1.1 设计 体外细胞实验，包括间充质干细胞的质量研究(细胞形态、表型、倍增时间、成骨成脂分化能力)，功能研究(免疫调节功能及抗炎功能)及转录组学分析。
1.2 时间及地点 实验于2021年10月至2022年4月在天九再生医学(天津)科技有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 脐带 脐带由健康产妇分娩后自愿捐赠，由天津市第五中心医院提供。脐带采集前孕妇均进行免疫四项(HBV、HCV、HIV、梅毒标志物)检测且结果为阴性；研究内容经天津市第五中心医院伦理委员会审定通过(WZX-EC-202112)，所有捐献者均签署知情同意书。
1.3.2 实验试剂 间充质干细胞培养基(友康)；胰蛋白酶(Gibco)；OptiVitro® 间充质干细胞成脂分化培养基(依科赛)；间充质干细胞成骨分化培养基(BI)；1%结晶紫乙醇溶液、CFSE、植物血凝素M(Thermo)；油红O异丙醇饱和液(索莱宝)；0.2%明胶溶液(Sigma)；FITC抗人CD73抗体、FITC抗人CD90 (Thy1)抗体、FITC抗人CD105抗体、PE抗人CD11b抗体、PE抗人 CD19抗体、PE抗人CD34抗体、PE抗人CD45抗体、APC抗人HLA-DR抗体、PE抗人CD127(IL-7Rα)抗体、APC抗人CD4抗体、PerCP/Cyanine5.5抗人CD25抗体(Biolegend，美国)；肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒、白细胞介素10 ELISA试剂盒(依科赛，中国)。
1.3.3 实验仪器 多功能酶标仪(BioTek，德国)；流式细胞仪(贝克曼，美国)；倒置光学显微镜(Leica，德国)；荧光细胞计数仪(Countstar，中国)；生物安全柜(海尔，中国)；二氧化碳培养箱(ESCO，新加坡)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离 将来源于自愿者捐献的脐带从采集瓶中取出，浸泡于体积分数为75%乙醇中两三分钟；使用DPBS清洗脐带后置于无菌平皿中，去除脐带两端后，去除羊膜层及血管，将剩余脐带华通氏胶置于50 mL离心管或玻璃烧杯中，用DPBS洗涤直至没有血迹，将其尽量剪碎并混合均匀，平铺至平皿中。将培养皿置于体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中培养4 h，加入适量间充质干细胞培养基刚刚覆盖皿底即可，继续培养4 d半量补液，之后约3 d半量换液，之后每3 d更换1次培养液。当上述原代细胞达到50%融合时，进行传代培养。
1.4.2 炎性因子预处理人脐带间充质干细胞 选择生长状态良好的第5代人脐带间充质干细胞，DPBS洗涤后加入适量消化酶，室温消化5 min，加入5 mL 间充质干细胞完全培养基终止消化，收集细胞并离心，弃上清液，用适量间充质干细胞培养基重悬细胞，充分混匀后计数；按照细胞密度10 000个/cm2将人脐带间充质干细胞铺至T75瓶中，体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中培养48 h后添加不同质量浓度(0.1，1，5，25 ng/mL)肿瘤坏死因子α预处理24 h，消化并收获细胞开展质量及功能性实验，同时以无任何因子预处理的人脐带间充质干细胞作为对照组。
1.4.3 人脐带间充质干细胞的免疫调节能力 将外周血单个核细胞(购买于妙顺生物科技有限公司)重悬于5 μmol/L CFSE溶液中，置于37 ℃水浴锅避光孵育20 min。孵育结束后，加5倍体积含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37 ℃孵育10 min以终止染色，400×g室温离心10 min，弃上清，加含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液重悬，取6×105细胞进行流式检测确定实验处理前外周血单个核细胞群。
按照6×104个/孔的密度分别将未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞接种于24孔板中，用间充质干细胞培养基培养过夜，弃掉孔内上清，实验组各孔加入1 mL CFSE标记的外周血单个核细胞悬液(3×108 L-1)及2 μL 0.5 mg/mL 植物凝集素M，阴性组为空白孔内加入1 mL CFSE标记的外周血单个核细胞悬液(3×108 L-1)，阳性组为空白孔内加入1 mL CFSE标记的外周血单个核细胞悬液(3×108 L-1)，同时每孔添加2 μL 0.5 mg/mL植物血凝素M，培养5 d后，收集各组外周血单个核细胞悬液，400×g室温离心5 min，弃上清，用300 μL DPBS重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测CFSE阳性外周血单个核细胞占比，流式检测按照阴性组设门，统计阳性组及实验组的增殖细胞比例。淋巴细胞增殖抑制率=(阳性组增殖细胞比例-实验组增殖细胞比例)/(阳性组增殖细胞比例-阴性组增殖细胞比例)×100%。
按照6×104个/孔的密度分别将未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞接种于24孔板中，用间充质干细胞培养基培养过夜，弃掉孔内上清，实验组各孔加入1 mL外周血单个核细胞悬液(3×108 L-1)，阴性组为空白孔内加入1 mL外周血单个核细胞悬液(3×108 L-1)，阳性组为空白孔内加入1 mL CFSE标记的外周血单个核细胞悬液(3×108 L-1)，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h。收集孔内外周血单个核细胞悬液，400×g室温离心5 min，弃上清，每管加入100 μL的DPBS重悬细胞，对表面标志物CD127，CD4，CD25进行流式染色，流式细胞仪检测得出CD4+/CD25+/CD127-(Treg)细胞群占比，观察人脐带间充质干细胞对Treg增殖的促进作用，即促进效率=(实验组Treg百分比-阴性组Treg百分比)/阴性组Treg百分比×100%。
1.4.4 人脐带间充质干细胞的抗炎功能 按照5×104个/孔的密度分别将未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞接种于24孔板中，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养过夜。按照5×105个/孔的密度将外周血单个核细胞接种于24孔板中，同时添加1 ng/mL脂多糖刺激，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h。收集孔内培养液上清，400×g离心5 min去除沉淀。用肿瘤坏死因子α及白细胞介素10 ELISA 试剂盒检测上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平。
1.4.5 人脐带间充质干细胞表面标志物检测 分别消化生长状态良好的未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞，按照计数结果移取1×106个细胞至离心管，400×g离心5 min，弃去上清液，加入0.9 mL DPBS重悬并分为9份，分别加入流式抗体或相应的同型对照抗体，充分混匀各管，避光室温孵育30 min，抗体名称见表1；待孵育结束，向各管中加入1 mL DPBS，混匀细胞，400×g离心5 min，弃去上清液，向每支管中加入300 μL DPBS重悬细胞，流式细胞仪上机分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达。
1.4.6 人脐带间充质干细胞的增殖活性 按照细胞密度1×104个/cm2将未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞铺至T75瓶中，体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中培养48 h；使用DPBS洗涤细胞后，加入TrypL Express消化酶室温消化5 min，加入5 mL 间充质干细胞完全培养基终止消化，收集细胞并离心，弃上清液，用适量间充质干细胞培养基重悬细胞，充分混匀后计数。倍增时间(TD)=t×log2/logNt-logN0，其中t：培养时间(h)，N0：接种后起始细胞数；Nt：培养t小时后的细胞数。
1.4.7 人脐带间充质干细胞的成骨、成脂分化能力 按照细胞密度为1.5×105个/孔分别将未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞接种至0.2%明胶溶液预包被的12孔板中，体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中培养至细胞融合率90%(约2 d)以上开始成骨诱导分化，每孔加入1.5 mL成骨诱导分化培养基，每三四天换液1次，细胞诱导至21 d左右时，使用40 g/L多聚甲醛1 mL室温固定10 min，DPBS润洗1次，每孔加入1 mL 茜素红S染液，室温染色10 min，DPBS洗涤1次，加入0.5 mL DPBS，置于显微镜下观察拍照。
按照细胞密度为1.5×105个/孔将未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞接种至0.2%明胶溶液预包被的12孔板中，体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中培养至细胞融合率90%(约2 d)以上开始成脂诱导分化，每孔加入1.5 mL成脂诱导分化培养基，每三四天换液1次，诱导至30 d左右时，使用1 mL 40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，DPBS润洗1次，每孔加入0.9 mL油红O染色液，室温染色15 min，DPBS洗涤1次，加入0.5 mL DPBS，置于显微镜下观察拍照。
1.4.8 人脐带间充质干细胞的转录组测序 收集第7代未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞约5×106个，DPBS洗涤后加入1 mL Trizol试剂提取RNA，并使用DNase I消化总RNA后使用Oligo(dT)磁珠进行富集，打断mRNA，使用随机引物并进行cDNA一链的合成，使用dUTP代替dTTP合成cDNA二链，末端修复后加入“A”接头连接并进行PCR反应，用UDG酶消化带U标记的第二链模板进行PCR扩增及回收，文库质量检测后进行PCR产物环化，最终上机检测。
对测序获得的数据进行对比及基因定量分析，并根据表达量进行差异表达分析，对筛选的差异表达基因进行GO功能分析、KEGG通路功能分析、聚类分析。
1.5 主要观察指标 ①未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞的细胞形态及表型；②未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞的免疫调节能力、抗炎能力和成骨、成脂分化能力；③未预处理人脐带间充质干细胞及1 ng/mL肿瘤坏死因子α预处理人脐带间充质干细胞的转录组分析。
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行分析，实验数据以x±s表示，进行t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
