2.1   人羊膜间充质干细胞的主要生物学特征与功能   人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的生物学特征和标志，为梭形细胞贴壁生长，阳性表达CD44，CD73，CD90和CD105，不表达CD34，CD45，CD11b，CD19和HLA-DR，表达波形蛋白和干性标志物Oct3/4，SSEA-4，Nanoge，Sox2和整合素家族CD29，CD49b，CD49c，CD49e和CD49d[14-15]；人羊膜间充质干细胞可在体内外诱导分化为3个胚层的细胞[16]。在动物实验中，人羊膜间充质干细胞对神经元退行性疾病、心肌梗死、糖尿病、重症肝病、肾病、卵巢早衰及类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病具有良好的治疗作用，作用机制除涉及多向分化替代特定组织功能细胞外，还与其强大的抗炎、免疫调节及分泌功能密切相关，可明显降低致炎因子水平，提高抗炎因子水平，上调T细胞中Treg/Th17和CD4/CD8比值，恢复免疫平衡，改善微环境；通过释放外泌体、胰岛素生长因子和转化生长因子等促再生细胞因子及相关信号分子的miRNA，减轻炎症损伤，促进血管及损伤组织再生修复[17-19]。
2.2   人羊膜间充质干细胞制备工艺及质量鉴定  
2.2.1   羊膜的采集   羊膜作为人羊膜间充质干细胞制备的原料，供者的科学选择，采集方法的稳定、可靠与规范是人羊膜间充质干细胞制剂质量保证的第一关。羊膜的采集需符合伦理要求，除了需提供家属或法定监护人签署的知情同意外，还需要对供者进行健康筛查，包括既往史和家族史，并需要进行传染性病原微生物感染和严重缺陷遗传性疾病的检测，如艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒及梅毒螺旋体感染的检查，以排除感染性风险。采集过程也应在无菌条件下，使用灭菌的实验器具，防止耗材共用带来的交叉污染。机械剥离所采集到的羊膜放入含抗生素的营养液中，迅速转移至符合cGMP标准的细胞制备实验室进行后续实验操作。
2.2.2   人羊膜间充质干细胞的制备   细胞制备的每一个步骤都，决定着最终细胞的安全性和有效性，因此全过程标准化操作和质量保证至关重要。实验室的环境、仪器、试剂和操作人员均相对固定，操作方法应严格遵照技术操作规程。培养过程中注意观察细胞形态及微生物污染情况，避免出现细胞变大、多形性、皱缩与生长缓慢等衰老的形态改变。课题组通过反复实验，优化了一套成熟、简单、稳定的标准化人羊膜间充质干细胞制备技术，收集冻存一两代细胞作为种子细胞，每张羊膜可获得原始数量高达1×109个细胞[20]。
2.2.3   从有血清到无血清的培养   早期的人羊膜间充质干细胞培养均采用含体积分数10%胎牛血清的LD-DMEM培养基及后续添加丙酮酸及非必需氨基酸等[21]。随着临床级间充质干细胞制备发展的需求，胎牛血清完全培养基应用的安全性问题日益突出：①胎牛血清存在多种动物源性微生物感染的风险，可能会传播动物源性疾病；②引发免疫反应，刺激相应抗体产生；③传代中易发生人羊膜间充质干细胞衰老、分化、甚至转化；④血清成分复杂，易引发异常免疫反应等，与人胚胎干细胞培养一样，人羊膜间充质干细胞培养也由有胎牛血清进入到无血清、无动物源性成分添加物的新培养体系时代[22-23]；⑤严重影响人羊膜间充质干细胞外泌体等衍生物分泌。
有研究利用激素代替胎牛血清诱导分化是干细胞无血清培养的开端，在基础培养基中补充维持细胞增殖活性的血清替代物和其他添加物，如血小板裂解物、激素、非必需氨基酸、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和胰岛素等生长因子和促贴壁因子纤粘蛋白或胶原等[24-25]，是目前无血清培养的主要方案。无血清培养基具有以下优点：①避免血清不同批次间的质量差异和胎牛血清中不明确成分导致的毒副反应和动物源微生物污染；②其成分明确，含量已知，避免了血清组分不同对干细胞制剂质量的影响；③其组分稳定，适用于大批量生产；④不含有丝分裂原抑制剂，促进细胞增殖明显；⑤能良好地保持人羊膜间充质干细胞的生物学特征与功能。自体库人羊膜间充质干细胞制备中，自体血清及血浆培养体系也可以作为一种工艺策略，但随着干细胞产业的规模化发展及异基因干细胞移植的增加，Life Technologies及Biological Industries等国外公司生产的脐带间充质干细胞血清替代物等，已成功应用于人羊膜间充质干细胞的无血清体外扩增。
目前国内外研究者利用无血清培养的骨髓、脐带和脂肪来源间充质干细胞已成功应用于临床研究。研究证明，用含β-巯基乙醇、丁化羟基苯甲醚的无血清培养基培养脐血间充质干细胞，扩增能力保持较好，可被诱导分化为神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经胶质元纤维酸性蛋白和神经元细胞，表达大量油红O染色阳性的脂滴，或茜素红染色阳性的骨结节、阿利新蓝染色阳性的软骨细胞等[26-27]。与含胎牛血清培养基相比，无血清培养基培养的脐带间充质干细胞的扩增能力和免疫抑制功能均明显较高[28]。无血清培养基培养的人羊膜间充质干细胞扩增代次增加，三胚层细胞分化能力保持良好，细胞衰老延缓，明显优于胎牛血清[29]。用体积分数5%人卵泡液替代体积分数10%胎牛血清的无血清培养基所培养人羊膜间充质干细胞，其形态、增殖、核型、基因和表面标志蛋白表达都无明显改变，也能被诱导分化为神经元和胰岛细胞[30]。较胎牛血清培养而言，自体脐血血清培养传代的人羊膜间充质干细胞形态和分化特性明显更优。而第5-7代人羊膜间充质干细胞表面标志分子表达相似[31]。此外无血清冻存也已很好地应用于人羊膜间充质干细胞的长期深低温存储。
2.3   人羊膜间充质干细胞表型标志与功能评价   为确保干细胞制剂的有效性与安全性，除对人羊膜间充质干细胞的基本生物学特性，如细胞活性与状态、纯度和均一性、细胞数量、干性基因表达、免疫表型、分化潜能等进行检测，及分泌、免疫调节等功能评价外，还需考虑适应证的发病特点和机制，从而进行更为精准的质量控制。有研究发现，细胞传代10-15代内，流式细胞分析人羊膜间充质干细胞和骨髓、脐带间充质干细胞的免疫表型类似[20-21]。人羊膜间充质干细胞与异基因正常人，低白细胞介素6分泌型人羊膜间充质干细胞与类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞共培养后，人羊膜间充质干细胞均可抑制淋巴细胞增殖，诱导CD4+Foxp3+、CD4+CD25+CD127(low/-)的Treg细胞比例增高，减少Th1、Th17、Tc1细胞比例[32]。免疫原性评价既是功能评价指标，也是重要的安全性指标。人羊膜间充质干细胞的低免疫原性和诱导免疫耐受功能，为异基因个体使用人羊膜间充质干细胞奠定了基础[32]。经静脉或局部途径注射人羊膜间充质干细胞治疗急性心肌梗死、肝纤维化和免疫佐剂诱导的骨关节炎等大量动物实验也显示，受损的心脏、肝脏和关节的功能和组织结构均得到显著改善，而少见相应组织功能细胞分化，移植后2-12周在损伤局部组织内仍有大量人羊膜间充质干细胞存活而不被排斥[32-34]，均证明了人羊膜间充质干细胞的低免疫原性，较好的免疫豁免特性或诱导免疫耐受特性，有利于同种异体移植后较长时间的疗效维持及避免某些免疫相关不良反应的发生。
2.4   人羊膜间充质干细胞的致瘤性   目前上市的干细胞产品涉及的细胞类型为干性较强的各类组织干细胞和干性相对较弱的组织前体细胞或祖细胞两大类。美国Geron公司开展了全球首例利用人的胚胎干细胞制剂GRNOPCI治疗脊髓损伤的临床试验[35]。此后，胚胎干细胞制剂也被批准用于老年人视网膜黄斑病变，试验结果取得了安全性验证和满意疗效[36]。然而不可否认的是胚胎干细胞的致瘤性，一直是其临床转化应用的争议焦点，尽管间充质干细胞目前尚未见致瘤性的报道，但连续体外扩增过程中，间充质干细胞的生物功能也受多种因子及表观遗传调控，衰老的人羊膜间充质干细胞存在多种基因mRNA和microRNA表达谱的改变[20]，移植后人羊膜间充质干细胞在体内的非特异分化或嵌合体形成，是否存在肿瘤发生的风险，仍然有待长期随访。众所周知，细胞衰老的结局无外乎导致细胞凋亡、死亡或转化，衰老细胞的恶性转化具有导致肿瘤的高风险。因此，人羊膜间充质干细胞体外制备过程中，避免间充质干细胞衰老的发生及不使用衰老的间充质干细胞，也可能是规避风险不可或缺的质控关键。人羊膜间充质干细胞的细胞群体倍增时间减慢，形态改变和面积变大，高表达半乳糖苷酶，CD90阳性表达降低及成骨或成软骨细胞分化能力下降，成脂肪细胞分化增多等，都是值得关注的人羊膜间充质干细胞衰老质控指标[20]。
致瘤性除了取决于干细胞的来源、分化状态、多能性或培养条件外，高代次细胞发生DNA遗传或表观遗传学改变导致致瘤风险增高已是较为明确的共识。干细胞植入体内后，除了在靶向组织发挥作用外，也可能迁移到其他组织进行非预期分化[37-39]。因此，人羊膜间充质干细胞在体内长期示踪技术的突破则更加有利于长期随访，除致瘤性外，还需高度重视间充质干细胞促瘤性的风险，对供受者早期肿瘤的筛查也不容忽视。
2.5   人羊膜间充质干细胞制备质量控制关键环节
2.5.1   制备实验室条件   人羊膜间充质干细胞制剂与其他临床级干细胞制备实验室要求的中试条件相似，须符合《医药工业洁净厂房设计标准》，并充分保障各制备环境符合《药品生产质量管理规范》规定[13]：实验室洁净度，恒温恒湿条件，过滤除菌新风流入，低噪度和压力差等。实验室加强日常运行管理，定期做好室内环境检测，在“人、机、料、法、环”各环节的有效管理，都是明显影响人羊膜间充质干细胞制剂质量控制的关键。此外，综合质量检定中，除配备常规形态观察、微生物检测等必须基础设备外，需拥有可完成细胞因子检测、细胞表型鉴定的仪器外，还需增加检测干性基因、多向分化标志基因和DNA遗传标记的仪器设备，这便于发现遗传缺陷和人羊膜间充质干细胞供者与受者的个体识别信息等。按照质量标准、针对制备工艺，制定和有效地执行上述实验室与设备使用、物料质控及细胞制剂制备流程的标准操作手册，及时、准确地做好实验记录，是人羊膜间充质干细胞制剂制备管理的最核心的软实力。 
2.5.2   制剂安全性评价   无微生物污染或交叉污染是实验室安全和制剂安全性质量控制的基本要求。收集胎盘的同时，采集少量脐血，进行血清免疫学检测是评价供者感染情况的重要方法。制剂的制备、环境监测、放行检验和复核检验中，通过显微镜观察细胞形态，培养和涂片染色检菌，定量PCR检测病原体及内毒素测定都是必不可少的安全性监测。
临床前安全性评价中间充质干细胞给药局部和人体的毒性反应、非预期分化和异常免疫学反应，同样与制剂工艺有关，尤其是间充质干细胞的异质性高或细胞活力降低，可能会明显影响人羊膜间充质干细胞治疗的有效性和安全性。因此，获得高纯度(标志分子>85%)的一致性细胞，采用恰当的细胞保存液，避免细胞聚集和破坏(存活率>90%)[40]，采用合理的移植途径，减少非靶器官或靶组织的存留，都是保证安全性和有效性不可忽略的环节。
2.5.3   放行检验与复核检验   放行检验应按照标准操作规程，需逐项查对材料来源及人羊膜间充质干细胞的分离、培养、存储及复苏、运送及交接过程，还需留样、长期保存备查。制定切实可行、科学合理、及时有效的复核检验操作程序和质控标准也成为临床移植前的最后一道安全、有效性控制防线，见图2，表1。远程运输的时空条件监测，制剂包装完整性和外观，细胞形态、数量、活力、胎牛血清残留量、内毒素、细菌涂片染色、人羊膜间充质干细胞免疫表型、病原微生物的定量PCR检测及酶联免疫吸附法或多重免疫荧光微球法检测多种细胞因子 [40-41]，都可以准确快速地评价人羊膜间充质干细胞的多种特征与功能活性及制剂安全性。采用法医物证的短串联重复序列分型技术，可对供者人羊膜间充质干细胞进行个体身份核实，确保所用批次、批号准确无误，避免人源细胞交叉污染[40]，STR分型也可应用于受者体内嵌合体形成的监测。

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[15]	房晓磊, 冷 军, 张 晨, 刘会敏, 郭 文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.

近年来，组织工程技术飞速发展，已跨入实现其临床应用与初步产业化的重要阶段，除生物材料之外，优质的种子细胞也为转化应用提供了基本要素。2009年以来，加拿大、欧盟、韩国、美国、澳大利亚和日本等国家/地区已陆续批准14个间充质干细胞产品上市，主要为来源于骨髓和脐带的间充质干细胞，用于治疗儿童急性移植物抗宿主病、克罗恩病、急性心肌梗死、退行性关节炎及膝关节软骨损伤等[1]。据美国国立卫生研究管理的临床研究登记系统(https://www. clinicaltrials.gov/)数据显示，截至2021年3月，全球登记的间充质干细胞临床研究项目共计1 216项，中国有251项，占全球的20.7%；中国已备案的119家干细胞临床研究机构，已备案75个干细胞临床研究项目，获批11款干细胞临床试验申请新药，中国干细胞产品的转化研究虽步入高速期，但尚无上市产品。
间充质干细胞可以从骨髓、脂肪、脐带、脐血、骨骼肌、牙髓、胎盘、羊水及羊膜等多种组织中分离获取[2-4]。胎盘及其附属的羊膜组织作为孕妇分娩后的废弃物，具有来源丰富、采集无创及伦理限制小的突出优势，且羊膜来源的间充质干细胞原始数量级高，免疫原性低，经多次传代扩增后仍能保持良好的增殖分化能力[5-7]，是细胞移植和组织工程的理想种子细胞，已显示出良好的临床应用前景。半透明的羊膜组织主要由中胚层来源的羊膜间充质干细胞和外胚层来源的羊膜上皮细胞及胶原结缔组织组成，作为生物敷料，羊膜应用于创面修复，已有悠久历史[8]。
近20年来，人羊膜间充质干细胞的分离和培养法逐步从酶消化转向组织块贴壁培养，经差速贴壁、传代培养得以纯化，也实现了从胎牛血清、自体血清向无血清培养的转变，人羊膜间充质干细胞生物标志物鉴定及其生物学特征与功能研究不断完善，不同制备工艺对人羊膜间充质干细胞生物活性、功能特征和治疗效果的影响也逐渐明了[9-11]。中国2003年颁布了《人体细胞治疗研究和制剂质量技术指导原则》，2015年以来，针对干细胞制剂的临床研究，陆续出台了《干细胞临床研究管理办法(试行)》《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》《细胞制剂制备通则》等要求[12-13]。
文章将简要介绍人羊膜间充质干细胞生物学特征与功能及其疾病治疗的作用基础，从制备临床级人羊膜间充质干细胞的原料采集、分离、体外扩增到人羊膜间充质干细胞制备实验室条件和质量检定等过程，重点阐述人羊膜间充质干细胞制备与质量控制的关键技术，分析存在的问题和解决策略，并总结质量控制关键与技术标准。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   第一作者在2020年12月进行第一次文献检索，部分文献无具体期卷，第一作者在2021年3月又进行第二次检索，原无期卷的文献在2021年正式刊出。
1.1.2   检索文献时限   最终纳入文献的检索时限为2010年1月至2021年3月。
1.1.3   检索数据库   中国知网、万方数据及PubMed数据库。
1.1.4   检索词   以“间充质干细胞、细胞培养、生物学特征、质量控制、微生物污染”和“mesenchymal stem cells，cell culture，biological characteristic，quality control，microbiology contamination”为检索词。
1.1.5   检索文献类型   研究原著、综述和述评。
1.1.6   手工检索   无。

1.1.7   检索策略   文献检索策略以PubMed数据库为例，见图1。

1.1.8   检索文献量   纳入文献47篇。
1.2   入组标准
1.2.1   纳入标准   纳入文章内容与间充质干细胞、细胞培养方法、生物学特征、质量控制等内容相关的文献。
1.2.2   排除标准   重复性研究。
1.3   数据的提取和质量评估   第一作者提取文献数据后，经过课题组对文题和摘要进行讨论和筛选，最终整理确定选择与设定研究内容相符的文献47篇进行综述分析。

间充质干细胞具有来源方便、安全性较好等优点，用于干细胞产品开发也较为迅速，韩国及欧洲等国家地区均有干细胞制剂作为药物上市。近年来，随着中国干细胞治疗性研究政策的逐步完善，越来越多的干细胞临床研究得以开展，为此国家食品药品检定研究院针对拟上市的干细胞制剂做了一系列评价方法，针对不同的适应证也建立了特殊的效应评价方式，目的是最大程度地保证干细胞制剂的质量要求，确保在临床使用中的安全性和有效性[40]。不同组织来源的细胞，虽然生产方式有差异，但最终质量标准始终统一。
人羊膜作为生物材料，一种来源方便、取材容易、属于医疗废弃物而不受伦理限制等优势，首先以生物材料形式在临床应用广泛，如用于修复烧伤创面、修补组织缺损，肾移植包裹材料等。人羊膜间充质干细胞是羊膜的主要细胞组分之一，具有与间充质干细胞相似的生物学特征和功能，在多种疾病的治疗中显示了广阔的应用前景。为了更好地将人羊膜间充质干细胞作为产品推广至临床，文章也进行了人羊膜间充质干细胞无血清培养、细胞无血清冻存和复苏、以及在无血清优化培养条件下进行了细胞分化、免疫调控及细胞多代次致瘤性实验等。目的在于力争建立标准的细胞制备工艺流程，进行全方位的质量控制体系，科学有效的质量检测方法是确保临床应用细胞制剂安全的保障。
尽管临床级干细胞制剂的制备与质量控制已逐渐形成较为完善的规范，从干细胞制剂制备机构资质的严格准入，制备实验室的监管，到涉及细胞制备过程中人、机、料、法、环的各个环节均做了相应的管理规范，但对于一种带来革命性变化的治疗新产品而言，人们对间充质干细胞制剂的长期效应和潜在风险还缺乏全面的了解，因此，间充质干细胞制剂制备的原辅料、扩增、冻存、复苏及转运等关键环节的工艺质量控制方法和质量鉴定指标的不断优化仍需要持续改进。
随着人们对基因组认识的不断完善及高通量测序新技术的蓬勃发展，供受者遗传背景的了解，遗传缺陷的互补或相同遗传缺陷的筛查与规避，可能是未来对干细胞制剂精准治疗特定疾病和个体化治疗的质量控制新要求。越来越多的研究报道表观遗传修饰，如microRNA和甲基化等对干细胞生物学特性和功能也可产生明显影响[43-45]，衰老人羊膜间充质干细胞的microRNA及其外泌体分泌也会发生明显改变[20]，都提示对人羊膜间充质干细胞等间充质干细胞基因表达谱及表观遗传修饰机制的深入研究，很可能为间充质干细胞制剂的精准质控与质量评价提供新措施和新指标，进而研发具有特定功能或功能增强型人羊膜间充质干细胞制剂，基因修饰造血干细胞救治地中海贫血与糖尿病酶缺陷导致的重症联合免疫缺陷患者的成功 [46-47]，已开启干细胞精准修饰、精准分型、精准分化和精准应用新制剂研发的新未来。  
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
人羊膜间充质干细胞：是一群来源于人羊膜组织，具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。细胞呈梭形，细胞贴壁生长、免疫表型和多向分化潜能与骨髓来源间充质干细胞相似。
干细胞制剂：用于治疗疾病或改善健康状况的、以不同类型干细胞为主要成分、符合相应质量及安全标准，且具有明确生物学效应的细胞制剂。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人羊膜间充质干细胞是再生医学理想的种子细胞之一，已在多种疾病治疗中显示了良好的应用前景，对人羊膜间充质干细胞制备关键技术的有效控制，保障制剂符合质量要求，是实现人羊膜间充质干细胞临床应用安全性和有效性的根本。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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