稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.016

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2722-2728.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.016

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建

俞莉敏¹，马俊轩²，李继云¹，于滨生¹

¹北京大学深圳医院脊柱外科，广东省深圳市 518036；²深圳市脊柱外科重点实验室，广东省深圳市 518036

修回日期:2017-01-12 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 俞莉敏，北京大学深圳医院脊柱外科，广东省深圳市 518036
作者简介:俞莉敏，男，1976年生，江西省玉山县人，汉族，北京大学医学部博士后出站，博士，副主任医师，主要从事脊柱外科临床与基因组织工程研究。
基金资助:
广东省医学科研基金(A2014654)；深圳市科技创新委员会基金(JCYJ20150403091443319)

Construction of seed cells with the stable expression of human bone morphogenetic protein 2 gene for bone tissue engineering

Yu Li-min¹, Ma Jun-xuan², Li Ji-yun¹, Yu Bin-sheng¹

¹Department of Spine Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; ²Shenzhen Key Laboratory of Spine Surgery, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

Revised:2017-01-12 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Yu Li-min, Department of Spine Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
About author:Yu Li-min, M.D., Associate chief physician, Department of Spine Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
Supported by:
the Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, No. A2014654; Science and Technology Innovation Committee Foundation of Shenzhen City, No. JCYJ20150403091443319

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因转染间充质干细胞：通过将成骨基因导入细胞，不同于重组细胞因子的爆发性释放，可实现高活性成骨蛋白的持久稳定表达及生理性释放。其中骨髓来源间充质干细胞在成骨诱导下可分化为成骨细胞，介导骨组织的再生，将骨形态蛋白基因导入间充质干细胞，不仅可实现骨形态蛋白的持续性缓释，也提供了骨组织修复所需要的有成骨分化潜能的干细胞，采用这类稳定表达骨形态蛋白基因的干细胞促进骨组织修复，已在动物实验得到了证实。
稳定表达人骨形态发生蛋白2基因的骨组织工程种子细胞构建：实验采用微创取出的微量人肌肉组织扩增人骨形态发生蛋白2基因，构建含抗性筛选基因的真核表达载体，以利于筛选种子细胞，并且通过使用相对病毒载体具有更低免疫原性和风险性的质粒载体，转染由人骨髓分离培养来源间充质干细胞。同源基因在同源细胞内表达同源蛋白不具有免疫原性，使基因治疗结合组织工程能构建可稳定表达分泌人骨形态发生蛋白2的种子细胞，这种方法更为安全、更接近于临床转化应用。

摘要
背景：由于人与动物之间蛋白基因的非完全同源性，人源基因构建组织工程人工骨促进动物成骨或脊柱融合影响了实验验证效果。
目的：构建可稳定表达分泌人骨形态发生蛋白2的组织工程种子细胞系。
方法：以巢式RT-PCR方法从人肌肉组织中克隆人骨形态发生蛋白2基因全长基因，纯化后连接构建pcDNA3-hBMP2真核表达载体系统，实验组利用脂质体介导转染修饰人骨髓间充质干细胞，置于G418培养液中筛选培养，设定空载质粒转染细胞(阳性对照组)及正常培养细胞(空白对照组)作为对照，观察检测转染后细胞的生长增殖生物学性状；在培养48 h和3周后，行人骨形态发生蛋白2 mRNA基因表达的RT-PCR测定，人骨形态发生蛋白2蛋白表达和分泌的免疫组织化学和免疫酶斑点测定，以及转染1周后细胞成骨潜能碱性磷酸酶比活性的检测。
结果与结论：①转染人骨形态发生蛋白2基因的人骨髓间充质干细胞成簇样生长聚集，传代培养生长增殖良好，G418 筛选培养可得到抗性细胞克隆，有类似钙结节样形成，细胞增殖与两对照组无差异；②RT-PCR、免疫酶斑点及免疫组织化学检测结果检测，实验组转染48 h和3周时均能转录和表达人骨形态发生蛋白2，转染48 h的表达较3周时要高，两对照组未见有明显蛋白转录表达；③正常培养或G418筛选培养时，实验组碱性磷酸酶比活性显著高于阳性对照组、空白对照组(P < 0.01)；④结果表明，人骨形态发生蛋白2基因转染修饰的人骨髓间充质干细胞生长增殖分化等生物学活性良好，可稳定表达分泌外源转染基因人骨形态发生蛋白2。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6486-8656(俞莉敏)

关键词: 干细胞, 分化, 骨髓间充质干细胞, 骨形态发生蛋白2, 骨组织工程, 基因治疗, 质粒转染, 成骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Because of the non-homology of protein and gene between human and animals, to promote osteogenesis or spinal fusion of animals by construction of tissue-engineered bone with the human gene has influenced the experimental validation.
OBJECTIVE: To construct the seed cell line for bone tissue engineering with stable expression of human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2).
METHODS: The full-length hBMP2 gene was cloned from human muscle tissues by nested RT-PCR and transfected to human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) with lipidosome. The transfected hBMSCs were cultured with G418 in vitro to screen and purify the cells. A series of analyses such as RT-PCR, dot-ELISA, immunohistochemstry and alkaline phosphatase activity analysis were performed to evaluate the situation of hBMP2 expression and secretion at 48 hours and 3 weeks after the transduction. hBMSCs transduced with empty plasmid and the normal hBMSCs served as positive control and blank control groups, respectively, which were used for observation of cell growth, proliferation and biological characteristics of transfected cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The transfected hBMSCs appeared in small groups or clusters, and had a good proliferation after subculture in vitro. Some G418-resistance cell clones and calcium nodules were found when cultured with G418 in vitro. No significant difference was noted in the cell proliferation between the hBMP2 transfection group and two control groups. The ALP activity in the hBMP2 transfection group remained significantly higher than that in the two control groups (P < 0.01). At 48 hours and 3 weeks after transduction, hBMSCs could express actively hBMP2 by RT-PCR monitoring, and had a positive reaction of dot-ELISA and immunohistochemical analysis. The expression of hBMP2 gene in the experiment group at 48 hours was significantly higher than that at 3 weeks after transduction while there was no expression of hBMP2 gene in the two control groups. The above results show that the hBMSCs transfected by hBMP2 gene not only have potentials of normal proliferation and osteogenic differentiation, but also can stably express hBMP2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Bone morphogenetic proteins, Gene Therapy, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

俞莉敏，马俊轩，李继云，于滨生. 稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2722-2728.

Yu Li-min, Ma Jun-xuan, Li Ji-yun, Yu Bin-sheng. Construction of seed cells with the stable expression of human bone morphogenetic protein 2 gene for bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2722-2728.

图/表（结果） 1

2.1 人骨髓间充质干细胞的分离培养 经梯度离心分离的细胞5-8 d后逐渐形成分散的成纤维细胞集落状，传代细胞迅速贴壁均匀性生长，三四天铺满瓶底；成骨诱导条件培养时，向多角型细胞转化，具有多个胞浆突起，逐渐形成散在致密岛状细胞结构。流式细胞仪分析显示见图1，CD29表达为93.43%，CD44为87.66%，CD34为4.40%，CD45为5.19%，符合骨髓间充质干细胞的特性。2周后250 mg/L及以上质量浓度的筛选组里，正常细胞全被杀死。确定250 mg/L的G418为转染后细胞的筛选质量浓度。

2.2 人骨形态发生蛋白2的扩增及其真核表达载体的构建 设计内外两对引物以巢式RT-PCR方法从成人肌肉组织内扩增出1 188 bp的人骨形态发生蛋白2全长cDNA基因，通过T-A克隆插入pUCmT载体中，测序结果显示人骨形态发生蛋白2全长的碱基对序列与Genebank文献报道完全相符。将pUCmT-hBMP2质粒以Hind Ⅲ和XbaⅠ两种内切酶双酶切后与pcDNA3.0载体相连接，构建pcDNA3.0- hBMP2的真核表达载体系统，再次经双酶切DNA电泳证实成功构建了pcDNA3.0-hBMP2的真核表达载体系统(图2)。

2.3 转染后的细胞生物学性状观察 实验组细胞多成簇样生长聚集(图3A)，传代培养生长增殖良好，部分钙结节样变化形成，经G418 筛选2周后得到了抗性的细胞克隆(图3B)，而阳性对照及空白对照组细胞未见明显钙结节样变化形成，其中阳性对照细胞在G418筛选液培养2周仍有存活生长，而空白对照组在G418筛选培养1周就全部死亡，证明实验组和阳性对照组的真核基因载体转染人骨髓间充质干细胞成功。

2.4 MTT法检测细胞生长增殖情况 实验组、阳性对照组及空白对照组之间细胞A值无明显差异(P > 0.05)，细胞生长曲线在第1天稍减，随后增殖至第4天高峰，又逐渐趋向平稳。而转染后G418筛选组A值则一直下跌，第4天达到低谷后逐渐少量增殖上升，维持稳定增殖，见图4。

2.5 各组RT-PCR及dot-ELISA检测结果 从RT-PCR检测结果分析，48 h和3周的实验组均能转录和表达人骨形态发生蛋白2，即在约1 188 bp位置上出现了明显条带，相对3周时的电泳条带，48 h的条带稍微较其更亮，检测系统的灰度统计也说明了转染后人骨形态发生蛋白2瞬时的RNA转录及表达较3周时表达量要高；而空白对照组及阳性对照组未见有明显蛋白转录(图5)。

转染细胞分泌人骨形态发生蛋白2蛋白的dot-ELISA测定，48 h后转染实验组相对于阳性对照组及空白对照组为免疫阳性结果，而3周后转染实验组仍维持阳性结果，但免疫显色较48 h后的结果为淡。

免疫组织化学染色显示，实验组人骨形态发生蛋白2转染细胞筛选培养后成簇样生长并形成类似钙结节，经培养48 h和3周后，细胞质内均出现强阳性表达棕色颗粒样结果(图6)，空白对照组及阳性对照组均未见阳性表达。

2.6 各组细胞碱性磷酸酶比活性比较 正常培养1周时，实验组、阳性对照组及空白对照组细胞的碱性磷酸酶比活性分别为(0.43±0.02)，(0.22±0.02)，(0.24±0.01) U/mg，实验组明显高于其余两组(P < 0.01)；经G418筛选培养1周时，除空白对照组细胞被全部杀死外，实验组碱性磷酸酶比活性为(0.77±0.03) U/mg，明显高于阳性对照组的(0.25±0.01) U/mg，(P < 0.01)。

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引言

骨再生修复需要在特定的时间内局部释放足量的骨诱导因子，同时需要大量细胞对这些诱导因子产生生物应答，从而促进骨形成^[1]。自从20世纪60年代Urist^[2]在脱矿骨基质中发现骨诱导有效物质骨形态蛋白以来，重组骨形态蛋白已被广泛应用于骨再生治疗^[3-6]，其中重组骨形态蛋白2是临床应用最为广泛、效果最为明确的骨再生诱导制剂^[7-8]。重组人骨形态蛋白类的骨诱导因子在临床已被广泛应用，然而其可控性释放难以实现^[9]，重组蛋白的爆发性释放可导致炎症、肿胀、组织异化变性及坏死等并发症，严重限制了其临床应用^[10-11]。

基因治疗通过将成骨基因导入细胞，不同于重组细胞因子的爆发性释放，可实现高活性成骨蛋白的持久表达及释放^[12]。其中骨髓来源间充质干细胞在成骨诱导下可分化为成骨细胞，介导骨组织的再生^[13]，将骨形态蛋白基因导入间充质干细胞，不仅可实现骨形态蛋白的持续性缓释，也提供了骨组织修复所需要的有成骨分化潜能的干细胞，采用这类稳定表达骨形态蛋白基因的干细胞促进骨组织修复，已在动物实验得到了证实^[14-16]。这些实验研究多集中在人或动物成骨基因修饰的动物(如鼠、兔子、猴子等)细胞，构建组织工程人工骨促进动物成骨或脊柱融合，但由于人与动物之间蛋白基因的非完全同源性，影响了实验验证效果。并且基因转染实验多数使用有着较好转染效率的病毒载体^[17-18]，其在体内使用可出现内源性病毒重组、诱发免疫排斥和基因蛋白的长期失控表达等潜在的风险及并发症^[19]。实验以重组骨形态蛋白2为目的基因，人骨髓间充质干细胞为载体细胞，通过构建pcDNA3-hBMP2真核表达载体，以非病毒载体脂质体质粒介导转染人骨髓间充质干细胞，建立可稳定表达重组骨形态蛋白2的有限种子细胞系。该种子细胞系能同时提供生理性的重组骨形态蛋白2成骨因子和骨前体细胞，并且干细胞及骨形态发生蛋白基因均来源于人自体组织，防止非同源基因蛋白在体内表达引发的免疫反应。非病毒载体质粒转染引发的免疫反应较轻，导入基因的表达为非永久性表达，相对具有更高的安全性和临床转化应用价值^[20]，在一定程度上解决了目前骨科组织工程基因治疗向临床转化中存在的问题。

材料方法

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年8月在北京大学深圳医院中心实验室及深圳市脊柱外科重点实验室完成。

1.3 材料

人肌肉组织及骨髓标本：取自需行骨科手术取髂植骨患者的微量(约0.3 g)肌肉组织及5 mL骨髓，符合伦理审核要求且均获供者知情签字同意，收集标本后立即处理。

主要试剂与仪器：DMEM、β-甘油磷酸钠(美国GIBCO)；新生牛血清、二甲基亚砜、percoll淋巴细胞分离液、λDNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ Marker (上海，华美)；胰蛋白酶、噻唑蓝MTT(美国AMRESCO)；十二烷基磺酸钠SDS、N，N，N，N-四甲基乙二胺TEMED、Tris碱(美国BioRad)；地塞米松，抗坏血酸、抗CD29、CD34、CD44、CD45抗体(美国Sigma)；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗、多聚赖氨酸、兔抗hBMP2一抗及DAB显色试剂盒、免疫组织化学SABC染色试剂盒(武汉Boster)；细胞碱性磷酸酶CAKP染色试剂盒、碱性磷酸酶活性测定试剂盒及蛋白总量CBBG250测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；质粒DNA小量纯化试剂盒、DNA清洁试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物clean up试剂盒(杭州Vitogene)；uniq-10柱式Trizol总RNA抽提盒、EDTA 、Triton-X100(上海Sangon)；M-MML Reverse Transcriptase First-Strand cDNA synthesis试剂盒、Pfu DNA Polymerase、DEPC-H₂O及RNase-free tube、脂质体Lipofectamine^TM(美国GibcoBRL-Life Technologies)；限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ及其酶缓冲液、dNTP、MgCl₂、Taq DNA聚合酶、T₄DNA连接酶及其缓冲液、100 bp DNA marker、低分子量蛋白marker(美国MBI )；DH5α大肠杆菌及原核表达载体PBV220、真核表达载体pcDNA3、Trizol Reagent总RNA抽提试剂盒(美国Invitrogen)；3S 100 bp DNA ladder、250 bp plus DNA ladder 、PCR 产物添A试剂盒(上海Shenergy Biocolor)；G418(美国Promega)；聚已二醇PEG6000(上海化学试剂二厂)；倒置相差显微镜(奥林巴斯LK40日本)；Bio-Rad 凝胶成像系统(BioRad公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学特性检测 从需行骨科手术取髂植骨的自愿捐髓者中抽取骨髓，加入到Percoll淋巴细胞分离液中梯度离心分离，以含体积分数20%血清的DMEM培养基进行常规培养，部分细胞以含地塞米松10^-⁸ mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸50 mg/L的DMEM培养基进行成骨诱导培养，倒置显微镜逐日观察细胞形态特点及生长情况，并以MTT法在波长490 nm的酶联免疫检测仪上，测定光吸收A值作细胞的生长曲线分析，流式细胞仪分析细胞表型CD29、CD34、CD44、CD45抗体表达，并适时传代备用。

将分离培养的人骨髓间充质干细胞分别加入100，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，0 mg/L的418及含体积分数20%血清的DMEM培养基进行筛选培养，每天倒置显微镜下观察细胞的生长情况，至2周时，以全部细胞被杀死的最低浓度为后面实验转染细胞的G418筛选质量浓度。

1.4.2 人骨形态发生蛋白2全长cDNA的扩增及其真核表达载体的构建 先根据人骨形态发生蛋白2蛋白全长cDNA的1 188 bp序列(1 188 bp加上ATG起始密码子)，设计2对引物，其中内引物序列两端分别引入启动子和终止子及上游酶切位点Hind Ⅲ和下游酶切位点XbaⅠ。内引物如下：上游引物fwd，5’gac aag ctt atg gtg gcc ggg acc cgc tgt c 3’，下游引物rev，5’gac tct aga cta gcg aca ccc aca acc ctc c 3’；外引物如下：上游引物UP，5’ GCG TGC TTC TTA GAC GGA CT 3’，下游引物DOWN，5’TGC TGT ACT AGC GAC ACC CA 3’。

然后抽提成人肌肉组织内总RNA，应用M-MLV RT合成cDNA的第一链，与Pfu酶、dNTP mix及内外引物，行巢式RT-PCR反应，扩增人骨形态发生蛋白2基因^[21]。将PCR产物行T-A克隆连接入pUCmT质粒，转化DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆菌落作序列测定。将测序确认连接成功的pUCmT- hBMP2质粒和pcDNA3.0载体质粒分别行核酸内切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ的双酶切反应，电泳回收纯化pcDNA3.0空载体质粒和人骨形态发生蛋白2全长基因片段。在T₄DNA ligase的作用下，14 ℃左右进行连接反应过夜。连接液再行转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取数个转化的阳性克隆菌落，接种振荡培养后，抽提质粒，双酶切电泳鉴定。

1.4.3 脂质体介导pcDNA3-hBMP2转导人骨髓间充质干细胞 实验组在含4×10⁵/孔的6孔培养板中，每孔加入以DMEM稀释的DNA和脂质体Lipofectamine 的混和物400 µL，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，孵育培养细胞和DNA-Lipofectamine复合物8 h。在转染8 h后，不去除转染液，而加入1 mL含双倍正常血清浓度的完全培养基继续培养。转染18 h后，以正常完全培养基为细胞完全换液。转染实验的同时，建立脂质体加空pcDNA3.0质粒载体组为阳性对照组，同代细胞正常培养为空白对照组。

1.4.4 细胞生物学性状观察与碱性磷酸酶比活性测定 取上述转染实验的3组细胞，以250 mg/L G418培养基进行筛选培养，倒置相差显微镜每天观察细胞形态和生长情况，筛选培养细胞备用。然后在24孔培养板中，分别以正常培养和G418筛选培养1周后，经PBS漂洗3次后，加0.1%Triton-X100细胞裂解液、缓冲液、碱性磷酸酶基质液及显色剂后，于紫外分光光度计520 nm处测定吸收值A，行碱性磷酸酶比活性测定。碱性磷酸酶比活性=碱性磷酸酶活性/总蛋白含量，实际以公式：碱性磷酸酶比活性≈碱性磷酸酶活力测定管的A值×总蛋白含量标准管的A值/碱性磷酸酶活力标准管的A值×总蛋白含量测定管的A值来计算。

1.4.5 细胞的免疫组织化学染色观察 取上述转染实验3组细胞的第2批，进行筛选培养后消化，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，以2 mL/孔加入6孔培养板中多聚赖氨酸浸泡过的盖玻片上，6 h后细胞爬片贴壁，接着正常培养48 h和3周后，分别行细胞表达和分泌人骨形态发生蛋白2蛋白的免疫组织化学染色，倒置显微镜观察以细胞胞浆呈棕黄色着色为阳性。

1.4.6 细胞表达人骨形态发生蛋白2的RT-PCR及免疫酶斑点(dot-ELISA)检测 取上述转染实验3组细胞的第3批，培养48 h后和3周后，先吸取细胞培养上清，在半透膜和聚已二醇6000的透析作用下，浓缩上清内蛋白，在硝酸纤维膜上行dot-ELISA测定，结果可根据有无显色反应判断结果为阳性或阴性。然后弃培养液，分别提取各组细胞总RNA，行RT-PCR后电泳，BIO-RAD凝胶成像系统观察电泳胶结果，测定瞬时(48 h)和稳定(3周)的转染基因人骨形态发生蛋白2 mRNA表达量。

1.5 主要观察指标 转染后细胞的生长增殖生物学性状、人骨形态发生蛋白2蛋白表达和分泌及碱性磷酸酶比活性检测。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(LSD检验)，两两比较采用t 检验；检验水准α=0.05。

讨论

骨的修复和融合过程是一个复杂而高度有序的过程，这期间需要能分化的骨前体细胞和足量的成骨诱导因子2个基本要素的系统性参与和协调作用，最终在待修复局部形成新骨融合。目前国内外临床为促进骨修复和脊柱融合，应用较多的是自体骨、同种异体骨和异种骨移植及原核表达重组成骨蛋白。然而自体骨的有限性、供骨区并发症，异体和异种骨的免疫原性，都在临床应用上产生了较大限制。成骨蛋白的原核和真核表达都已得到认同，但其各自在活性及产量上的缺陷，在外源给药方法、持续时间及药效浓度维持等方面的不确定性，加上重组蛋白的异化致炎性和释放不可控性，都是临床应用所必需面对的难题^[22]。而基因治疗通过将成骨基因导入细胞，不同于重组细胞因子的爆发性释放，可实现高活性成骨蛋白的持久表达及释放。目前国内外学者研究多集中在人或动物成骨基因修饰的动物(如鼠、兔子、猴子等)细胞，构建组织工程人工骨促进动物成骨或脊柱融合的实验研究，但由于人与动物之间蛋白基因的非完全同源性，影响了实验验证效果。基因组织工程骨进行下一步临床试用的前提，必须是由人类基因修饰表达的人类细胞构建成的组织工程人工骨，才能应用于临床人类自身。

实验以骨科及脊柱外科临床应用为目标，采用扩增于人肌肉组织的人骨形态发生蛋白2基因，通过质粒真核表达载体转染人骨髓间充质干细胞，构建一种可生理性分泌人骨形态发生蛋白2的可分化间充质干细胞作为组织工程种子细胞系，该细胞本身可在自身分泌的人骨形态发生蛋白2诱导作用下进一步分化成成骨细胞，并且还能通过分泌到胞外的人骨形态发生蛋白2，诱导周边未转染间充质细胞向成骨分化。实验中的免疫组织化学染色结果和RT-PCR检测结果，均显示了培养48 h和3周的转染细胞胞浆内均有人骨形态发生蛋白2蛋白表达，阳性对照组及空白对照组细胞未见人骨形态发生蛋白2表达。而dot-ELISA实验是一种能对细胞分泌于膜外、培养上清内的蛋白进行检测的常用方法，其灵敏度可达ng水平。实验从转染细胞的培养上清中检测出了人骨形态发生蛋白2蛋白的表达，而阳性对照组及空白对照组细胞显示了阴性结果，这充分证明了转染后的细胞能表达且分泌人骨形态发生蛋白2蛋白。由真核细胞直接分泌人骨形态发生蛋白2，无需提纯和复性等工序，具有相对重组人骨形态发生蛋白2更高的活性，与此同时人骨形态发生蛋白2可由细胞持续分泌，其作用剂量更接近生理调控剂量，相对于重组人骨形态发生蛋白2应用时的爆发性释放具有更高的安全性^[23]，能避免重组生产和外源应用蛋白的诸多不利因素。实验构建的基因修饰骨种子细胞能实现成骨因子缓释的同时，提供足量可诱导成骨分化的骨前体细胞，满足骨再生修复的基本要素，能较完美解决以上困扰和不足，利于基础实验成果向临床应用转化，促进骨再生修复。

基于人骨形态发生蛋白2的基因治疗用于骨缺损的修复已得到大量实验验证，然而基因治疗的临床转化仍面临较大挑战，其中首要问题就是安全问题，包括病毒基因载体的免疫反应、病毒感染、转染外源性基因细胞的排斥以及外源性基因的表达失控等^[24]。研究采用脂质体介导质粒转染人骨髓间充质干细胞，脂质体是应用简便、细胞毒性低的转染介质，其内脂双分子层组成的环状封闭囊泡可以和DNA形成脂类-DNA的复合物，通过胞饮内吞的方式进入细胞，从而使外源基因插入真核细胞基因组而获得表达^[25]。脂质体介导的基因转染中，外源基因并不与宿主细胞的基因组染色体相整合，存在随着时间的推移外源基因丢失的情况^[26]，在表达分泌了成骨因子后，相对病毒载体，避免了体内基因失控性和无限期表达具有更多的风险及并发症，因此脂质体质粒作为基因治疗载体具有更为明显的安全性和优越性^[20^，^27]。虽然转染效率稍低，但通过RT-PCR分析、dot-ELISA实验及免疫组化染色等证实：在48 h和3周后转染人骨形态发生蛋白2细胞能瞬时(48 h)及稳定(3周)地转录表达并且分泌人骨形态发生蛋白2基因蛋白。而两对照组的3种实验均为阴性结果，3周时，临床骨愈合过程正处于血肿机化炎症期向骨痂形成期发展，正是最需要成骨因子和骨前体细胞向成骨细胞和成软骨细胞转化时，仍能稳定表达成骨基因，也就能有效促进骨再生。

基因治疗的关键步骤就是目的基因片段的设计扩增、验证、纯化和基因真核表达系统的构建，这些步骤决定了目的基因修饰的种子细胞能否成功构建和纯化。真核蛋白在真核细胞中的表达一般均以其蛋白基因编码的特性为根据。实验所表达构建1 188 bp 的人骨形态发生蛋白2基因，包含有69 bp的信号肽、777 bp的中间前肽及342 bp的成熟肽的，是个能表达分泌到胞外的、功能性的蛋白基因的完整序列^[9]。虽然细胞表达基因蛋白的影响因素比较多且不稳定，但此次实验设计应用RT-PCR、免疫酶斑点(dot-ELISA)检测及免疫组织化学染色法能粗略地对基因序列RNA转录水平进行半定量及定性检测。实验选用构建的真核表达载体系统pcDNA3-hBMP2同时编码有Ampr和Neor基因，利用载体内的Ampr抗性基因，能在氨苄青霉素(Ampicilin)中筛选转化成功的大肠杆菌菌株，克隆并扩增目的基因。利用Neor抗性基因的表达，可在G418等新霉素类药物中培养筛选转染成功有抗性基因载体的人骨髓间充质干细胞种子细胞。实验中先通过对正常人骨髓间充质干细胞的全部被杀死的最小药性浓度，确定转染后G418筛选质量浓度为250 mg/L。在此种浓度下，培养2周以上，仍能存活的细胞克隆被认为是转染成功的、能表达Neor抗性基因和人骨形态发生蛋白2目的基因的人骨髓间充质干细胞。实验发现，实验组细胞在增殖生长方面与空白对照组几乎无差别，转染后G418的筛选纯化使细胞数量急剧减少，约只占非筛选组细胞的30%左右。筛选成功后，去除G418正常培养，转染筛选后细胞数量上较少，但仍能保持良好的增殖能力。

外源性人骨形态发生蛋白2能够促进细胞所需功能的增强比如碱性磷酸酶活性，诱导细胞成骨分化，促进骨组织再生，这得到了大量既往研究的证实^[8^，^28]。细胞分化过程与细胞增殖密切相关，当细胞去分化时，细胞功能受到抑制而增殖更加活跃；当细胞高度分化时，处于合成分泌特殊物质(蛋白质和酶)的状态，细胞的功能被充分表达出来，而其增殖活性受到抑制^[29]。实验中利用MTT比色检测发现，转染细胞的增殖变慢，但代表细胞成骨分化标志的碱性磷酸酶比活性明显增高，这也就说明转染后细胞能分泌目的基因，向成骨分化的功能加强，而同时其增殖活性受到部分抑制，这也同样符合构建基因种子细胞的初始目的，也就是同时实现成骨因子缓释和提供可诱导成骨分化的骨前体细胞，满足骨再生修复的基本要素。

来自于外源性基因表达产物、基因载体及干细胞的免疫原性是组织工程及基因治疗临床转化的重要障碍^[30-31]。实验考虑以骨科临床转化使用为最终目的，通过一系列实验设计操作的优化来降低此类风险。实验采用微创取出的微量人肌肉组织扩增人骨形态发生蛋白2基因，构建含抗性筛选基因的真核表达载体，以利于筛选种子细胞，并且通过使用相对病毒载体具有更低免疫原性和风险性的质粒载体，转染由人骨髓分离培养来源间充质干细胞。同源基因在同源细胞内表达同源蛋白不具有免疫原性，使基因治疗结合组织工程能构建可稳定表达分泌人骨形态发生蛋白2的种子细胞，这种方法更为安全、更接近于临床转化应用。当然，如何避免基因经质粒转染细胞随着时间的推移表达人骨形态发生蛋白2蛋白逐渐减少，以及如何建立更为安全稳定有效的基因修饰的种子细胞，以构建组织工程骨转化临床应用，还需要进一步更加深入的研究。

稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建

Construction of seed cells with the stable expression of human bone morphogenetic protein 2 gene for bone tissue engineering

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