不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特性

doi:10.12307/2023.392

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (15): 2318-2324.doi: 10.12307/2023.392

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特性

唐建宏1，张霓霓2，黄桂林2，龙元铸2，崔田宁1，骆勤亮1，郎家婵1，代敏2，张立刚2

1遵义医科大学，贵州省遵义市 563000；2 遵义医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2022-05-20 接受日期:2022-07-14 出版日期:2023-05-28 发布日期:2022-10-17
通讯作者: 张霓霓，硕士，副教授，遵义医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，贵州省遵义市 563000
作者简介:唐建宏，女，1995年生，贵州省桐梓县人，汉族，2022年遵义医科大学毕业，硕士，医师，主要从事放射性涎腺损伤修复的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81860198)，项目负责人：张霓霓；国家自然科学基金(81960204)，项目负责人：黄桂林；遵义医科大学硕士启动基金(KY2019-1)，项目负责人：代敏；贵州省卫健委基金(gzwjkj2020-1-165)，项目负责人：张立刚；遵义医科大学“未来临床名医”项目(20211017)，项目负责人：张霓霓

Biological characteristics of human amniotic mesenchymal stem cells pretreated with different volume fractions of oxygen

Tang Jianhong1, Zhang Nini2, Huang Guilin2, Long Yuanzhu2, Cui Tianning1, Luo Qinliang1, Lang Jiachan1, Dai Min2, Zhang Ligang2

1Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2022-05-20 Accepted:2022-07-14 Online:2023-05-28 Published:2022-10-17
Contact: Zhang Nini, Master, Associate professor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Tang Jianhong, Master, Physician, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81860198 (to ZNN); National Natural Science Foundation of China, No. 81960204 (to HGL); Master’s Start-up Fund of Zunyi Medical University, No. KY2019-1 (to DM); a grant from Guizhou Provincial Health Commission, No. gzwjkj2020-1-165 (to ZLG); “Future Clinical Famous Doctor” Project of Zunyi Medical University, No. 20211017 (to ZNN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
人羊膜间充质干细胞：来源于胎盘羊膜组织的一层半透明膜，是孕妇分娩后丢弃的废弃物，具有来源广、容易获取、免疫原性低、增殖能力强以及不受伦理道德限制等优势，广泛运用于治疗许多疾病，是组织工程研究领域理想的种子细胞来源。
低氧预处理：体外将间充质干细胞进行适当低氧预处理可增加间充质干细胞的增殖活性、抗凋亡能力以及旁分泌作用，将低氧预处理的间充质干细胞移植至体内可抵抗缺血缺氧微环境的改变。

背景：近年来，干细胞在组织损伤修复中发挥着重要作用，其中间充质干细胞移植应用最为广泛，间充质干细胞可以通过旁分泌细胞因子促进损伤组织的修复，低氧预处理可以改善间充质干细胞的生物学特性，因而，低氧预处理的人羊膜间充质干细胞可能在组织损伤修复中起到更好的治疗作用。
目的：探讨不同体积分数氧气预处理对人羊膜间充质干细胞增殖、抗凋亡能力、旁分泌作用的影响。
方法：利用酶消化法获得原代人羊膜间充质干细胞，将第3代人羊膜间充质干细胞通过不同体积分数氧气进行预处理48 h，随机分为1%，3%，5%，10%低氧预处理组和常氧对照组(体积分数21%氧气，倒置显微镜下观察人羊膜间充质干细胞的形态，CCK-8检测人羊膜间充质干细胞的增殖能力，Annexin V-FITC/PI试剂盒检测人羊膜间充质干细胞的凋亡情况，实时定量PCR法检测人羊膜间充质干细胞凋亡基因和缺氧诱导因子的表达，酶联免疫吸附法检测人羊膜间充质干细胞分泌的细胞因子水平。
结果与结论：显微镜下观察不同体积分数氧气预处理组人羊膜间充质干细胞的形态无明显差异，低氧预处理能提高人羊膜间充质干细胞的增殖、抗凋亡和旁分泌细胞因子的能力，且体积分数1%氧气预处理效果优于体积分数3%，5%，10%，21%氧气预处理。
关键词：人羊膜间充质干细胞；低氧；预处理；生物学特征
https://orcid.org/0000-0002-2424-4136 (唐建宏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人羊膜间充质干细胞, 低氧, 预处理, 生物学特征

Abstract: BACKGROUND: In recent years, stem cell plays an important role in the repair of tissue injury, among which mesenchymal stem cell transplantation is the most widely used. Mesenchymal stem cells can secrete cytokines through paracrine effect to promote the repair of damaged tissue. Hypoxia pretreatment can improve the biological characteristics of mesenchymal stem cells. Hypoxic preconditioning of human amniotic mesenchymal stem cells may play a better therapeutic role in tissue injury repair.
OBJECTIVE: To study the effects of different hypoxic pretreatment on the proliferation, antiapoptotic ability, and parocrine effect of human amniotic mesenchymal stem cells.
METHODS: The primary human amniotic mesenchymal stem cells were obtained by enzyme digestion method. Passage 3 human amniotic mesenchymal stem cells were pretreated with different hypoxic concentrations for 48 hours and randomly divided into hypoxic pretreatment group (1% O2, 3% O2, 5% O2, and 10% O2) and control group (21% O2). The morphology of human amniotic mesenchymal stem cells was observed under an inverted microscope. The proliferation ability of human amniotic mesenchymal stem cells was detected by CCK-8 assay. Annexin V-FITC/PI kit was used to detect the apoptosis of human amniotic mesenchymal stem cells. The apoptosis gene and hypoxia-inducible factor of human amniotic mesenchymal stem cells were detected by real-time quantitative PCR. The cytokine secretion capacity of human amniotic mesenchymal stem cells in each group was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Under the microscope, the morphology of human amniotic mesenchymal stem cells in different hypoxic pretreatment groups showed no significant difference. Hypoxic pretreatment could enhance the proliferation, anti-apoptotic and paracrine cytokine capacity of human amniotic mesenchymal stem cells. Pretreatment effect of 1% O2 concentration was better than that of 3% O2, 5% O2, 10% O2 and 21% O2.

Key words: human amniotic mesenchymal stem cell, hypoxia, pretreatment, biological characteristics

中图分类号:

唐建宏, 张霓霓, 黄桂林, 龙元铸, 崔田宁, 骆勤亮, 郎家婵, 代敏, 张立刚. 不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2318-2324.

Tang Jianhong, Zhang Nini, Huang Guilin, Long Yuanzhu, Cui Tianning, Luo Qinliang, Lang Jiachan, Dai Min, Zhang Ligang. Biological characteristics of human amniotic mesenchymal stem cells pretreated with different volume fractions of oxygen[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(15): 2318-2324.

图/表（结果） 8

2.1 人羊膜间充质干细胞的鉴定结果接种两三天后细胞贴壁，5-7 d细胞融合达85%，此时原代人羊膜间充质干细胞中混杂着人羊膜上皮细胞，传代可纯化人羊膜间充质干细胞，3-5 d融合达85%，细胞呈梭形、纺锤样，符合典型间充质干细胞形态，见图1。流式检测CD44、CD90、CD73、CD105抗原呈阳性表达，而CD45/19/34/11b/HLA-DR-PE抗原表达呈阴性，见图2，提取的细胞符合国际间充质干细胞鉴定规定。

倒置显微镜下观察低氧预处理的人羊膜间充质干细胞呈长梭形、纺锤样，生长呈放射状或漩涡状，细胞形态无明显变化，见图3。

2.2 不同体积分数氧气预处理对人羊膜间充质干细胞增殖的影响 ①第1天：1%，3%，5%低氧预处理组吸光度值均高于常氧对照组(P < 0.01)，1%低氧预处理组吸光度值高于3%，5%，10%低氧预处理组(P < 0.01)，3%低氧预处理组吸光度值高于5%低氧预处理组(P < 0.05)，3%，5%低氧预处理组吸光度值高于10%低氧预处理组(P < 0.01)。②第3天：与常氧对照组相比，1%低氧预处理组吸光度值显著增高(P < 0.01)，3%，5%，10%低氧预处理组吸光度值增高(P < 0.05)，1%低氧预处理组吸光度值高于3%，5%，10%低氧预处理组(P < 0.01)。③第5天：1%，3%，10%低氧预处理组吸光度值高于常氧对照组(P < 0.01)，1%低氧预处理组吸光度值高于3%，10%低氧预处理组(P < 0.01)，1%低氧预处理组吸光度值高于5%低氧预处理组(P < 0.05)。④第7天：与常氧对照组相比，1%，3%，10%低氧预处理组吸光度值显著增高(P < 0.01)，5%低氧预处理组吸光度值增高(P < 0.05)；1%低氧预处理组吸光度值高于3%，5%，10%低氧预处理组(P < 0.01)，其余各组比较均无统计学差异，见图4。

2.3 不同体积分数氧气预处理对人羊膜间充质干细胞凋亡的影响各低氧预处理组凋亡百分比均低于常氧对照组(P < 0.01)，1%，3%低氧预处理组凋亡百分比低于10%低氧预处理组(P < 0.01)，1%低氧预处理组凋亡百分比低于5%低氧预处理组(P < 0.05)，其余各组比较差异均无显著性意义，见图5。结果显示低氧预处理组具有抗凋亡作用，其中以1%低氧预处理组抗凋亡能力效果较好。

2.4 实时荧光定量PCR检测结果各低氧预处理组促凋亡基因Bax mRNA表达量低于常氧对照组(P < 0.01)，1%低氧预处理组Bax表达量低于其余各组(P < 0.01)；各低氧预处理组抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达量均高于常氧对照组，其中只有5%低氧预处理组有显著性意义(P < 0.01)，其余各组间差异无统计学意义，见图6。各低氧预处理组缺氧诱导因子1 mRNA表达量高于常氧对照组(P < 0.01)，其余各组之间差异无显著性差异，见图7。

2.5 各组人羊膜间充质干细胞分泌的细胞因子水平 1%，3%，5%低氧预处理组血管内皮生长因子蛋白分泌量高于常氧对照组(P < 0.01)，其余各组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.01)；各低氧预处理组神经生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子蛋白分泌量高于常氧对照组(P < 0.01)，其余各组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图8。

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引言

唾液腺也称涎腺，位于口腔颌面部，涎腺组织对放射线高度敏感，头颈部恶性肿瘤放射治疗常常会导致涎腺功能障碍。涎腺功能障碍引起唾液分泌减少导致一系列不良症状，目前临床上无法从根本上恢复涎腺原有的功能[1]。近年来发现间充质干细胞在组织损伤领域具有广泛的应用前景，高洋等[2]将骨髓间充质干细胞与放射性损伤颌下腺细胞在体外进行共培养，结果发现骨髓间充质干细胞具有向颌下腺腺泡细胞转化的潜力，对损伤的颌下腺细胞起到一定的修复作用。课题组前期将人羊膜上皮细胞与腺泡细胞进行双室共培养，可诱导分化出高表达淀粉酶的腺泡样细胞，将人羊膜上皮细胞移植到放射性损伤的涎腺组织中，涎腺功能得到明显恢复[3-4]。王英鑫[5]将人羊膜间充质干细胞移植到小鼠涎腺放射性损伤模型中，结果发现腺泡细胞数量增多，间质纤维化明显好转。王涛等[6]实验结果表明脂肪干细胞治疗能促进唾液分泌，提高腺体细胞的增殖率，恢复涎腺功能。干细胞移植不仅能使唾液分泌量增加[7]，而且还可以恢复放射性涎腺组织，具有促进涎腺再分泌功能[8]。人羊膜间充质干细胞可以分泌多种细胞外基质、细胞因子、生长因子及生物活性蛋白，并且具有多向分化能力、较低的免疫原性和干细胞特性[9-11]，广泛运用于治疗骨损伤、脊柱损伤和神经疾病等[12-14]，是再生医学研究领域理想的种子细胞来源[15]。
目前将干细胞移植技术应用到临床疾病治疗面临着严重的问题，即移植干细胞存活率低以及到达病变部位产生作用的细胞少。为了解决这个难题，研究者发现低氧预处理可以激活间充质干细胞的生物学特性。体外实验研究发现不同体积分数氧气预处理人脂肪间充质干细胞可以提高血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子的mRNA转录，促进相关蛋白的分泌，其中以体积分数1%氧气预处理效果最为显著[16]。还有研究发现3%低氧预处理可提高人羊膜间充质干细胞的增殖活性、抗凋亡作用和旁分泌功能，并保持干细胞特性[17]。该实验探讨低氧预处理对人羊膜间充质干细胞形态、分化潜能、增殖活性、抗凋亡能力及其旁分泌作用的影响，以期研究最佳氧气预处理体积分数，为涎腺放射性损伤的功能修复研究提供最佳状态的细胞。

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2021年12月在遵义医科大学基础药理教育部重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 人羊膜来源经遵义医科大学附属医院伦理委员会批准(YJSKTLS-2019-2021-027H)，医患沟通并签署同意书，术前排除传染性疾病，在遵义医科大学附属医院产科收集5份足月胎盘，钝性剥离获取人羊膜组织。
1.3.2 主要试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰酶(Gibco，美国)；青链霉素混合液、Ⅱ型胶原酶、DnaseⅠ酶、二甲基亚砜、凋亡检测试剂盒(索莱宝，中国)；碱性成纤维生长因子(联科，中国)；CCK-8试剂盒(同仁，日本)；血管内皮生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特，中国)；PCR试剂盒(诺唯，中国)。
1.3.3 主要仪器二氧化碳培养箱、酶标仪(Forma，美国)；三气培养箱(Smartor，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)；高速低温离心机(Eppendorf，德国)；巴式吸管(3 mL/5 mL)、透气培养瓶(25 cm/75 cm)、离心管(15 mL/50 mL)、培养板(96孔/6孔)(NEST，美国)；4 ℃/-20 ℃/-80 ℃冰箱、超净工作台(海尔公司，中国)；PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人羊膜间充质干细胞的分离培养、传代及表型鉴定
(1)人羊膜间充质干细胞原代分离培养及传代：遵义医科大学附属医院手术室获取羊膜组织，转移至超净工作台内，PBS冲洗表面血迹和黏液，剪碎羊膜组织，加入1∶2体积的0.05%胰酶，置于200 r/min、37 ℃恒温水浴摇床消化30 min，300目滤网过滤，将滤网内羊膜组织再重复该过程消化、过滤1次，收集滤网内羊膜组织，加入1∶2体积现配制的Ⅱ型胶原酶，消化1 h，过滤，收集滤液，终止消化，1 200 r/min、离心7 min后弃上清液，完全培养基(DMEM/F12基础培养基90 mL、胎牛血清10 mL、碱性成纤维生长因子20 μL、青霉素链霉素混合液1 mL)重悬，接种于培养瓶(即原代)，CO2培养箱内培养，每隔2 d换液1次。当细胞达瓶底85%-90%时，加入0.125%胰酶消化2 min，镜下见细胞变圆时立即终止消化，1 200 r/min离心5 min后弃上清，完全培养基重悬，以1∶2接种于培养瓶(即第1代)。按上述方法将人羊膜间充质干细胞传至第2代。

(2)人羊膜间充质干细胞流式表型鉴定：将第2代人羊膜间充质干细胞消化、计数，加入PBS将细胞浓度调整为1.5×109 L-1，取15支流式管分别加入CD44、CD90、CD73、CD105、CD45/19/34/11b/HLA-DR-PE抗体于试管底部，复孔3个，加入100 µL细胞悬液，混匀，避光孵育30 min，加入流式洗涤液，1 000 r/min离心6 min，弃上清，再加入1 mL流式洗涤液，离心，弃上清，加入400 µL PBS重悬后上机检测。

1.4.2 低氧预处理人羊膜间充质干细胞第3代人羊膜间充质干细胞于CO2培养箱培养24 h，更换完全培养基后随机分为5组：1%，3%，5%，10%低氧预处理组和常氧对照组(体积分数21%氧气)，低氧预处理组置于三气培养箱内培养48 h，常氧对照组置于CO2培养箱培养48 h，其余条件相同。
1.4.3 人羊膜间充质干细胞形态学鉴定不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞48 h后在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.4.4 CCK-8法检测人羊膜间充质干细胞的增殖能力不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞48 h，消化，计数，调整细胞浓度为2×107 L-1，以100 μL/孔接种于96孔板，设置4个时间点，复孔5个，分别在1，3，5，7 d同一时间点加入100 μL/孔CCK-8溶液(完全培养基与CCK-8的体积比为9∶1)，放入CO2培养箱培养2.5 h，酶标仪测波长450 nm处吸光度值。
1.4.5 Annexin V-FITC/PI试剂盒检测人羊膜间充质干细胞的凋亡情况不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞48 h，消化，计数，用1 mL的Binding Buffer重悬细胞，300×g离心10 min，弃上清，再用1 mL的Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×109 L-1，流式管内加入100 μL细胞悬液，复孔3个，加入5 μL的Annexin V-FITC，混匀，避光孵育10 min，加入5 μL的PI，孵育5 min，加入PBS至500 μL上机检测。
1.4.6 实时荧光定量PCR检测人羊膜间充质干细胞凋亡相关基因和缺氧诱导因子1的表达
(1) Trizol法提取RNA：不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞48 h，各加入1 mL Trizol混匀，转移至无RNase的EP管中裂解10 min，加入200 μL氯仿，剧烈颠倒混匀，室温条件下静置5 min。超高速低温离心机4 ℃、12 000 r/min离心8 min，可见样品分为3层，RNA主要在上层水相中，吸入上层水相于EP管中，加入400 μL异丙醇，混匀后室温静置10 min，同样条件下离心10 min，EP管底部白色沉淀即RNA，弃上清，加入1 mL无RNase的体积分数为75%乙醇，涡旋，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，再次弃上清，上述同样条件下离心5 min，弃上清，空气中干燥RNA沉淀物8 min，将RNA溶于20 μL的DEPC水中，取2 μL的RNA用微量分光光度计测定A260、A280以及A260/A280值，计算RNA的纯度和浓度。根据A260/A280比值，预估RNA质量。根据吸光度值按下列公式计算样品RNA的浓度：总RNA浓度(μg/μL)=A260×40×10-3，将各组总RNA放于-80 ℃冰箱内保存备用。
(2) RT反转录成cDNA：反转录反应体系第一步：去除基因组DNA，模板RNA 2.888 μg，DNA wiper Mix 4 μL，RNase-free ddH2O补液至16 μL，42 ℃下作用2 min；第二步：配制反转录反应体系，HiScript II Select Q RT Super Mix II 5 μL和第一步的反应液16 μL在50 ℃条件下反应15 min，85 ℃反应5 s，4 ℃反应10 min。

(3)实时荧光定量PCR检测：将cDNA加入反应体系，在实时荧光定量PCR仪上进行检测，反应体系：cDNA 4 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，ROX Reference Dye 2 0.4 μL，H2O 4.8 μL，反应程序：预变性阶段，95 ℃反应10 min，1个循环，变性阶段，设置温度95 ℃，时间15 s，40个循环，退火延伸阶段，60 ℃反应60 s，40个循环，熔解曲线采集阶段，95 ℃维持15 s，60 ℃维持60 s，95 ℃维持15 s，1个循环。引物序列见表1。

1.4.7 ELISA法检测人羊膜间充质干细胞分泌血管内皮生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子情况收集5组人羊膜间充质干细胞上清液，按照说明书加样，37 ℃孵育90 min，洗板，加生物素化抗体100 μL/孔，孵育60 min，加酶结合物100 μL/孔，孵育30 min，加显色剂90 μL/孔，孵育15 min，加终止液50 μL/孔，大体观察见蓝色转黄色时立即用酶标仪测波长450 nm处吸光度值。
1.5 主要观察指标各组人羊膜间充质干细胞的增殖能力、抗凋亡作用和分泌细胞因子情况。
1.6 统计学分析应用SPSS 21.0软件将数据进行统计分析。实验数据以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，若方差齐，组间的两两比较采用LSD法；若方差不齐，组间比较采用 Dunnett’s T3法。文章统计学方法已经通过遵义医科大学生物统计学专家审核。

讨论

间充质干细胞源于胚胎发育早期中胚层，来源广泛，比如骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带、脐血、羊膜组织、牙髓等[18-20]，具有多向分化潜能和自我更新能力等。随着干细胞移植在再生医学领域兴起，间充质干细胞作为理想的种子细胞在再生医学研究领域广泛应用。人羊膜间充质干细胞来源于胎盘羊膜组织，具有来源丰富、采集方便、不会对患者造成二次伤害、无伦理道德限制、传至数代后仍能保持干细胞增殖分化特性、免疫原性低等特点[21-24]，具有良好的应用前景，比如用于治疗放射性涎腺损伤及组织缺损的修复等[25-26]，故该实验选取人羊膜间充质干细胞作为研究对象。目前间充质干细胞移植在临床上运用遇到难题，间充质干细胞移植后24 h内，90%以上干细胞发生坏死或凋亡，严重影响了干细胞的有效性[27-28]。因而，研究一种方法来提高间充质干细胞移植成功率成为关键。低氧预处理是目前认为安全有效并可在临床上运用的预处理策略。低氧预处理增强了间充质干细胞旁分泌作用，显著提高间充质干细胞促进组织损伤部位新生血管生成能力和细胞存活率[29]，减少细胞内活性氧自由基的产生，从而增强移植的治疗效果。低氧预处理使间充质干细胞分泌细胞因子、生长因子、抗炎及免疫抑制相关因子增加[30]，而且不同体积分数氧气、不同组织来源的间充质干细胞以及预处理时间不同均会对间充质干细胞的增殖活性、抗凋亡作用、旁分泌功能产生着不同影响，因此，研究低氧对间充质干细胞作用时必须严格控制实验条件。该实验通过预实验以及相关文献参考最终选取体积分数1%，3%，5%，10%氧气为低氧预处理组，体积分数21%氧气为常氧对照组，均预处理48 h。不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞形态无明显差异，这与课题组前期研究3%低氧预处理人羊膜间充质干细胞不影响干细胞生长形态结论一致。各组细胞均具有成骨、成脂诱导分化潜能和干细胞特性，尚未进一步检测低氧预处理是否能够改变人羊膜间充质干细胞的成骨、成脂分化能力，还需进一步研究验证。
间充质干细胞的增殖和迁移与组织修复密切相关。JUN等[31]实验证明1%低氧预处理组与5%低氧预处理组对比，1%低氧预处理组间充质干细胞具有更强的增殖能力。该实验利用CCK-8试剂盒检测不同体积分数氧气预处理组人羊膜间充质干细胞在第1，3，5，7天的增殖活性，结果表明低氧预处理可以增强人羊膜间充质干细胞的增殖能力，其中1%低氧预处理组细胞增殖能力高于其他低氧预处理组(体积分数为3%，5%，10%氧气)和常氧对照组(体积分数为21%氧气)，但具体机制仍需进一步实验验证。
低氧预处理促进间充质干细胞增殖的机制可能与以下几个因素有关：第一是低氧条件下刺激体内缺氧诱导因子1α高表达，使得ERK1/2和Akt发生磷酸化改变，促进间充质干细胞增殖；第二是低氧抑制活性氧产生；第三是低氧可增加内源性AngⅡ表达，并激活醛固酮系统，促进间充质干细胞增殖[32]。
许多研究证明了低氧预处理能提高间充质干细胞的抗凋亡作用，刘林奇[33]研究结果证明体积分数1%氧气预处理组较常氧组(体积分数21%氧气)细胞凋亡数较少，具有统计学意义，说明体积分数1%氧气预处理脂肪间充质干细胞具有抗凋亡作用。该实验采用凋亡试剂盒检测各组细胞凋亡情况，结果显示各低氧预处理组均具有抗凋亡作用，其中以1%低氧预处理组抗凋亡作用较好。另外荧光定量PCR检测凋亡相关基因表达，结果表明各低氧预处理组促凋亡基因Bax表达量低于常氧对照组，1%低氧预处理组Bax表达量低于其余各组，差异均有显著性意义，各低氧预处理组抗凋亡基因Bcl-2表达量均高于常氧对照组，其中只有5%低氧预处理组高于常氧对照组，差异有显著性意义，其余各组间无统计学意义，可能与样本量太少以及标准差过大相关。
越来越多的研究认为干细胞移植治疗效果主要是干细胞旁分泌机制起重要作用[34]，HEO等[35]实验研究发现低氧预处理人脂肪间充质干细胞用于修复损伤皮肤疗效更好，其机制可能是低氧预处理使细胞分泌更多碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子有关。MOEN等[36]通过低氧预处理人羊膜间充质干细胞，证明了低氧预处理能使细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子增加，这些因子在干细胞旁分泌机制中起到关键作用。该实验通过ELISA试剂盒检测各组细胞分泌因子，结果显示低氧预处理提高了人羊膜间充质干细胞分泌蛋白能力，其中1%低氧预处理组血管内皮生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子蛋白分泌量较高，增强了人羊膜间充质干细胞旁分泌作用，这些旁分泌细胞因子不仅能保护周围组织细胞，同时也能提高自身的生存能力。
目前普遍认为缺氧诱导因子1是低氧预处理促进间充质干细胞增殖、抗凋亡及旁分泌作用的关键调节因子。JAFARINIA等[37]研究发现低氧预处理骨髓间充质干细胞可以提高细胞增殖速率，其机制可能与HIF-1α-TWIST抑制E2A基因转录，下调P21蛋白表达相关。侯婧瑛等[38]实验证明1%低氧预处理骨髓间充质干细胞通过旁分泌作用促进体外人脐静脉内皮细胞存活和管状结构的形成，这些作用与缺氧诱导因子1α的活化相关。该实验通过实时荧光定量PCR检测各组细胞缺氧诱导因子1表达情况，结果表明低氧预处理各组缺氧诱导因子1表达量高于常氧对照组，差异有显著性意义，该实验低氧预处理具有促进人羊膜间充质干细胞增殖、抗凋亡作用及旁分泌作用可能与缺氧诱导因子1高表达相关，但其具体机制仍需进一步研究。
根据以上结果分析，不同体积分数氧气预处理48 h可以促进人羊膜间充质干细胞增殖、抗凋亡作用及增强旁分泌细胞因子能力，其中以体积分数1%氧气效果较好。因此，适当低氧预处理可激活人羊膜间充质干细胞生物学性能，使其更好地为修复放射性涎腺损伤提供理想的间充质干细胞。后续体内实验将使用体积分数为1%氧气预处理人羊膜间充质干细胞提取外泌体注射到放射性涎腺损伤腺体内，观察涎腺功能修复情况。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同体积分数氧气预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特性

Biological characteristics of human amniotic mesenchymal stem cells pretreated with different volume fractions of oxygen

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