-culture induction

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