2.1   软骨细胞鉴定结果   免疫荧光染色结果显示，hochest染色后，荧光显微镜下观测可见细胞核呈蓝色，见图1A；软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原蛋白呈红色，见图1B，合成后可见典型软骨细胞形态，见图1C，可确定所分离、培养的细胞为软骨细胞。



2.2   YAP1-siRNA靶序列筛选   RT-qPCR实验结果显示，相比转染siRNA-NC组，当各组软骨细胞分别转染YAP1-siRNA1、2、3后，YAP1 mRNA表达均呈一定程度降低，其中YAP1-siRNA2敲降靶基因效果最为显著，见图2，由此选择YAP1-siRNA2序列用于后续实验。



2.3   各组软骨细胞活力    5组细胞形态见图3A。MTT检测结果显示，模型组细胞活力低于空白组(P < 0.05)，黄芪甲苷组细胞活力高于模型组(P < 0.05)，黄芪甲苷组与siRNA-NC组细胞活力比较差异无显著性意义(P > 0.05)，YAP1-siRNA组细胞活力高于siRNA-NC组(P < 0.05)，见图3B。



2.4   各组软骨细胞凋亡情况   流式细胞术结果显示，模型组细胞凋亡率高于空白组(P < 0.05)，黄芪甲苷组细胞凋亡率低于模型组(P < 0.05)，黄芪甲苷组与siRNA-NC组细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，YAP1-siRNA组细胞凋亡率低于siRNA-NC组(P < 0.05)，见图4。



2.5   各组软骨细胞相关基因表达情况   RT-qPCR检测结果显示，模型组金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1 mRNA表达高于空白组(P < 0.05)，YAP1、TEAD1 mRNA表达低于空白组(P < 0.05)；黄芪甲苷组YAP1 mRNA表达高于模型组(P < 0.05)；YAP1-siRNA组金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1 mRNA表达高于NC-siRNA组(P < 0.05)，YAP1、TEAD1 mRNA表达低于NC-siRNA组(P < 0.05)，见图5。



2.6   各组软骨细胞相关蛋白表达情况   模型组金属基质蛋白酶1、织金属蛋白酶抑制物1、YAP1蛋白表达高于空白组(P < 0.05)，Ⅱ型胶原、TEAD1、p-YAP1蛋白表达低于空白组(P < 0.05)；YAP1-siRNA组金属基质蛋白酶1、织金属蛋白酶抑制物1蛋白表达高于NC-siRNA组(P < 0.05)，Ⅱ型胶原、TEAD1、p-YAP1蛋白表达低于NC-siRNA组(P < 0.05)，见图6。

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骨关节炎是由多种因素引起关节软骨纤维化、皲裂等导致的以关节疼痛为主要症状的关节退行性疾病[1]。流行病学资料显示，目前中国40岁以上的骨关节炎患病率高达46.3%，并且这种趋势随着人口老龄化进程的发展还在逐渐加剧[2]；而放眼全球，截至2017年，骨关节炎患者已经超过3亿人，严重影响着人们的生活质量[3]。骨关节炎的发生与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传等因素相关[4]，病理特点主要表现为关节软骨变性破坏、软骨下骨硬化或囊变、关节边缘骨质增生、滑膜病变等[5]，其中关节软骨的病变是骨关节炎的重要环节。关节软骨主要由水、软骨细胞及胶原纤维等组成，而与软骨形成密切相关的Ⅱ型胶原主要由软骨细胞分泌[6]。近年来还有证据表明，骨关节炎不仅影响患者的生活质量，还会增加并发症的发生率、死亡率及家庭经济负担[7]，同时也是老年人致残主要原因。因此，探究软骨细胞功能、开发具有软骨细胞保护作用及促软骨细胞分泌Ⅱ型胶原等的药物，是当前探索骨关节炎临床治愈的重要手段。

Hippo-YAP通路是进化上高度保守的通路，不同物种间的关键组成分子在结构、功能上高度相似，目前已被广泛应用于细胞增殖、凋亡、代谢、组织器官再生等研究中[8-11]。YAP的生物学功能与能否向核内转位密切相关，Hippo-YAP通路的核心蛋白通过磷酸化的级联反应促进YAP的磷酸化，p-YAP滞留在细胞质中，无法发挥YAP入核后的促转录功能[12]。研究表明YAP高表达状况下可缓解关节软骨损伤，并抑制炎症因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等诱导的骨关节炎相关基因金属基质蛋白酶1和金属基质蛋白酶3等的表达[13]。由此，Hippo-YAP通路可作为治疗骨关节炎的潜在靶点。

黄芪甲苷是目前骨科常用药物黄芪的主要有效成分[14-17]，多项研究已经证实了黄芪甲苷对关节软骨及软骨细胞存在保护作用：黄芪甲苷可以减轻关节不稳诱导的小鼠膝骨关节炎病理改变[18]；通过抑制NLRP3炎性小体活化减少白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的产生[19]；通过介导自噬以减少软骨细胞凋亡[20]。但目前黄芪甲苷对软骨细胞的保护作用及潜在保护机制相关的研究仍在探索阶段。由此，此次实验通过白细胞介素1β进行体外诱导软骨细胞产生炎性损伤，经黄芪甲苷干预损伤细胞、YAP1-siRNA敲降靶基因，探索黄芪甲苷对白细胞介素1β体外诱导的炎性损伤软骨细胞的保护作用，为靶向治疗骨关节炎提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年11月至2021年11月在广西中医药大学科学实验中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   二三天龄SD大鼠乳鼠，由广西中医药大学科学实验中心提供。实验中对大鼠的处置符合广西中医药大学科学实验中心动物伦理学规范。
1.3.2   主要试剂   黄芪甲苷(相对分子质量784.97，纯度>98.7%，上海源叶)；白细胞介素1β(碧云天)；无水乙醇(常熟鸿盛)；胎牛血清、DMEM培养基(Hyclone)；0.25%胰蛋白酶(Thermo Fisher)；Ⅱ型胶原酶(Gibco)；PBS(索莱宝)；YAP1-siRNA(北京欧林格)；Trizo(invitrogen)；SYBR Green PCR试剂盒(Thermo)；10%过硫酸铵、DMSO、TEMED(Sigma)；反转录试剂盒(Thermo Fisher)；MTT、RIPA裂解液(碧云天)；Annexin V-FITC/PI试剂盒、BCA试剂盒(凯基生物)；30%丙烯酰胺(上海国药)；1.0 mol/L Tris-HCl电泳缓冲液、10%SDS(上海国药)；4×蛋白上样缓冲液(TAKARA)；5%的BSA(BIOSHARP)；Tween-20(Amresco)；ECL发光液(北京鼎国)；YAP1(FineTest，FNab09559)；TEAD1(FineTest，FNab08581)；Ⅱ型胶原(FineTest，FNab01837)；金属基质蛋白酶1
(FineTest，FNab05233)；组织金属蛋白酶抑制物1(Bioss，bsm-10895M)；p-YAP1(Bioss，bs-3476R)；GAPDH(proteintech)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(碧云天，A0208)；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(碧云天，A0216)；CY3标记山羊抗兔IgG(proteintech，SA00009-2)。 
1.3.3   主要仪器   倒置显微镜(OLYMPUS)；细胞培养箱(Thermo)；离心机(Eppendorf)；Real-time检测仪(ABI)；超净工作台(苏州安泰)；低温冷冻离心机(sigma)；酶标仪(Thermo)；低速离心机(上海卢湘仪)；移液器(Thermo)；流式细胞仪(BD)；电泳仪(BIO－RAD)；水浴锅(莱卡)；化学发光成像仪(上海勤翔)。
1.4   实验方法   
1.4.1   软骨细胞分离与培养   取SD大鼠乳鼠1只，体积分数75%乙醇充分浸泡后取膝关节内股骨和胫骨，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，PBS润洗3遍，1 000 r/min离心1 min，弃上清获得软骨沉淀；0.25%胰蛋白酶37 ℃下恒温培养消化；加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM终止消化，吹打悬液；静置2 min，吸出上层液体，加入PBS润洗，静置2 min后吸出上层液体；加入胶原酶，吹打混匀后消化；同上终止消化后吹打混匀后过滤，获得含软骨细胞的悬浊液，1 000 r/min离心5 min，弃上清后加入PBS，吹打混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复2次；将细胞悬液转移至培养瓶中，37 ℃、体积分数5%CO2下培养，隔天换液。贴壁细胞生长至80%-90%进行传代。
1.4.2   软骨细胞鉴定   采用免疫荧光染色法检测软骨细胞Ⅱ型胶原表达。①将细胞铺板，过夜贴壁后，40 g/L多聚甲醛固定30 min；②PBS漂洗5 min，重复3次；③0.1% Triton通透10 min；④PBS漂洗5 min，重复3次；⑤内源过氧化物酶灭活；体积分数3%H2O2/PBS室温孵育15 min；⑥PBS漂洗5 min，重复3次；⑦5% FBS封闭，37 ℃30 min；⑧一抗Ⅱ型胶原4 ℃ 孵育过夜；⑨PBS漂洗5 min，重复3次；⑩二抗CY3标记山羊抗兔IgG 37 ℃孵育1 h；⑪PBS漂洗5 min，重复3次；⑫Hoechst室温孵育15 min；⑬PBS漂洗5 min；⑭封固，倒置荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.3   YAP1-siRNA的转染   取对数期软骨细胞，接种于6孔培养板中，每孔接种细胞浓度为2×108  L-1，每孔1 mL，分5组，分别为空白组、siRNA NC组、YAP1 siRNA1组、YAP1 siRNA2组、YAP1 siRNA3组，空白组细胞常规培养，其余4组转染对应的siRNA。

转染方法：转染 siRNA敲降序列，配制A液和B液，A液：用不含血清的空DMEM高糖培养基150 μL与9 μL的Lipofectamine® RNAi MAX Reagent混匀，室温下孵育5 min；B液：用不含血清的DMEM高糖培养基150 μL与30 pmol siRNA NC或YAP1-siRNA于室温下混匀，孵育5 min；将A、B两液混匀加入到6孔板中，37 ℃下培养4-6 h；补液，继续培养48 h，行RT-qPCR检测YAP1 mRNA表达以筛选最佳靶序列。YAP1-siRNA由北京欧林格设计并合成，见表1。

1.4.4   软骨细胞分组干预   取对数生长期的软骨细胞，调整细胞浓度为3×106 L-1，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，过夜贴壁培养后，分5组处理：空白组常规培养，模型组加入100 µg/L白细胞介素1β诱导软骨细胞炎性损伤，黄芪甲苷组加入100 µg/L白细胞介素1β+200 μmol/L黄芪甲苷，NC-siRNA组转染NC-siRNA+100 µg/L白细胞介素1β+200 μmol/L黄芪甲苷，YAP1-siRNA转染组转染YAP1-siRNA+100 µg/L白细胞介素1β+200 μmol/L黄芪甲苷。后2组均是先进行siRNA转染，然后同时再加入2种药物。转染48 h后进行后续检测。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   MTT检测细胞活力情况   48 h后，镜下观察细胞状态；每孔加入15 μL MTT，37 ℃、体积分数5%CO2下避光孵育4 h；弃上清，每孔加入150 μL DMSO，轻微振荡10 min；酶标仪492 nm波长测出吸光度值并进行分析。细胞相对活力=实验组吸光度值/空白组吸光度值×100%。
1.5.2   流式细胞术检测细胞凋亡情况   48 h后，收集细胞，PBS清洗3次，胰蛋白酶消化后收集细胞，1 000 r/min离心5 min后收集细胞；用预冷1×PBS重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤细胞；加入300 μL的1×Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI标记，避光，室温下孵育10 min；上流式细胞仪检测并进行分析。
1.5.3   RT-qPCR检测   细胞培养48 h后，利用 RT-qPCR检测金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1、TEAD1、YAP1 mRNA表达。

采用Trizol法提取各组总mRNA，应用反转录试剂盒合成cDNA，加入PCR引物对样本中特定基因序列进行扩增。RT-qPCR所使用的的引物由上海生工合成，GAPDH为内参。扩增条件：94 ℃10 min，94 ℃20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃20 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法分析目的基因在空白组和各实验组之间的表达差异。引物序列见表2。

1.5.4   Western Blot检测   48 h后，采用Western Blot检测金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1、Ⅱ型胶原、TEAD1、p-YAP1、YAP1蛋白的表达。细胞样本中加入预冷的含有PMSF的RIPA裂解液充分裂解；使用SDS-PAGE法分离蛋白质并转移至PVDF膜；5%的脱脂奶粉封闭后进行一抗、二抗孵育；加入适量的ECL发光液后摄片。采用ImageJ测定条带灰度值，以目的蛋白和内参GAPDH比值表示蛋白相对表达量。一抗及稀释比例：金属基质蛋白酶1(1∶1 000)；组织金属蛋白酶抑制物1(1∶1 000)；Ⅱ型胶原(1∶1 000)；TEAD1(1∶1 000)；p-YAP1(1∶1 000)；YAP1(1∶1 000)；GAPDH(1∶5 000)。二抗及稀释比例：辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)。
1.6   统计学分析   数据采用GraphPad Prism 9进行分析。各组数据进行方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05认为差异有显著性意义。统计学方法已经广西中医药大学附属瑞康医院生物统计学专家审核。

软骨细胞具有合成、分泌基质和Ⅱ型胶原纤维等的作用，保护软骨细胞的细胞正常功能是软骨修复的关键环节[21-23]。多项研究表明黄芪甲苷能减轻骨关节炎的病理改变，恢复关节不稳诱导的小鼠膝关节骨关节炎的软骨厚度[18]，提高早期骨关节炎软骨细胞存活率等[24]。此次实验通过MTT法和流式细胞术分别检测经分组处理后的软骨细胞的活力及凋亡情况，发现经白细胞介素1β处理后的软骨细胞凋亡率显著提高、细胞活力显著降低。对相关基因和蛋白的表达做进一步分析发现，与白细胞介素1β诱导后的炎性损伤软骨细胞相比，加入黄芪甲苷后，金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1呈下降趋势，金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1主要反映细胞外基质的蛋白降解和组织重塑情况[25-27]；Ⅱ型胶原表达呈上升趋势。上述研究均表明，黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎性损伤存在保护作用，并且具有促Ⅱ型胶原分泌、抑制软骨细胞外基质降解等功能，表现出促软骨修复的潜力。

Hippo-YAP通路在调节器官体积、组织再生、干细胞功能和肿瘤发生等具有重要作用[28-32]。在哺乳动物中，该通路上游的膜蛋白还可以通过感受细胞外基质环境的变化，通过级联反应促进下游因子YAP磷酸化(p-YAP)；p-YAP与细胞骨架相互作用，无法进入细胞核与TEAD结合，进而影响其调节细胞成长、凋亡的功能[33]。此外，一项基于液相色谱-质谱分析的定量蛋白质组学研究发现，黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的SW1353软骨肉瘤细胞炎性损伤的保护作用，可能是由Hippo-YAP通路介导的[34]。而白细胞介素1β可促进YAP/TAZ蛋白酶体途径的降解，进而抑制YAP的转录活性[35]。此次实验发现，与模型组相比，加入黄芪甲苷后，软骨细胞YAP1 mRNA及其蛋白表达显著上调，且这种表达的上调伴随着细胞活力的增强、Ⅱ型胶原表达的上调及细胞凋亡率、金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1表达的下调，表明Hippo-YAP通路可能参与到黄芪甲苷对炎性损伤软骨细胞的保护中。值得注意的是，在黄芪甲苷作用下，软骨细胞YAP1蛋白及其磷酸化水平均显著提高，可以明确黄芪甲苷作用于Hippo-YAP通路后对其下游的YAP1有显著的调节作用，但p-YAP1变化更显著，表明黄芪甲苷的调控作用并不在于单纯改变YAP1的磷酸化水平，具体作用机制仍需做更深入研究。此外，此次实验还发现，白细胞介素1β诱导后软骨细胞YAP1 mRNA表达显著下调，而YAP1蛋白表达上调、其磷酸化产物p-YAP1蛋白表达显著下调，最终表现为p-YAP1/YAP1水平的降低，这可能是细胞抵抗外界损伤的一种自我保护机制，受损的软骨细胞倾向于通过维持YAP1的非磷酸化、降低YAP1的磷酸化水平，进而发挥保护软骨细胞的作用。这需要进一步对p-YAP1、YAP1作定量分析以进行更深入讨论。

此次实验还对YAP1进行敲降，与siRNA NC组相比，YAP1-siRNA组软骨细胞的细胞活力显著提高，金属基质蛋白酶1、组织金属蛋白酶抑制物1水平上调，细胞凋亡率显著降低，YAP1、TEAD mRNA及YAP1、p-YAP1、TEAD蛋白表达下调，特别是p-YAP1/YAP1水平显著降低，这表明在YAP1低表达的情况下，更倾向于维持非磷酸化YAP1的稳定而促进p-YAP1的去磷酸化。至于细胞活力提高而凋亡率降低，作者考虑黄芪甲苷促进了YAP1 mRNA的表达，同时提高了YAP1及其磷酸化产物的水平，使得siRNA NC组p-YAP1水平高于YAP1-siRNA组，p-YAP1除无法入核与TEAD结合外，还可能与低水平的去磷酸化YAP1无法拮抗NF-κB等涉及多通路的因素相关，这需要开展更多研究以确定其具体机制。

此次实验初步验证黄芪甲苷对白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎性损伤存在保护作用，且这种作用可能与Hippo-YAP通路相关，为进一步探讨黄芪甲苷干预骨关节炎软骨损伤病理过程提供了实验依据，同时也对相关作用机制的研究作出展望，以期为未来靶向研究中医药治疗骨关节炎等疾病提供研究基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
骨关节炎：由多因素引起关节软骨纤维化、皲裂等的退行性疾病，病理表现为关节软骨变性破坏、软骨下骨硬化或囊变等，可以导致关节疼痛、畸形和活动功能障碍，进而增加心血管事件的发生率及全因死亡率，是目前常见且难治的骨科疾病之一。
黄芪甲苷：是骨科常用中药黄芪的主要有效成分之一。现代药理学研究表明，黄芪甲苷可用于增强机体免疫力、抗病毒、抗应激、抗炎等作用，是一种具有较高研究价值的中药单体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

通过体外实验，对软骨细胞进行YAP1-siRNA转染，降低YAP1表达，探讨Hippo-YAP通路在后续研究中的潜在作用机制；应用白介素1β诱导软骨细胞产生炎性损伤，模拟骨关节炎患者局部的炎性环境对软骨细胞的损伤作用；同时给予中药单体黄芪甲苷干预，明确黄芪甲苷对炎性损伤软骨细胞的保护作用，以及Hippo-YAP通路在该过程中的潜在作用，为骨关节炎的临床治疗奠定实验基础。此次实验同时探讨了黄芪甲苷对炎性损伤软骨细胞的保护作用及其潜在保护机制，具有一定的创新性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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