2.1   生理性低氧不影响间充质干细胞表面标志物的表达   低氧处理对脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞的免疫表型没有影响，低氧组与常氧组免疫表型表达情况相同，CD14，CD34，CD45和HLA-DR均为阴性表达；CD73，CD90和CD105呈阳性表达，见图1，表1，说明低氧处理未改变细胞“干性”，符合间充质干细胞的鉴定标准。







2.2   生理性低氧优化两种间充质干细胞的贴壁效率   使用结晶紫染色后，细胞集落将呈紫色。两种细胞低氧组集落数量均多于常氧组，且差异有显著性意义(脐带间充质干细胞：P=0.005；经血源性间充质干细胞：P=0.001)，说明低氧处理可以提高两种间充质干细胞的贴壁效率，见表2。倒置相差显微镜观察集落中的细胞数量，发现低氧组细胞数量明显多于常氧组，印证了低氧可以促进两种间充质干细胞的增殖，见图2。







2.3   生理性低氧促进两种间充质干细胞增殖   根据实验结果绘制生长曲线，见图3，在前4 d，细胞生长处于潜伏期的时候，低氧对细胞增殖无明显影响，第5天开始，细胞生长进入对数生长期，常氧组和低氧组细胞数量开始出现差距，第6天，两组之间出现显著性差异(脐带间充质干细胞：P < 0.001；经血源性间充质干细胞：P < 0.01)，一直持续到第8天(脐带间充质干细胞：P < 0.001；经血源性间充质干细胞：P < 0.001)，说明生理性低氧对两种间充质干细胞的生长均有促进作用。由表3可得，两种间充质干细胞经低氧处理后，低氧组的群体倍增时间均显著小于常氧组，说明生理性低氧可以促进两种细胞增殖。此外，低氧处理后，脐带间充质干细胞群体倍增时间的缩减率约为23%，而经血源性间充质干细胞约为28%，说明相对于脐带间充质干细胞，低氧对经血源性间充质干细胞的群体倍增时间影响更大，对其促增殖作用更强。







2.4   生理性低氧对细胞凋亡的影响   Q2代表晚期凋亡细胞，Q3代表早期凋亡细胞，Q4代表活细胞，见图4。脐带间充质干细胞常氧组和低氧组晚期凋亡细胞和早期凋亡细胞差异无显著性意义(P > 0.05)；经血源性间充质干细胞常氧组和低氧组凋亡率差异无显著性意义(P > 0.05)。



2.5   生理性低氧对经血源性间充质干细胞产生抗衰老作用   通过β-半乳糖苷酶染色法，衰老细胞呈蓝色。脐带间充质干细胞常氧组和低氧组衰老细胞数量均不多，两组之间无明显差异，见图5A-D。经血源性间充质干细胞低氧组24孔板的蓝色明显浅于常氧组，见图5E，F，倒置显微镜下低氧组的蓝色细胞明显少于常氧组，见图5G，H，定量分析发现低氧组和常氧组染色比率存在显著性差异，见图5I，说明生理性低氧对经血源性间充质干细胞能产生抗细胞衰老的作用。



2.6   生理性低氧促进两种间充质干细胞代谢   由图6可见，随着培养时间增加，培养基中葡萄糖水平逐渐减少，乳酸水平逐渐增加。第2天时，两种细胞低氧组和常氧组的葡萄糖、乳酸水平差异均无显著性意义(P > 0.05)。脐带间充质干细胞常氧组和低氧组葡萄糖水平第8天差异有显著性意义(P < 0.01)，乳酸水平在第5天和第8天差异均有显著性意义(第5天：P < 0.05；第8天：P < 0.05)，说明低氧可以促进脐带间充质干细胞代谢。经血源性间充质干细胞低氧组在第8天时生成更多的乳酸(P < 0.01)，而常氧组和低氧组的葡萄糖水平无差别(P > 0.05)。两种细胞的生长曲线在前4 d内低氧组和常氧组无明显差距，第5天开始出现差距并在第8天差距达到最大，两种细胞的代谢结果与生长曲线的趋势相吻合。




2.7   生理性低氧对成骨、成脂分化的影响
2.7.1   成骨分化   细胞成骨诱导分化后出现钙结节，钙结节经茜素红染色呈红色。脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞添加成骨分化培养基诱导之后，茜素红染色均可见明显的钙结节沉积，见图7。成骨分化半定量分析结果显示，未诱导对照组和诱导分化组的吸光度值差异有显著性意义，说明两种间充质干细胞均成功诱导分化为成骨细胞，见图7C，F。经血源性间充质干细胞低氧组的吸光度值高于常氧组(P < 0.01)，说明低氧可以提高经血源性间充质干细胞的成骨分化能力。



2.7.2   成脂分化   成脂诱导分化后细胞出现油滴，经油红O染色呈红色。脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞添加成脂诱导培养基培养后，可见红色油滴形成，见图8，成脂分化半定量分析结果显示未诱导对照组和诱导分化组的吸光度值差异有显著性意义，说明脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞均成功诱导分化为成脂细胞，见图8C，F。根据半定量分析结果，脐带间充质干细胞低氧组和常氧组吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)，说明生理性低氧可以增强脐带间充质干细胞的成脂分化能力。

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间充质干细胞是一类来源于机体成熟组织中的多能成体干细胞，骨膜、脂肪、真皮、经血、胎肺、胎肝、胎肾、胎儿骨髓、羊水、脐带和胎盘中均存在间充质干细胞[1]，其中脐带间充质干细胞来源丰富[2]，经血源性间充质干细胞取材对捐献者没有身体损伤，并且可从同一捐献者身上多次取用[3]，这两种间充质干细胞在细胞治疗上都具有极大的前景[4-7]。

间充质干细胞在实际应用中面临着一些问题，主要是临床应用需要大量细胞支持，现阶段的细胞培养方法难以满足应用需求[8]；同时间充质干细胞还存在着容易衰老的问题[9]，所以需要对培养条件进行优化。传统的干细胞体外培养时，氧气体积分数通常保持在20%左右，低氧预处理常用的氧体积分数在1%-5%[10-11]，正常人体的氧体积分数为5%左右[12]，多种器官及组织内氧分压通常低于外界大气压，器官和组织内的适度低氧环境被称为“生理性低氧”[13-14]，所以，相对于传统的常氧而言，生理性低氧培养更加贴近细胞在体内的生长状态，有望改善细胞的生物学特性。课题组预期探究间充质干细胞处于与体内氧体积分数相符的培养条件能否改善其生物学特性，选择5%氧体积分数作为培养条件。

前期已经探究了脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞在不同代数下生物学特性上的差异点和类似点[15]，研究发现两种细胞在8 d内都能稳定生长，但是经血源性间充质干细胞的生长速率小于脐带间充质干细胞，同时还发现脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞在培养至第10代时均会出现一定的衰老现象，但经血源性间充质干细胞的衰老细胞数量大于脐带间充质干细胞，前期研究并未针对这些问题进行细胞培养上的优化，故作者猜想低氧能否优化两种间充质干细胞的生物学特性，特别是经血源性间充质干细胞。该实验使用体积分数为5%氧气处理脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞，探究相同的指标，为干细胞培养优化提供具体信息。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   细胞学体外实验，细胞功能数据组间比较使用独立样本t检验和单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年3-12月在上海交通大学药学院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   人源脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞由上海丽坤科技有限公司惠赠。
1.3.2   实验试剂   α-MEM培养基、TrypLE(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Thermo公司)；40 g/L多聚甲醛(上海生工)；葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒(南京建成)；细胞衰老检测试剂盒(上海碧云天)；细胞凋亡试剂盒(美国SAB公司)；鼠抗人CD14-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-APC、PE同型小鼠IgG1、APC同型小鼠IgG1(美国BD公司)。
1.3.3   实验仪器   二氧化碳培养箱、三气培养箱(美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；countstar细胞计数仪(上海睿钰公司)。
1.4   方法   
1.4.1   间充质干细胞分离与培养
脐带间充质干细胞：原代细胞分离和培养在上海丽坤科技有限公司完成，使用组织块贴壁法，剥离脐静脉内膜，去除血管剪成2.0 mm3小块，将组织块按适当密度接种于培养板，加入含有体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基培养，每隔2 d补加培养基。倒置显微镜下观察，当组织块周围出现成纤维状细胞后，去除组织块，更换培养基继续培养。当细胞融合度达到80%时，消化细胞接种至6孔板得原代脐带间充质干细胞。
经血源性间充质干细胞：原代细胞分离和培养在上海丽坤科技有限公司完成，使用密度梯度离心法，取经血样品5 mL，与5 mL PBS、0.2 mL两性霉素B、0.2 mL链霉素、0.1 mL EDTA-Na混合均匀后，4 ℃静置24 h，随后1 500 r/min离心10 min，弃上清，使用含体积分数为15% 胎牛血清的α-MEM重悬细胞，1 500 r/min再次离心10 min，分离沉淀得到原代经血源性间充质干细胞。 

1.4.2   实验分组处理   将脐带间充质干细胞和经血来源间充质干细胞各自分为常氧组和低氧组，低氧组使用三气培养箱，向其中充入氮气，使氧分压达到5%水平，各自培养一段时间后，对各项指标进行检测。

1.4.3   表面标志物检测   取第5代脐带间充质干细胞和经血来源间充质干细胞，在不同氧体积分数下培养5 d，消化后以300×g离心5 min，含体积分数为2%胎牛血清的PBS清洗，向细胞中加入CD14-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-APC、HLA-DR-PE抗体，与IgG1抗体结合的细胞作为同型对照，置于4 ℃冰箱避光孵育30 min，孵育结束后PBS清洗2次，洗去未结合的抗体，流式细胞仪检测细胞表面标志物表达量。
1.4.4   细胞贴壁效率   取生长良好的第5代脐带间充质干细胞和经血来源间充质干细胞，消化后按照1×103/孔的密度接种到6孔板，分别进行常氧和低氧培养，大约2周后显微镜可观察到集落形成，弃去培养基，PBS冲洗细胞后使用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，再加入0.1%结晶紫染色10 min，拍照记录。
1.4.5   增殖能力检测   取第5代脐带和经血来源间充质干细胞，当融合度达到80%之后，胰酶消化，以1×104/孔的密度接种到24孔板，分别进行常氧和低氧培养，每隔2 d进行全换液，24 h后各取3孔细胞消化、细胞计数仪计数，1-8 d内每天重复消化细胞和计数步骤，绘制生长曲线，计算群体倍增时间。

1.4.6   细胞凋亡检测   取生长良好的第6代脐带间充质干细胞和经血来源间充质干细胞，在不同氧体积分数下培养5 d，胰酶消化，冷PBS清洗2遍，每管收集5×105细胞，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀后避光，4 ℃孵育15 min，然后加入10 μL Propidium Iodide混匀后避光，4 ℃孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.4.7   细胞衰老检测   取第9代脐带间充质干细胞和经血来源间充质干细胞在常氧条件下培养至细胞融合度达80%，胰酶消化，以1×104/cm2密度接种于24孔板，在不同氧体积分数下培养5 d，使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老情况，吸去24孔板中的细胞培养液，PBS洗涤1次，加入250 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，吸除细胞固定液，PBS洗涤3次，每孔加入250 μL染色工作液，37 ℃孵育过夜，观察记录实验结果。使用软件Image J对染色部分进行定量统计。
1.4.8   细胞葡萄糖乳酸代谢检测   生长良好的第5代脐带间充质干细胞和经血来源间充质干细胞，按照1×104/cm2接种至24孔板中，分别进行常氧和低氧培养，在第2，5，8天各取3孔的培养基上清，使用葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒测定上清中葡萄糖和乳酸水平。
1.4.9   干细胞分化能力检测
成骨分化：使用成骨诱导分化培养基试剂盒，参考说明书完成成骨诱导分化完全培养基的配制。当第5代脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞融合度达到80%时，消化细胞，按照2×104/cm2的细胞密度接种到事先包被明胶的6孔板中，分别进行常氧和低氧培养，当细胞融合度达到70%后，两组细胞均置于常氧培养箱中，实验组更换成骨诱导培养基，对照组更换基础培养基，每间隔2 d换液1次。诱导3周后，用茜素红染色观察钙结节沉积。细胞经茜素红染色后，每孔加入10%氯化十六烷基吡啶溶液，室温脱色10 min，酶标仪测定570 nm处吸光度值。
成脂分化：使用成脂诱导分化培养基试剂盒，参考说明书完成成脂诱导分化完全培养基的配制。当第5代脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞融合度达到80%时，消化细胞，按照2×104/cm2的细胞密度接种到6孔板中，分别进行常氧和低氧培养，当细胞融合度达到100%后，两组细胞均置于常氧培养箱中，实验组更换成脂诱导培养基，对照组更换基础培养基，每间隔2 d换液1次。诱导3周后，用油红O染色观察油滴。细胞经油红O染色后，每孔加入异丙醇溶液，室温脱色5 min，酶标仪测定510 nm处吸光度值。 
1.5   主要观察指标   低氧组和常氧组脐带间充质干细胞、经血源性间充质干细胞的表面标志物、贴壁效率、增殖能力、细胞凋亡、细胞衰老、葡萄糖乳酸代谢和细胞分化情况。
1.6   统计学分析   实验数据使用SPSS 23.0软件进行分析，不同组间比较使用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

间充质干细胞因其良好的分化潜能、丰富的获取来源、可操作的体外培养方法，在再生医学上具有巨大的潜能[16]。脐带间充质干细胞具有成本低、侵入性小、分离方便和免疫原性低等优点[17]。在2008年，PATEL等[18]从女性经血样品中分离得到了间充质干细胞，将其命名为经血源性间充质干细胞。经血源性间充质干细胞取材方式无侵入性，对捐献者无损伤，并且可以从同一捐献者身上多次取材，是一种理想的种子细胞。

传统的干细胞体外培养时，氧气体积分数通常保持在20%左右，但是正常人体的氧体积分数仅为5%左右[12]，所以5%氧体积分数的生理性低氧可能更符合间充质干细胞的生长需求。

研究发现低氧预处理可以改善人羊膜间充质干细胞的生物学特性[19]，促进骨髓间充质干细胞对血管内皮迁移和成管[20]。有研究证实胰岛素样生长因子1过表达的骨髓间充质干细胞在低氧条件下具有更高的增殖速率，并且可以修复缺氧诱导的凋亡心肌细胞[21]。另有研究证实了5%的低氧可以促进脂肪间充质干细胞的增殖和集落形成，并促进了碱性成纤维细胞因子和血管内皮生长因子的分泌[22]。还有研究表明在5%氧体积分数的生理性低氧条件下，共培养的人脐带血管周细胞和脐带静脉内皮细胞体系中，人脐带血管周细胞增殖能力变强[23]。但是目前尚未有研究探究低氧对经血源性间充质干细胞的影响，也很少有研究比较低氧对不同来源间充质干细胞生物学特性的影响是否存在差异。

 治疗组织损伤需要大量间充质干细胞的植入[24]，但是现阶段间充质干细胞存在种子细胞数量不足，容易衰老的问题，在应用上受到了一定的限制[25]。此次研究证实了低氧可以促进脐带和经血来源间充质干细胞的增殖，还能促进两种间充质干细胞集落形成，但是不改变其“干性”，CD14、CD34、CD45和HLA-DR仍然呈阴性表达，同时低氧处理后CD73、CD90和CD105依旧呈阳性表达。生理性低氧预处理提高两种间充质干细胞的贴壁效率，在培养过程中确保有更多的细胞可以贴壁生长，预示着生理性低氧处理可以扩大细胞的产量，缓解因数量不足带来的限制。研究还证实了低氧处理可以减缓经血源性间充质干细胞的衰老。CASCIARO等[26]
研究发现低氧(体积分数1%)可以延缓易衰竭的人羊水干细胞衰老相关基因的表达。研究发现，经血源性间充质干细胞在临床应用上具有巨大的潜能[27]，如对子宫内膜异位症和糖尿病等疾病的治疗[7]，研究团队现阶段也发现经血源性间充质干细胞具有分化成胰岛细胞的可能性，在治疗糖尿病方面具有巨大的研究前景。但是，研究团队前期研究证实，随着代数的增加，经血源性间充质干细胞中β-半乳糖苷酶阳性细胞明显增加，第10代衰老细胞数量明显大于脐带间充质干细胞[15]，这种易衰老的问题在一定程度上限制了经血源性间充质干细胞的应用，但是少有探索改善经血源性间充质干细胞衰老的研究。此次研究发现低氧处理可以作为抗经血源性间充质干细胞老化的优化培养方法，对扩大经血源性间充质干细胞的应用具有重大的意义。在代谢方面，生理性低氧处理后，脐带和经血来源间充质干细胞的乳酸水平均发生了显著性变化。FLORES等[28]发现乳酸脱氢酶可以激活毛囊干细胞，乳酸在激活毛囊干细胞增殖过程中发挥了重要的作用。YE等[29]则证实乳酸脱氢酶在低氧促进毛乳头细胞增殖过程中发挥了作用，从而推测乳酸脱氢酶可能有望成为治疗脱发的新靶点，这也提示生理性低氧促进脐带间充质干细胞和经血来源间充质细胞增殖的机制可能与乳酸脱氢酶表达量增加、乳酸生成量上升有关。现有研究证实了生理性低氧可以促进代谢，为后期探究代谢机制在低氧改变间充质干细胞生物学特性过程中是否发挥作用提供了表型上的支持，也有望在此过程中发现一些可能的作用靶标。

尽管两种间充质干细胞处在相同代数下，经过了相同的处理时间，但是两种细胞的生物学特性变化并不完全相同。半定量分析结果显示生理性低氧促进经血源性间充质干细胞成骨分化，促进脐带间充质干细胞成脂分化，但是对于脐带间充质干细胞成骨分化和经血源性间充质干细胞成脂分化不存在显著性影响。有研究显示体积分数为3%氧气会抑制骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化能力[30]。也有研究显示体积分数为2%低氧培养骨髓间充质干细胞2周后对细胞进行诱导分化，低氧条件下细胞表达成骨分化关键基因RUNX2显著高于常氧组，但是表达的成脂分化关键基因PPARg则显著低于常氧组，认为低氧促进间充质干细胞成骨分化而抑制成脂分化[31]。在低氧影响脂肪间充质干细胞成脂分化的研究中发现，当氧体积分数为2%时可以促进细胞成脂分化，但是当氧体积分数调整至5%时，对脂肪间充质干细胞成脂分化能力无显著性影响[32]，说明不同氧体积分数对不同来源间充质干细胞生物学特性的影响可能是不同的。此次研究平行记录生理性低氧对两种来源间充质干细胞生物学特性的影响，研究发现虽然是相同的氧体积分数，但是两种细胞在衰老和分化等特征上的改变并不相同，这些数据为后期优化不同来源间充质干细胞的不同生物学特征的条件选择奠定了基础。

实验结果显示生理性低氧对减缓细胞凋亡的效果并不明显，有研究证实体积分数为5%低氧预处理与姜黄素联合作用可以显著提高骨髓间充质干细胞存活率，抑制caspase-3活化，并改善其线粒体功能，该过程与PCG-1α/SIRT3/HIF-1α信号通路有关[33]，这提示将生理性低氧与外源抗氧化剂相结合可能进一步改善间充质干细胞的生物学特性，特别是在细胞凋亡和氧化应激功能上可以获得进一步优化。

综上所述，体积分数为5%的生理性低氧可以促进脐带和经血来源间充质干细胞的贴壁效率、增殖和细胞代谢，同时相较于脐带间充质干细胞，低氧对经血源性间充质干细胞的增殖作用和抗衰老作用更强，对于改善经血源性间充质干细胞这种培养困难的种子细胞具有重大的意义，这也为研究团队后期探究经血源性间充质干细胞治疗糖尿病提供了稳定质量的细胞来源。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
经血源性间充质干细胞：从女性经血样品中分离得到的成体干细胞，取材方法对捐献者无损伤，是治疗多种生殖疾病的理想种子细胞。
生理性低氧：细胞体外培养的氧体积分数在20%左右，而正常人体内的氧体积分数在5%左右，这种低于外界大气压适度的氧体积分数称为生理性低氧。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

间充质干细胞应用存在着细胞数量不足、容易衰老、移植部位细胞存活率低等问题，研究发现低氧处理可以优化间充质干细胞细胞的生物学特征。研究发现，低氧预处理可以改善人羊膜间充质干细胞的增殖和抗凋亡能力。另有研究证实了低氧可以促进脂肪间充质干细胞的集落形成和增殖能力，并促进了血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞因子的分泌。但是目前尚未有研究探讨低氧对经血源性间充质干细胞的影响，也很少有研究比较低氧对不同来源间充质干细胞生物学特性的影响是否存在差异，该实验将提供更详细的数据分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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