黄芪甲苷可减轻白细胞介素1β诱导软骨细胞的炎症反应

doi:10.12307/2023.435

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (26): 4113-4119.doi: 10.12307/2023.435

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黄芪甲苷可减轻白细胞介素1β诱导软骨细胞的炎症反应

黄少烁1，李嘉程1，骆帝2，朱凯1，许波2，薛远亮1，阎博昭1，李刚1

1山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014；2山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014

收稿日期:2022-04-27 接受日期:2022-06-29 出版日期:2023-09-18 发布日期:2023-01-20
通讯作者: 李刚，博士，教授，主任医师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014
作者简介:黄少烁，女，1995年生，广东省汕头市人，汉族，山东中医药大学在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金(82074453)，项目负责人：李刚；山东省医药卫生科技发展计划项目(202004071045)，项目负责人：许波

Astragaloside IV can reduce interleukin-1beta-induced chondrocyte inflammation

Huang Shaoshuo1, Li Jiacheng1, Luo Di2, Zhu Kai1, Xu Bo2, Xue Yuanliang1, Yan Bozhao1, Li Gang1

1The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 2The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2022-04-27 Accepted:2022-06-29 Online:2023-09-18 Published:2023-01-20
Contact: Li Gang, MD, Professor, Chief physician, The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Huang Shaoshuo, Master candidate, The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82074453 (to LG); Shandong Medical and Health Science and Technology Development Project, No. 202004071045 (to XB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

黄芪甲苷：是中药黄芪中主要的有效活性成分之一，大量研究证实其具有治疗关节炎的作用，对软骨蛋白聚糖合成和软骨细胞增殖具有保护作用。
SDF-1/CXCR4信号通路：基质细胞衍生因子1(SDF-1)是由骨髓基质细胞持续分泌的一种炎性趋化因子，与趋化因子受体4(CXCR4)结合并激活，在多种组织、细胞中广泛表达，对细胞的动员、迁移、增殖和存活起着重要的作用。

背景：骨性关节炎是一种最常见的退行性疾病，但目前仍无延缓或逆转病情的药物，只能消炎镇痛以短期内缓解症状、改善病情。黄芪甲苷是黄芪中一种具有调节免疫、缺血保护、心脏保护、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等作用的活性成分。
目的：探讨黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的小鼠骨关节软骨细胞ATDC5损伤的作用及相关机制。
方法：将ATDC5细胞随机分为空白对照组、模型组、单体组、实验组。空白对照组细胞不加任何干预；模型组细胞用100 μg/L白细胞介素1β处理；单体组细胞用5 μg/L黄芪甲苷处理，实验组细胞用100 μg/L白细胞介素1β和5 μg/L黄芪甲苷处理。干预18 h后，采用CCK-8检测细胞增殖活性，Western blot和qRT-PCR检测基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13、Ⅱ型胶原、SDF-1、CXCR4的蛋白和mRNA表达变化，甲苯胺蓝染色检测细胞形态改变和细胞数量，锥虫蓝染色检测细胞存活率。

结果与结论：①与空白对照组比较，白细胞介素1β(100 μg/L)明显抑制ATDC5细胞的增殖活性，相关炎症标志物基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的表达升高，Ⅱ型胶原的表达降低，SDF-1、CXCR4的表达升高，SDF-1/CXCR4信号通路激活，诱导细胞出现炎症反应；②与模型组比较，实验组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的表达降低，Ⅱ型胶原的表达升高，证实黄芪甲苷可以减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞损伤；③此外，与模型组比较，实验组CXCR4、SDF-1的表达降低，证实了黄芪甲苷是通过SDF-1/CXCR4信号通路减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应。

https://orcid.org/0000-0001-8122-1830(李刚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨性关节炎, 黄芪甲苷, SDF-1/CXCR4信号通路, ATDC5细胞, 炎症反应

Abstract: BACKGROUND: Osteoarthritis is one of the most common degenerative diseases, and there are still no drugs to delay or reverse the disease. Only anti-inflammatory and analgetic treatments can be performed to relieve symptoms and improve patient’s conditions in the short term. Astragaloside IV is an active component of Astragalus membranaceus with immunomodulatory, ischemic protection, cardiac protection, anti-inflammatory, antiviral, and anti-tumor effects.
OBJECTIVE: To investigate the effects of astragaloside IV on interleukin-1β-induced ATDC5 cell injury and its related mechanism.
METHODS: ATDC5 cells were randomly divided into blank control group, model group, monomer group, and experimental group. There was no intervention in the blank control group. Cells in the latter three groups were treated with 100 μg/L interleukin-1β, 5 μg/L astragaloside IV, and 100 μg/L interleukin-1β+5 μg/L astragaloside IV, respectively. After 18 hours of treatment, cell counting kit-8 was used to detect cell proliferation. Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression of matrix metalloproteinases 3, 9, 13, type II collagen, stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), and C-X-C chemokine receptor 4 (CXCR4) at protein and mRNA levels, respectively. Toluidine blue staining was used to detect cell morphological changes and cell numbers, and trypan blue staining was used to detect cell viability.
RESULTS AND CONCLUSION: Interleukin-1β (100 μg/L) significantly inhibited the activity of ATDC5 cells, increased the expression of inflammatory markers (matrix metalloproteinases 3, 9, and 13), decreased the expression of type II collagen, increased the expression of SDF-1 and CXCR4, activated the SDF-1/CXCR4 pathway, and induced inflammatory responses in cells. Compared with the model group, astragaloside IV significantly reduced the expression of matrix metalloproteinases 3, 9, and 13, and increased the expression of type II collagen, indicating that astragaloside IV can alleviate chondrocyte injury induced by interleukin-1β. In addition, the expression of CXCR4 and SDF-1 was decreased in the experimental group compared with the model group, indicating that astragaloside IV alleviates interleukin-1β-induced chondrocyte inflammation through the SDF-1/CXCR4 signaling pathway.

Key words: osteoarthritis, astragaloside IV, SDF-1/CXCR4 signaling pathway, ATDC5 cell, inflammatory response

中图分类号:

黄少烁, 李嘉程, 骆帝, 朱凯, 许波, 薛远亮, 阎博昭, 李刚. 黄芪甲苷可减轻白细胞介素1β诱导软骨细胞的炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4113-4119.

Huang Shaoshuo, Li Jiacheng, Luo Di, Zhu Kai, Xu Bo, Xue Yuanliang, Yan Bozhao, Li Gang. Astragaloside IV can reduce interleukin-1beta-induced chondrocyte inflammation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(26): 4113-4119.

图/表（结果） 7

2.1 黄芪甲苷能减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应
2.1.1 黄芪甲苷能提高白细胞介素1β诱导的软骨细胞活力采用CCK-8法分析黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的软骨细胞活力的影响，见图1。图1A显示白细胞介素1β诱导的软骨细胞活性较空白对照组明显降低，且细胞活性与白细胞介素1β的浓度呈反比，考虑含250 μg/L白细胞介素1β的培养基中培养基的比例过低，为避免实验干扰，选择100 μg/L白细胞介素1β进行造模。图1B显示单独使用黄芪甲苷(1，2.5，5 μg/L)后细胞增殖率均接近100%，认为黄芪甲苷对细胞存活率没有明显影响。图1C显示白细胞介素1β诱导后的软骨细胞中加入黄芪甲苷(1，2.5，5 μg/L)干预后细胞存活率较模型组有所改善，其中改善效果最佳的黄芪甲苷质量浓度是5 μg/L，且药物起效时间在12-24 h之间，实验药物干预时间设定为18 h。

2.1.2 黄芪甲苷能减少白细胞介素1β诱导后软骨细胞中相关炎症标志物的表达采用qRT-PCR法分析黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的软骨细胞中炎症标志物表达的影响，见图2。模型组较空白对照组软骨细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的基因表达显著上升，Ⅱ型胶原的基因表达下降，而实验组较模型组软骨细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的基因表达下降，Ⅱ型胶原的基因表达上升。

采用Western blot法分析黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的软骨细胞中炎症标志物表达的影响，见图3。模型组较空白对照组软骨细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的蛋白表达显著上升，Ⅱ型胶原的蛋白表达量明显下降，而实验组较模型组软骨细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的蛋白表达明显有所下降，Ⅱ型胶原的蛋白表达量则上升，单体组对软骨细胞中炎症标志物的蛋白表达没有明显影响。

2.1.3 黄芪甲苷能够改善白细胞介素1β诱导的软骨细胞形态及细胞增殖甲苯胺蓝染色后，镜下观察软骨细胞发现，模型组较空白对照组固缩细胞数量显著增多，且整体细胞数量明显减少，而实验组的固缩细胞数量相对于模型组明显较少，整体细胞数量较模型组多，单体组细胞形态和数量与空白对照组相近，见图4A-D。大体观察染色细胞发现，细胞数量由少到多分别是：模型组、实验组、空白对照组，单体组软骨细胞数量与空白对照组接近，见图4E。

锥虫蓝染色后在自动细胞计数仪下分析结果显示，空白对照组的细胞存活率为95.1%，模型组的细胞存活率为64.7%，单体组的细胞存活率为93.9%，实验组的细胞存活率为89.7%。模型组较空白对照组细胞存活率明显降低，且视野中细胞数量较少，细胞悬液中的细胞浓度明显较低，而实验组的细胞存活率高于模型组，细胞数量也更多，单体组的细胞存活率与空白对照组相近，见图5。

2.2 黄芪甲苷通过SDF-1/CXCR4信号通路减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应 qRT-PCR法分析黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的软骨细胞中SDF-1/CXCR4信号通路相关因子基因表达的影响，见图6。模型组较空白对照组软骨细胞中SDF-1、CXCR4的基因表达显著上升，而实验组较模型组软骨细胞中SDF-1、CXCR4的基因表达显著下降。

Western blot法分析黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的软骨细胞中SDF-1/CXCR4信号通路相关因子蛋白表达的影响，见图7。模型组较空白对照组软骨细胞中SDF-1、CXCR4的蛋白表达显著上升，而实验组较模型组软骨细胞中SDF-1、CXCR4的蛋白表达有所下降，单体组对软骨细胞中SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白的表达没有显著影响。

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引言

骨性关节炎是一种最常见的退行性疾病，以关节软骨退化损伤、软骨下骨板硬化和骨赘形成为主要病理改变[1]，临床表现为关节疼痛、肿胀、功能障碍等，对患者的生活和工作产生了极大的影响[2]。临床治疗上，早期骨性关节炎主要以非类固醇抗炎药消炎镇痛为主，但不良反应较多，不宜长期使用，并且不能延缓病情，而晚期患者大多只能通过膝关节置换术改善关节功能和生活质量，但创伤较大并且假体有一定的使用年限[1，3-4]。骨性关节炎确切的发病机制至今未明，在现有研究中，大部分学者认为骨性关节炎的进程与关节软骨的改变息息相关，是由软骨细胞、细胞外基质的破坏引起[5-7]。骨性关节炎中白细胞介素1β等各种炎症因子的表达，刺激软骨产生各种降解酶，如基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13等，使得细胞外基质中Ⅱ型胶原和蛋白多糖减少[8-9]。因此，通过抑制炎症因子的表达来缓解骨性关节炎的炎症反应可能会成为防治骨性关节炎的一项有效手段。
黄芪甲苷是中药黄芪中主要的有效活性成分之一，在近年来的研究中被证实能抑制炎症因子表达并改善骨性关节炎模型小鼠的软骨变性[10]，但黄芪甲苷抑制骨性关节炎软骨细胞炎症反应的作用机制目前还不明确。以往研究中，骨性关节炎的进展与许多细胞因子及相关的信号通路调节关系密切，如基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及其受体CXC趋化因子受体4(C X C chemokine receptor 4，CXCR4)介导了软骨的损伤过程，上调了基质金属蛋白酶的表达，导致骨性关节炎软骨的破坏[11]。该研究首次针对黄芪甲苷通过SDF-1/CXCR4信号通路对白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应的影响进行探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照实验性研究。将ATDC5细胞随机对照分组后进行药物干预，用CCK-8、甲苯胺蓝染色、锥虫蓝染色检测细胞活性、形态及存活率，用Western blot、qRT-PCR检测炎症指标及信号通路相关因子的表达。
1.2 时间及地点实验于2021年3月至2022年3月在山东省药学科学院博士后工作站实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂和仪器基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、CXCR4、Ⅱ型胶原一抗(华安生物，中国)；基质金属蛋白酶13一抗(Proteintech，中国)；SDF-1、β-actin一抗(ABclonal，中国)；山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶标记二抗(Elabscience，中国)；白细胞介素1β(PeproTech，美国)；黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)；CCK-8(MCE，中国)；二甲基亚砜(Proteintech，中国)；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液(强)(碧云天，中国)；超敏ECL化学发光试剂盒(Thermo Fisher，P90712、P90713)；SPARK script Ⅱ RT Plus试剂盒、SPARK SYBR
Green qRT-PCR试剂盒、SPARKeasy组织/细胞RNA快速提取试剂盒(Spark Jade，中国)；甲苯胺蓝染色液、0.4%锥虫蓝染液(Solarbio，中国)；ProXima 280化学发光成像系统(Bio-Rad，美国)；Nano-100超微量核酸分析仪(杭州奥盛仪器有限公司)；Infinite M200PRO多功能酶标仪(TECAN，瑞士)；6325XQ601089梯度PCR仪(Eppendorf，德国)；Heracell 240i细胞恒温培养箱(Thermo Fisher，美国)；Sorvall Lynx 6000落地式高速低温离心机(Eppendorf，德国)；Sorvall ST1 Plus台式高速冷冻离心机(Thermo，美国)；QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪(Thermo，美国)；LUNA-Ⅱ自动细胞计数仪。
1.3.2 实验细胞及培养液 ATDC5细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)；胎牛血清(兰杰柯科技有限公司)；低糖DMEM培养基(美国Gibco，批号为8121495)；1×PBS、胰酶细胞消化液(中国Biosharp，批号分别为21151636，21326765)。
将ATDC5细胞接种到培养皿中，加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长至80%，弃去上层培养基，用PBS漂洗，加入2 mL胰酶消化液，室温消化2 min，加入2 mL培养基终止消化，吹打下贴壁细胞，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，按照1∶4比例进行传代培养。
1.4 实验方法
1.4.1 CCK-8法分析ATDC5细胞活性
(1)构建炎症模型：将ATDC5细胞按2 000个/孔的密度接种于4块96孔板中，在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养24 h贴壁后，弃去上层培养基，每孔加入含0-250 μg/L白细胞介素1β的完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基)100 μL，干预8，12，24，48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培养箱孵育1 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度值。
(2)探索黄芪甲苷干预的最佳质量浓度：将ATDC5细胞按2 000个/孔的密度接种于4块96孔板内，培养贴壁后，弃去上层培养基，分别加入完全培养基、含100 μg/L白细胞介素1β的完全培养基、含1，2.5，5 μg/L黄芪甲苷的完全培养基、含100 μg/L白细胞介素1β+1 μg/L黄芪甲苷的完全培养基、含100 μg/L白细胞介素1β+2.5 μg/L黄芪甲苷的完全培养基、含100 μg/L白细胞介素1β+5 μg/L黄芪甲苷的完全培养基，干预8，12，24，48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培养箱孵育1 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度值。
1.4.2 细胞的分组和处理将ATDC5细胞随机分为空白对照组、模型组(100 μg/L白细胞介素1β组)、单体组(5 μg/L黄芪甲苷组)、实验组(100 μg/L白细胞介素1β+5 μg/L黄芪甲苷组)。空白对照组细胞不加任何干预；模型组细胞用100 μg/L白细胞介素1β处理；单体组细胞用5 μg/L黄芪甲苷处理，实验组细胞用100 μg/L白细胞介素1β和5 μg/L黄芪甲苷处理。

1.4.3 RNA提取与定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析按实验分组干预18 h后的各组ATDC5细胞，使用SPARKeasy组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取各组细胞的RNA，用SPARKscript Ⅱ RT Plus试剂盒将RNA反转录为cDNA，用SPARK SYBR Green qRT-PCR试剂盒处理cDNA并在QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪上检测各组细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13、Ⅱ型胶原、SDF-1、CXCR4的基因表达。引物序列见表1。

1.4.4 甲苯胺蓝染色将ATDC5细胞按4×104个/孔接种于6孔板内，按实验分组干预18 h后，弃去孔中废液，加入1 mL PBS漂洗，使用体积分数为95%乙醇固定细胞后用甲苯胺蓝染色液进行染色，冲洗晾干后大体及镜下观察各组细胞形态、数量。
1.4.5 锥虫蓝染色将ATDC5细胞按4×104个/孔接种于6孔板内，按实验分组干预18 h后，收集各组细胞，用完全培养基重悬制备细胞悬液，取100 μL细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以1∶1比例混合均匀，染色3 min，在LUNA-Ⅱ自动细胞计数仪上分析各组细胞的存活率。
1.4.6 蛋白提取与Western blot分析按实验分组干预18 h后的各组ATDC5细胞，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行裂解和离心处理，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将各样品等量蛋白质加入SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后，转移到PVDF膜上(EMD Millipore公司，Burlington，MA)，然后用10%牛血清白蛋白孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，用适当稀释度的一抗在4 ℃下过夜孵育PVDF膜，包括基质金属蛋白酶3抗体(1∶1 000)、基质金属蛋白酶9抗体(1∶1 000)、基质金属蛋白酶13抗体(1∶2 000)、CXCR4抗体(1∶1 000)、SDF-1抗体(1∶1 000)、Ⅱ型胶原抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶10 000)，回收一抗，TBST漂洗3次，每次10 min，然后用相应二抗(山羊抗兔)在室温下孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，用化学发光试剂处理，在ProXima 280化学发光成像系统进行曝光显影，最后使用ImageJ(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)对蛋白条带进行半定量分析，最终结果以目的蛋白与内参的吸光度比值表示(蛋白归一)。
1.5 主要观察指标 ①ATDC5细胞的活性、形态、存活率；②ATDC5细胞中炎症标志物、Ⅱ型胶原及SDF-1/CXCR4信号通路相关因子的蛋白表达；③ATDC5细胞中炎症标志物及SDF-1/CXCR4信号通路相关因子的mRNA表达。
1.6 统计学分析实验数据用SPSS 25.0统计软件分析，所得数据均用x±s表示，两组比较采用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过山东中医药大学生物统计学老师审核。

讨论

骨性关节炎是老年人最常见的关节疾病之一，常引起关节肿痛、僵硬、活动受限[12]。随着中国人口老龄化日益加重，骨性关节炎的发病率逐年上升，但其发病机制至今仍未明确，目前药物在治疗骨性关节炎的效果上也非常有限，因此迫切需要新的治疗方法来防治骨性关节炎，其发病机制也成为研究者们的研究热点[13]。部分学者研究发现骨性关节炎的特征表现为进行性软骨破坏，最终完全丧失软骨细胞。在骨性关节炎中，关节细胞和免疫细胞产生大量的炎症递质，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素7[14]，这些炎性递质刺激了基质金属蛋白酶的产生，降解了细胞外基质中Ⅱ型胶原和蛋白多糖等成分，而这些蛋白酶的过表达直接导致了软骨缺损，促进了骨性关节炎的发生与发展，所以大部分学者认为通过抑制这些炎症递质的表达可能缓解骨性关节炎的炎症反应，成为防治骨性关节炎的一项有效手段。
白细胞介素1是炎症递质中最重要的一种，与骨关节炎软骨基质降解的病理过程密切相关，而正常滑膜液中白细胞介素1含量很低，大多以白细胞介素1β的形式存在[15]。目前，白细胞介素1β已被广泛应用于体外实验诱导骨性关节炎软骨细胞炎症反应[16-17]。该研究采用白细胞介素1β(100 μg/L，18 h)作用于ATDC5细胞，构建体外软骨炎症模型。实验结果显示，模型组的细胞活性明显降低，增殖速度减慢，且炎症相关标志物表达上调，表明造模成功。
骨性关节炎当属于祖国医学“痹病“之“骨痹”范畴，大部分中医学者认为先天禀赋不足、年老肝肾亏虚、筋脉失养等是骨性关节炎发病的内在基础，外感风寒湿热等邪气为其发病的外在因素[18]。早期防治、补益正气、固表祛邪、荣养筋骨是骨性关节炎的治疗原则。黄芪味甘，性微温，归属脾经、肺经，有补气固表、脱毒排脓的功效，是应用最广泛的中药之一，具有多种生物活性，包括免疫调节、抗炎、抗氧化、补益、保肝、利尿、抗糖尿病、抗癌、抗光老化和祛痰作用[19]。黄芪中富含三萜皂苷、黄酮类化合物和多糖[20]。三萜皂苷是黄芪的主要成分，以黄芪甲苷为主，有明显的抗炎作用[21]，被称为定性控制生物标志物[22]。黄芪甲苷已被证实具有抗关节炎的作用[23]，可减轻白细胞介素1β诱导的关节炎症和软骨破坏[24-25]，但它防治骨性关节炎的作用机制尚未明确。该研究首次探讨黄芪甲苷通过SDF-1/CXCR4信号通路减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应，采用100 μg/L白细胞介素1β构建软骨细胞炎症模型，用1，2.5，5 μg/L 黄芪甲苷干预，CCK-8实验结果表明，黄芪甲苷可减轻白细胞介素1β诱导的ADTC5细胞活性下降，且5 μg/L黄芪甲苷为最佳治疗质量浓度，并对软骨细胞无明显毒性。甲苯胺蓝染色结果和锥虫蓝染色结果也进一步证实了5 μg/L 黄芪甲苷能改善白细胞介素1β降低的细胞增殖率和存活率。
基质金属蛋白酶是由多种组织和细胞产生，能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，基质金属蛋白酶的过度表达和细胞外基质的代谢异常往往与骨性关节炎的发生发展有密切联系，基质金属蛋白酶家族中的基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13常被当作骨性关节炎的炎症指标[26-28]。Ⅱ型胶原作为细胞外基质中的关键成分，其表达也与骨性关节炎的发展进程息息相关[29-30]，基质金属蛋白酶的过度表达会使其发生降解，进一步加重骨性关节炎的炎症反应和关节变性，在骨性关节炎后期软骨细胞内Ⅱ型胶原含量明显降低[31]。该研究通过Western blot和qRT-PCR进一步分析软骨细胞炎症反应相关因子的蛋白、基因表达情况，结果显示：用5 μg/L黄芪甲苷干预可降低ATDC5细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的表达，并提高Ⅱ型胶原的表达，从而缓解软骨细胞的炎症反应。
SDF-1/CXCR4信号通路在骨性关节炎的进程中起重要作用[32-33]。SDF-1是来源于滑膜的一种配体，而其受体CXCR4则在软骨细胞中表达[34]，骨性关节炎患者滑膜液中SDF-1与CXCR4相互作用后使基质金属蛋白酶3特异性升高，诱导细胞外基质降解，导致了骨和软骨的破坏[35]。在骨性关节炎中，低浓度SDF-1对软骨起保护作用，而过表达SDF-1则会加重骨性关节炎[36-37]。KANBE等[38]通过滑膜切除术进一步证明SDF-1/CXCR4信号通路参与骨性关节炎的恶化，同时他们在豚鼠骨性关节炎模型的体内实验中发现使用抑制剂AMD3100阻断SDF-1/CXCR4信号通路可以减轻软骨损伤程度。WANG等[39]通过体内实验也发现使用T140阻断SDF-1/CXCR4信号通路能减轻骨性关节炎软骨退变。而QIN等[40]通过体内实验发现黄芪甲苷可以显著下调高脂饮食小鼠血液中CXCR4的表达。为了探究黄芪甲苷是否通过SDF-/CXCR4信号通路缓解软骨细胞炎症反应，该研究通过Western blot和qRT-PCR检测结果表明：使用5 μg/L 黄芪甲苷干预可以降低软骨细胞中CXCR4水平，从而抑制SDF-1/CXCR4信号通路过度活化，降低基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的表达，缓解细胞外基质的降解，增加Ⅱ型胶原的合成。因此，作者推断黄芪甲苷可能通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路来发挥抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应的作用。
该研究发现黄芪甲苷通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路来减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应，进一步阐述了黄芪甲苷治疗软骨细胞炎症的作用机制，为黄芪甲苷作为骨性关节炎辅助治疗药物的可能提供证据。然而，在此次研究中，暂未使用SDF-1/CXCR4信号通路抑制剂干预软骨细胞炎症反应与黄芪甲苷干预结果进行对比验证，并未明确黄芪甲苷通过该通路抑制炎症的程度，仍需进一步研究探讨，将在后期实验进行完善。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黄芪甲苷可减轻白细胞介素1β诱导软骨细胞的炎症反应

Astragaloside IV can reduce interleukin-1beta-induced chondrocyte inflammation

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