骨疏康干预Beagle犬磨牙压低过程中转化生长因子β1及β-连环蛋白的表达

doi:10.12307/2023.511

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4502-4506.doi: 10.12307/2023.511

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骨疏康干预Beagle犬磨牙压低过程中转化生长因子β1及β-连环蛋白的表达

万哲1，杜军1，胡杨2

1新疆医科大学附属中医医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；2新疆医科大学第一附属医院口腔医院口腔种植修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2022-06-14 接受日期:2022-08-05 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 胡杨，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院口腔医院口腔种植修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:万哲，男，1975年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，2005年新疆医科大学毕业，副主任医师，主要从事口腔错牙合畸形的矫正研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2019D01C185)，项目负责人：万哲

Effects of Gushukang on transforming growth factor beta1 and beta-catenin during molar intrusion in Beagle dogs

Wan Zhe1, Du Jun1, Hu Yang2

1Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Implant and Prosthodontics, Stomatological Hospital, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2022-06-14 Accepted:2022-08-05 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: Hu Yang, Associate chief physician, Department of Implant and Prosthodontics, Stomatological Hospital, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wan Zhe, Associate chief physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2019D01C185 (to WZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

转化生长因子β1：是一类细胞生长因子，对成骨细胞的增殖分化和分泌起到促进作用；对于骨、牙骨质、牙本质等矿化组织的基质形成及重建起到重要作用。转化生长因子β1的高表达可以增强成骨细胞的活性，从而对牙周组织的改建有积极作用。
β-连环蛋白：是成骨细胞增殖和分化的关键基因，可以增强成骨细胞活性，调控成骨细胞定向分化，β-连环蛋白能够刺激成骨细胞上调骨保护素的表达，抑制破骨细胞的分化和活性，从而抑制骨吸收。

背景：骨疏康可以有效促进破骨细胞的凋亡、提高骨密度和骨矿含量、抑制骨吸收。但骨疏康在牙根吸收方面作用的研究匮乏，其调控作用机制尚不清楚。
目的：探讨骨疏康在Beagle犬正畸牙根吸收过程中的治疗效果及其对转化生长因子β1、β-连环蛋白表达的影响。
方法：将16只Beagle犬随机分为正常对照组(n=4)、蒸馏水组(n=6)与骨疏康组(n=6)，正常对照组不进行任何干预，蒸馏水组与骨疏康组建立上颌第一磨牙压低模型，造模后分别每天灌胃蒸馏水与骨疏康(2.1 g/kg)。干预6，9，12周，收集上颌第一磨牙牙根和牙周组织，采用苏木精-伊红染色观察病理变化，免疫组化检测转化生长因子β1、β-连环蛋白的表达水平。

结果与结论：①第一磨牙随时间推移有明显压低现象出现，在第12周效果最为明显；②苏木精-伊红染色显示，蒸馏水组磨牙组织随着加力时间周期的不断延长，破骨细胞数量呈上升趋势，骨吸收现象不断加重；骨疏康组磨牙的根吸收程度轻于蒸馏水组，骨修复能力和牙周组织的改建能力优于蒸馏水组；③蒸馏水组磨牙组织转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达量显著低于正常对照组(P < 0.05)；骨疏康组磨牙组织中转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达水平随时间推移呈上升趋势，在9周和12周的表达水平显著高于蒸馏水组(P < 0.05)；④结果表明，骨疏康可能通过激活调节转化生长因子β1和β-连环蛋白，促进Beagle犬磨牙骨组织的成骨分化。

https://orcid.org/0000-0003-0153-2810(万哲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 根吸收, 骨疏康, 转化生长因子β1, β-连环蛋白, Beagle犬, 正畸牙

Abstract: BACKGROUND: Gushukang can effectively promote apoptosis of osteoclasts, increase bone mineral density and bone mineral content, and inhibit bone resorption. However, studies on root resorption are scarce and its regulatory mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Gushukang on root resorption and expression of transforming growth factor-β1 and β-catenin in Beagle dogs.
METHODS: Sixteen Beagle dogs were randomly divided into normal control group (n=4), distilled water group (n=6), and Gushukang group (n=6). Normal control group did not do any treatment. Distilled water group and Gushukang group established Maxillary first molar intrusion models were established in the distilled water and Gushukang groups. After modeling, distilled water and Gushukang groups were intragastrically given distilled water and Gushukang at a dose of 2.1 g/kg body mass respectively. After 6, 9, and 12 weeks of intervention, Beagle dogs were anesthetized to collect root and periodontal tissues of the maxillary first molars. The pathological changes were observed by hematoxylin-eosin staining and the expression levels of transforming growth factor-β1 and β-catenin were detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The maxillary first molars were obviously intruded over time, especially at the 12th week. The results of hematoxylin-eosin staining revealed that the number of osteoclasts in molar tissue increased in the distilled water group with the prolongation of loading, accompanied by aggravated bone resorption. The Gushukang group had less resorption of molar root and better ability of bone repair and periodontal tissue remodeling than the distilled water group. The expression levels of transforming growth factor-β1 and β-catenin in the distilled water group were significantly lower than those in the normal control group (P < 0.05), while the expression levels of transforming growth factor-β1 and β-catenin in molar tissue of the Gushukang group increased with time, which were significantly higher than those in the distilled water group at the 9th and 12th weeks (P < 0.05). To conclude, Gushukang could regulate transforming growth factor-β1 and β-catenin and promote osteogenic differentiation of molar bone tissue in Beagle dogs.

Key words: root absorption, Gushukang, transforming growth factor-β1, , β-catenin, Beagle dog, orthodontic tooth

中图分类号:

万哲, 杜军, 胡杨. 骨疏康干预Beagle犬磨牙压低过程中转化生长因子β1及β-连环蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4502-4506.

Wan Zhe, Du Jun, Hu Yang. Effects of Gushukang on transforming growth factor beta1 and beta-catenin during molar intrusion in Beagle dogs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4502-4506.

图/表（结果） 3

2.1 Beagle犬一般观察情况此次研究所用的模型犬无死亡发生，饮水进食正常，体质量、毛色和身体情况较好，口腔环境良好，无明显炎症反应。种植钉没有出现松动现象，橡皮链无脱落发生。比较蒸馏水组和骨疏康组的第一磨牙，随时间推移有明显压低现象出现，在第12周效果最为明显，见图1。

2.2 上颌第一磨牙牙根及牙周组织的病理变化通过苏木精-伊红染色检测磨牙组织，正常对照组牙根完整，根尖及牙周膜细胞均匀分布，细胞呈梭形排列。加力6周后，细胞形态不规则，可见少量破骨细胞，蒸馏水组的破骨细胞数量较骨疏康组多；加力9周后，细胞形态不规则，牙槽骨出现明显的骨吸收陷窝，吸收陷窝内可见大量破骨细胞、巨噬细胞，出现骨吸收现象，也可见部分成骨细胞、成牙骨质细胞，蒸馏水组的骨吸收陷窝的深度及面积较骨疏康组大；加力12周后，蒸馏水组的破骨细胞数量增加，骨吸收现象加重，骨疏康组的成骨细胞增多，破骨细胞数量降低，有少量新骨形成。苏木精-伊红染色检测结果表明，骨疏康组的根吸收程度轻于对照组，骨修复能力和牙周组织的改建能力优于蒸馏水组，见图2。

2.3 骨疏康促进转化生长因子β1、β-连环蛋白的表达采用免疫组化检测磨牙组织中转化生长因子β1和β-连环蛋白表达水平。转化生长因子β1定位于细胞外基质，染色后阳性呈现棕黄色；β-连环蛋白定位于细胞质、细胞骨架上，染色后阳性呈现棕色。实验结果显示，蒸馏水组转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达水平显著低于正常对照组，棕色区域染色较浅(P < 0.05)。在骨疏康干预后，转化生长因子β1的表达水平随时间推移呈上升趋势，棕色区域染色较深，在9周和12周的表达水平显著高于蒸馏水组；β-连环蛋白的表达水平随时间推移呈上升趋势，棕色区域染色较深，在9周和12周的表达水平显著高于蒸馏水组和正常对照组(P < 0.05)，见图3。这些分析结果显示，骨疏康可以通过促进转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达来影响根吸收。

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引言

正畸牙移动是一种牙颌复合体动态平衡受外力干预后生物反应的结果[1]。该生物反应的基础即为牙周组织的重塑，包括骨组织的可塑性、牙骨质的抗压性和牙周膜内环境的稳定性等[2]。尽管随着正畸理念更新和技术进步，截冠修复、外科矫正、正畸压入、种植钉等被大量运用于临床，但正畸治疗中不可避免发生的并发症成为正畸医师和患者关注的焦点[3-9]。已有研究表明，正畸疗程、正畸力的大小和作用时间是牙根吸收的潜在危险因素[10]。牙根吸收是一种进行性的炎症反应，发病因素复杂，正畸治疗患者中牙根吸收发生率较高。研究表明，约90%的正畸牙患者均可见不同程度的牙根吸收，给正畸治疗中的牙槽骨改建带来极大的风险与挑战。
尽管牙根吸收问题普遍存在，但临床上缺少有效的治疗手段，已有的治疗方式皆具有一定的局限性，无法推广应用[8]。中医理论认为“肾为先天之本”“肾藏精生髓主骨”“其充在骨”。《灵枢·经脉》指出“足少阴气绝则骨枯……故骨不濡则肉不能著也，骨肉不相亲则肉软却……发无泽者骨先死。”《医经精义·中卷》指出“肾藏精，精生髓，髓养骨，故骨者，肾之合也，髓者，精之所生也，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”说明肾、骨、髓之间存在密切的生理联系。《内经》又指出“肾不生，则髓不能满，火不胜火，骨枯而髓虚，足不任身”“腰者，肾之府，转摇不能，肾将惫矣” “骨者，髓之府，不能久立，行则振掉，骨将惫矣”[11-13]。根据中医“肾主骨”理论指导下的补肾法在成骨治疗中占有重要地位。骨疏康由淫羊藿、骨碎补、黄芪、熟地黄、丹参等多种中药组成。目前实验和临床上的大量研究表明，骨疏康可以有效促进破骨细胞凋亡、提高骨密度和骨矿含量、抑制骨质疏松大鼠的骨吸收，从而延缓骨丢失和治疗骨质疏松症[14-15]，但在牙根吸收方面的研究匮乏。
该研究以Beagle犬为研究对象，建立犬上颌第一磨牙压低动物模型，采用骨疏康干预治疗，分别于第6，9，12周进行病理学观察，免疫组化检测转化生长因子β1和β-连环蛋白的蛋白表达，探讨骨疏康在牙根吸收发生发展过程中的作用疗效及作用机制，为正畸临床中牙根吸收的预防和治疗提供理论参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，对计量资料进行单因素方差分析，采用LDS法进行两两比较。
1.2 时间及地点实验于2020年10月至2021年7月在新疆医科大学动物实验中心进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性Beagle犬16只，365-390日龄，体质量(12±1) kg，均为恒牙列、牙列完整形态正常、牙齿及牙周健康、无明显的错牙合畸形，口腔环境及牙列形态基本相一致，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证编号：1107292011000023。
该研究经新疆医科大学动物实验管理中心伦理委员会批准，伦理审批号：IACUC202101113-01。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 药物及实验试剂 β-连环蛋白兔多克隆抗体、转化生长因子β1兔多克隆抗体(Proteintech，中国)。苏木素(Sigma，美国)；伊红Y(水溶性)(国药集团，中国)；中性树胶(国药集团，中国)；DAB 浓缩型试剂盒(Solarbio，中国)；骨疏康(胶囊，溶于水后用于灌胃，辽宁康辰药业有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组适应性喂养1个月后，将Beagle犬随机分为正常对照组4只、蒸馏水组6只和骨疏康组6只。正常对照组不做任何处理，正常饲养；蒸馏水组在建模后给予蒸馏水灌胃；骨疏康组在建模后给予骨疏康制剂灌胃，给药剂量为 2.1 g/kg，于每天早晨10点灌胃1次，灌胃12周。
1.4.2 犬上颌第一磨牙压低动物模型的建立
(1)种植钉的植入：将Beagle犬称质量后，按照0.1 mL/kg肌注现配好的1∶1舒泰50与速眠新，5 min左右Beagle犬陷入深度睡眠，药效持续0.5-1 h。植入部位局部消毒后，在上颌右侧第一磨牙与第二磨牙颊侧和腭侧牙槽间隔附着龈与黏膜交界处，先用手术刀做切口，剥离牙龈黏骨膜，使用专用工具将微型种植体缓慢旋入适宜深度。若骨皮质坚硬，则先用先锋钻穿破骨皮质，再旋入微型种植体，在手术全过程中严格无菌操作。

(2)矫治器的安置与施力：以橡皮链施力，使橡皮链跨越牙齿的牙合面，两端固定于颊腭侧的种植钉上，使用测力计测量加力值100 g。术后加强对Beagle犬的护理，增加保温措施，进食高蛋白软食补充营养，自由饮水，术后连续3 d肌注8×104 U/kg青霉素钾，1次/d，口服甲硝唑片，2片/次，2次/d，预防感染发生。时刻关注Beagle犬身体情况，精神状态，检查微种植体是否脱落，链状橡皮筋是否在位，及时做出调整，每4周更换1次链状橡皮筋并使用正畸专用测力计施加力值。

1.4.3 上颌第一磨牙牙根及牙周组织的组织学观察在实验的第6，9，12周完整取出 Beagle 犬双侧上颌第一磨牙及其牙周组织(正常对照组每个时间点1只，蒸馏水组和骨疏康组每个时间点2只)，经固定、脱钙、脱水、石蜡包埋；沿牙长轴矢状向和冠状向切片，蒸馏水冲洗切片，滴加苏木精染色；滴加体积分数1%盐酸乙醇分化 2 s，待组织变红，蒸馏水洗至组织呈蓝紫色，伊红染色；无水乙醇脱水，滴加中性树胶，封固，镜下观察上颌第一磨牙牙根的形态学变化。
1.4.4 上颌第一磨牙牙根及牙周组织的免疫组化染色观察切片常规脱蜡水化，加入体积分数为3%H2O2室温处理10 min，在枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中微波加热10 min(92-98 ℃)进行抗原修复，冷却后体积分数为5%小牛血清室温处理10 min，分别滴加1∶100稀释的转化生长因子β1、β-连环蛋白一抗抗体，4 ℃孵育过夜，再分别滴加1∶200稀释的二抗，室温处理30 min，再加SP(1∶100)工作液室温处理30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封固后光镜下观察并摄片。
1.5 主要观察指标 ①各组Beagle犬磨牙压低情况；②各组Beagle犬磨牙组织苏木精-伊红染色结果；③各组Beagle犬磨牙组织转化生长因子β1、β-连环蛋白的表达。
1.6 统计学分析所有数据利用SPSS 25.0软件进行数据处理，组间比较进行单因素方差分析，进一步两两比较使用LDS分析，两组独立样本比较采用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经新疆医科大学附属中医医院生物统计学专家审核。

讨论

在牙周处于健康状态下，破骨细胞与成骨细胞的代谢水平处于相对平衡的状态[16-18]。当牙齿处于正畸状态下，压力侧牙槽骨吸收，张力侧牙槽骨形成，是正畸牙移动、牙槽骨改建的重要机制[19-20]。然而张力侧破骨细胞的大量活化，易导致出现牙根吸收的问题。在正畸治疗过程中，通过施加最合适的矫治力实现磨牙压低，且磨牙压低不会出现明显不适和继发性病理性损伤。同时，最适正畸力不应阻碍牙周组织正常血运循环，尽可能避免透明样变和牙槽骨潜行性吸收，同时促进生理性的成骨与破骨活动，实现牙齿移动。
鼠、兔、猴、猪、犬是常用于正畸研究的实验动物模型，但是没有任何一种动物模型能够完全模拟人类颌骨的发展和重建。鼠和兔属于中小型动物，其体积小、口裂小、视野不清晰，不利于手术操作。猴的进化更为先进，与人体的组织形态更为相似，但其价格昂贵、配合性差、不便于饲养。猪在牙齿形态、骨密度、解剖结构和骨重建率及愈合方面是最接近人类的，但是猪也因为生长速度太快、过重、难控制性这些缺点而不作为动物模型的第一选择。Beagle犬体型适中、性格温顺、口裂较大、易于人工喂养，并且实验操作难度系数较低，其牙列与人类相似，主要发挥咀嚼功能的第一磨牙位于牙弓后段，为多尖牙，有助于垂直向加力装置的固位；上颌第一磨牙在Beagle犬大张口状态下能够更好地暴露，为种植体植入提供了良好的操作空间，是更为常用的模型动物[21]。
微种植钉压低磨牙的过程中，牙根吸收的程度与压力大小和作用时间有直接的相关性[22]。压低力过小，磨牙无法压低；压低力过大则容易引起牙根的不可逆性吸收，因此选择合适的压低力值是磨牙压低成功与否的关键因素。在此次研究中使用100 g的恒定力值，作用时间为12周，来观察Beagle犬磨牙压低效果及压低过程中牙根吸收的情况。就恒定力选择角度出发，根据SCHWARTZ[23]研究结论，最适宜的矫治力不宜超过20-26 g /cm2，该范围内的矫治力在长期作用过程中可以引发磨牙组织的移动而不损伤牙根及牙周组织。已有研究表明，施加100 g力压低犬第三前磨牙，10周后平均压低4.5 mm[24]。此次研究根据已有报道选择100 g恒定力值作为Beagle犬压低实验的力值，同时在不同时间段获取磨牙组织过程中，牙周组织健康，磨牙形态较好。磨牙压低的时间长度与牙根吸收程度呈正相关关系[25]。就作用时间角度出发，已有研究发现用微种植体压低磨牙，仅2个月即获得了3.0-3.5 mm的上颌磨牙压低[26]。还有报道表明在Beagle犬压低磨牙的三维形态学研究表明在实验第12周牙根吸收量效果最好[27]。因此，此次研究选择了3个时间点作为研究周期，在6，9，12周观察Beagle犬磨牙压低效果。实验结果表明，在压低过程中，Beagle犬磨牙随时间推移明显发生了压低效果，12周的效果最佳，与已有报道结果一致。
为了进一步了解磨牙压低过程中磨牙牙根吸收情况及骨疏康在牙根吸收方面的作用。对磨牙组织进行了苏木精-伊红染色实验，结果发现，在压低过程中，随着加力时间的延长，根吸收程度加重，骨疏康组根吸收程度轻于蒸馏水组，骨修复能力强于蒸馏水组。从病理角度表明了骨疏康可以对根吸收进行预防和治疗。
在此次研究中，对磨牙组织进行转化生长因子β1和β-连环蛋白的免疫组化检测，实验结果表明，在骨疏康干预后，转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达量较蒸馏水组显著升高，且随着用药时间的延长，转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达量不断增加。转化生长因子β1 是一类细胞生长因子，具有调控成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原蛋白合成，从而促进骨形成的作用[28]，对于骨、牙骨质、牙本质等矿化组织的基质形成及重建起到重要作用。已有研究表明，转化生长因子β1可以提高牙髓干细胞的成骨分化，修复骨损伤[29]。转化生长因子β1的高表达可以增强成骨细胞的活性，从而对牙周组织的改建有积极作用[30]。转化生长因子β1还可抑制破骨细胞的形成和分化，还能诱导破骨细胞的程序性死亡。已有研究表明，低浓度转化生长因子β1可提高巨噬细胞集落刺激因子水平和 RANKL/OPG比例，对破骨细胞的分化具有促进作用[31]；高浓度转化生长因子β1可抑制骨髓细胞的破骨细胞分化[32]。β-连环蛋白基因是成骨细胞增殖和分化的关键基因，可增强成骨细胞活性，调控成骨细胞分化。YE 等[33]研究显示 GP-12 以剂量依赖方式激活β-连环蛋白表达水平，改变细胞周期进程来促进成骨细胞增殖。β-连环蛋白能刺激成骨细胞上调OPG表达，增加OPG/RANKL的比例，抑制破骨细胞分化和活性，从而抑制骨吸收[34]。因此，在骨疏康干预治疗后显著促进了Beagle犬磨牙的成骨分化。
综上所述，骨疏康可能通过激活调节转化生长因子β1和β-连环蛋白，促进Beagle犬磨牙骨组织的成骨分化，维持骨基质，为正畸后牙根吸收的预防及治疗提供了一定的理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨疏康干预Beagle犬磨牙压低过程中转化生长因子β1及β-连环蛋白的表达

Effects of Gushukang on transforming growth factor beta1 and beta-catenin during molar intrusion in Beagle dogs

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