丝素胶原蛋白复合支架联合富血小板血浆修复皮肤损伤

doi:10.12307/2023.416

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

富血小板血浆：是自体全血经过2次离心后获得的富含生长因子的浓缩血小板的血浆，其所含血小板浓度为全血的4倍以上，并且含有多种组织修复需要的生长因子，可促进组织再生与创面愈合。
胶原：是动物细胞外基质中最重要的纤维蛋白，是一种适合细胞生长、黏附与分化的天然基质，其是机体皮肤创面愈合的基础，为促进创面愈合的关键因素。

背景：胶原与丝素蛋白复合构建的组织工程支架，在皮肤、神经、血管、骨、软骨等组织工程领域应用广泛。富血小板血浆是血液经过2 次离心获得的血小板浓缩物，含有多种组织修复需要的生长因子，可促进组织再生与创面愈合。
目的：观察丝素胶原蛋白支架复合富血小板血浆在皮肤创面愈合中的作用。
方法：分别制备丝素胶原蛋白支架、SD大鼠富血小板血浆。取8周龄SD大鼠48只，每只背部制作2个直径2 cm的全层皮肤缺损创面，分4组处理：空白组缺损处注射生理盐水，单纯支架组缺损处植入丝素胶原蛋白复合支架，富血小板血浆组创缘注射同种异体富血小板血浆，联合组缺损处植入丝素胶原蛋白复合支架+创缘注射同种异体富血小板血浆，每组12只。造模后检测创面愈合率、创面炎症因子水平、创面组织学观察及相关蛋白表达。

结果与结论：①联合组造模后第7，14天的创面愈合率大于空白组、单纯支架组、富血小板血浆组(P < 0.05)。②联合组造模后第7，14天的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平均低于空白组、单纯支架组、富血小板血浆组(P < 0.05)。③造模后第14天的苏木精-伊红及Masson染色显示，空白组缺损处仅见少量的新生毛细血管与混乱排列的胶原纤维组织；其他3组可见大量的新生毛细血管与腺体样组织，胶原纤维排列较规律，其中以联合组新生血管最多、腺体样组织层次更清晰、胶原纤维排列更规则。免疫组化染色显示，空白组、单纯支架组、富血小板血浆组CD31+细胞密度少于联合组(P < 0.05)。④Western blot检测显示，相较于空白组、单纯支架组、富血小板血浆组，联合组创面Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶抑制剂1的蛋白表达升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9蛋白表达降低(P < 0.05)。⑤结果表明，丝素胶原蛋白支架复合富血小板血浆可通过抑制炎症反应、增加微血管密度、调节细胞外基质的代谢平衡来促进皮肤创面愈合。

https://orcid.org/0000-0002-2921-6046(刘继超)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 丝素胶原蛋白复合支架, 富血小板血浆, 全层皮肤缺损, 皮肤损伤, 创面, 创面愈合

Abstract: BACKGROUND: Tissue engineering scaffolds constructed by collagen and silk fibroin are widely used in tissue engineering fields such as skin, nerves, blood vessels, bone, and cartilage. Platelet-rich plasma is a platelet concentrate obtained by centrifuging blood twice. It contains a variety of growth factors required for tissue repair and can promote tissue regeneration and wound healing.
OBJECTIVE: To observe the effect of silk fibroin collagen scaffold combined with platelet-rich plasma on skin wound healing.
METHODS: Silk fibroin collagen scaffolds and SD rat platelet-rich plasma were prepared separately. Totally 48 8-week-old SD rats were selected, and 2 full-thickness skin defect wounds with a diameter of 2 cm were made on the back of each rat. They were randomly divided into four groups (n=12). In the blank group, normal saline was injected into the defect site. Silk fibroin-collagen composite scaffolds were implanted in the defects of the simple scaffold group. The platelet-rich plasma group was injected with allogeneic platelet-rich plasma at the wound margin. In the combined group, silk fibroin-collagen composite scaffolds were implanted in the defect site and allogeneic platelet-rich plasma was injected into the wound margin. Wound healing rate, wound inflammatory factor level, wound histological morphology and related protein expression were detected after model establishment.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The wound healing rate of the combined group on days 7 and 14 after modeling was higher than that of the blank group, the simple scaffold group, and the platelet-rich plasma group (P < 0.05). (2) The levels of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the combined group on days 7 and 14 days after modeling were lower than those in the blank group, the simple scaffold group, and the platelet-rich plasma group (P < 0.05). (3) On day 14 after modeling, hematoxylin-eosin staining and Masson staining showed that only a few new capillaries and disordered collagen fiber tissue were seen at the defect site of the blank group. A large number of new capillaries and glandular tissue were observed in the other three groups. Collagen fibers were arranged more regularly, among which the combined group had the most new blood vessels, the glandular tissue layers were clearer, and the collagen fibers were arranged more regularly. Immunohistochemical staining displayed that the density of CD31+ cells in blank group, simple scaffold group and platelet-rich plasma group was lower than that in combined group (P < 0.05). (4) Western blot assay results showed that, compared with the blank group, the simple scaffold group, and the platelet-rich plasma group, the protein expression levels of type I collagen, type III collagen, and matrix metalloproteinase inhibitor 1 in the wound were increased in the combined group (P < 0.05), and the protein expression levels of matrix metalloproteinase 3 and matrix metalloproteinase 9 decreased (P < 0.05). (5) It is concluded that fibroin collagen scaffold combined with platelet-rich plasma can promote wound healing by inhibiting inflammatory response, increasing microvascular density and regulating the metabolic balance of extracellular matrix.

Key words: silk fibroin collagen composite scaffold, platelet-rich plasma, full-thickness skin defect, skin injury, wound surface, wound healing

中图分类号:

刘继超, 赵金龙, 于洋. 丝素胶原蛋白复合支架联合富血小板血浆修复皮肤损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 3971-3976.

Liu Jichao, Zhao Jinlong, Yu Yang. Silk fibroin collagen composite scaffold combined with platelet-rich plasma for repairing skin injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 3971-3976.

图/表（结果） 10

2.1 丝素胶原蛋白复合支架的形貌实验制备的丝素胶原蛋白复合支架的大体观与微观形貌，见图1，扫描电镜下可见不规则的多孔结构与大量的交通孔，孔与孔之间相互连通。

2.2 富血小板血浆制备情况此次实验制备的富血小板血浆中的血小板浓度是945.34×109 L-1，为全血血小板浓度(205.46×109 L-1)的4倍以上，获得了合格的富血小板血浆制品。
2.3 各组大鼠创面愈合率造模后，所有大鼠状态良好，各组大鼠造模后各时间点的创面大体图片，见图2。随着造模时间的延长，各组大鼠创面逐渐减小，单纯支架组、富血小板血浆组、联合组造模后第7，14天的创面愈合率均大于空白组(P < 0.05)，联合组造模后第7，14天的创面愈合率大于单纯支架组、富血小板血浆组(P < 0.05)，见表1，见图3。

2.4 各组大鼠创面炎症因子表达随着造模时间的延长，各组创面组织内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平有所降低(P < 0.05)。造模后第3，7天，单纯支架组、富血小板血浆组、联合组创面组织内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平低于空白组(P < 0.05)，联合组创面组织内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达均低于单纯支架组、单富血小板血浆组(P < 0.05)，见表2，见图4。

2.5 各组大鼠创面组织形态观察结果苏木精-伊红染色及Masson染色后镜下可观察到，空白组缺损部位仅见少量的新生毛细血管与混乱排列的胶原纤维组织，未见明显的腺体样组织；单纯支架组、富血小板血浆组、联合组均可见大量的新生毛细血管与腺体样组织，胶原纤维排列较规律，其中以联合组新生血管最多、腺体样组织层次更清晰、胶原纤维排列更规则，见图5。

2.6 各组大鼠创面免疫组化染色结果 4组大鼠创面组织均可见CD31阳性表达，但分布存在一定的差异，见图6。空白组、单纯支架组、富血小板血浆组、联合组创面CD31+细胞密度依次为(20.28±5.25)，(31.68±4.27)，(36.72±45.89)，(44.28±3.54)个/mm2，4组间CD31+细胞密度比较差异有显著性意义(P < 0.05)，并且单纯支架组、富血小板血浆组、联合组创面CD31+细胞密度高于空白组(P < 0.05)，联合组高于单纯支架组、富血小板血浆组(P < 0.05)。

2.7 各组大鼠创面相关蛋白表达 Western blot检测结果显示，相较于空白组，单纯支架组、富血小板血浆组、联合组创面Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶抑制剂1的蛋白相对表达升高(P < 0.05)，单纯支架组、富血小板血浆组、联合组创面基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9蛋白相对表达降低(P < 0.05)；相较于单纯支架组、富血小板血浆组，联合组创面Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶抑制剂1蛋白相对表达升高(P < 0.05)，联合组创面基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9蛋白相对表达降低(P < 0.05)，见图7。

2.8 支架组织相容性由创面组织学检测可知，丝素胶原蛋白支架具有良好的组织相容性。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较进行方差分析，两两比较进行t检验。
1.2 时间及地点实验于2010年9月至2021年12月在西安交通大学医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料桑蚕丝(四川宁南)；聚乙二醇(江苏德纳化学股份有限公司)；Tris缓冲液(北京伊诺凯科技有限公司)；戊巴比妥钠(北京智杰方远科技有限公司)；肿瘤坏死因子α Elisa检测试剂盒、白细胞介素6 Elisa检测试剂盒(上海杏宜生物科技有限公司)；兔抗鼠CD31抗体(广州万孚生物技术股份有限公司)；滴加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(上海泽叶生物科技有限公司)；Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制剂1抗体(北京博尔迈生物技术有限公司)；苏木精-伊红与Masson染色试剂盒(南京生航生物技术有限公司)；低速离心机、高速离心机(广州吉迪仪器有限公司)；光学显微镜(OLYMPUS，日本)；紫外可见分光光度仪(青岛聚创世纪环保有限公司)。
1.3.2 实验动物雄性SD大鼠54只，8周龄，体质量220-260 g，购自西安交通大学医学院，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2018-001。其中6只用于制备富血小板血浆，剩余48只用于全层皮肤缺损造模。动物实验获得西安交通大学医学院伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 制备丝素胶原蛋白复合支架 ①将一定量的桑蚕丝置入浓度0.5%的无水碳酸钠溶液中，90 ℃煮沸30 min×3次；烘干，置入摩尔比为1∶2∶8的CaCl2·CH3CH2OH·H2O三元溶液中2 h；自然冷却后8 000 r/min离心10 min，取上清液；将上清液放入透析袋中，置于流动自来水中透析2 d；置于去离子水中透析1 d；置入40%聚乙二醇中12 h，制得丝素蛋白溶液，于4 ℃温度下保存。②剔除新鲜牛腱周围的肌肉、脂肪及筋膜等组织，以三蒸水反复冲洗3次；置于-20 ℃冰箱保存，直到跟腱变硬，将其切成小碎块；置入碳酸钠溶液中浸泡2 h，以蒸馏水漂洗5次，晾干；将小碎块研成粉末，置于-20 ℃冰箱保存；将牛腱组织与胃蛋白酶按10∶3的质量比加入乙酸溶液中，置于4 ℃冰箱内搅拌5 d；随后去除胃蛋白酶，制备牛腱组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min，收集上清，置入0.05 mol/L Tris缓冲液中1 d；收集沉淀，置入含胃蛋白酶的醋酸溶液中，取上清液，置入3.5 mol/L NaCl溶液中，获取沉淀，去离子水透析5 d，获得胶原蛋白溶液。③按质量比2∶1将丝素蛋白溶液与胶原蛋白溶液混合，充分搅拌均匀；将混合溶液真空冷冻干燥后，无水乙醇浸泡24 h；置入0.5% NaOH溶液中1 d，去离子水浸泡 30 min，制得丝素胶原蛋白复合支架。25 kGy 60Co灭菌后，置于-80 ℃环境下保存备用。
1.4.2 制备富血小板血浆取SD大鼠6只，腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.2 mL/kg)后，将大鼠固定后备皮、消毒，用含1 mL柠檬酸钠抗凝剂的注射器，以注射的方式从每只大鼠心脏中抽取10 mL全血，将血液与抗凝剂混匀，分装于离心管内，5 mL/管，取1 mL用于检测全血血小板浓度；将剩余的血液在4 ℃下以200×g离心15 min后，液体分为3层，上层为上清液，中间为白细胞层(富含血小板)，下层为红细胞；吸取上清液与中间层，置于新的离心管内，在4 ℃下以500×g离心10 min，液体分为2层，上层上清液为贫血小板血浆，下层为富血小板血浆，吸取上清液弃掉，剩下的即为富血小板血浆。取0.2 mL用于检测血小板浓度。
1.4.3 皮肤创面制作与实验分组取SD大鼠48只，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，背部脱毛后固定于手术操作台上，背部皮肤消毒后，利用直径2 cm的皮肤打孔器在大鼠背部两侧制作全层皮肤缺损创面。造模后，采用随机数字表法分4组处理，每组12只：空白组缺损创面注射0.6 mL的生理盐水，单纯支架组缺损创面植入丝素胶原蛋白复合支架，富血小板血浆组创缘注射0.6 mL的富血小板血浆，联合组缺损创面植入丝素胶原蛋白复合支架，随后创缘注射0.6 mL的富血小板血浆。最后，使用无菌纱布覆盖包扎创面，定期更换纱布。术后大鼠饲养于SPF级环境中，自由饮食饮水，12 h明暗交替循环。
1.4.4 创面愈合情况造模后第0，7，14天，观察创面愈合情况，并拍照，利用Image J 软件，设定好标尺，在需要测量的创面上进行创面边缘勾画，每只动物测量5次，求平均值，计算创面愈合率。创面愈合率=(创面初始面积-创面当前面积)/初始面积×100%。
1.4.5 创面炎症因子水平造模后第3，7天，每组随机取3只大鼠，创面取材，采用Elisa法检测肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的表达。方法为：称取创面组织标本0.5 mg，加入500 µL的PBS，置于匀浆器中匀浆，3 000 r/min离心20 min，收集上清，-70 ℃保存。取出试剂盒中的96孔板，分标准品孔、空白孔与待测样品孔，标准孔加入不同浓度的标准品溶液，空白孔加入蒸馏水，待测样品孔加入待测样品与检测的抗体，混匀后37 ℃温育30 min。洗涤后，除空白孔外其余各孔加酶标液，置于湿盒内于37 ℃恒温孵育1 h，随后依次进行洗板、显色、终止反应等步骤，最后在450 nm波长处读取各孔的吸光度值。
1.4.6 创面组织形态观察造模后第14天，麻醉后处死实验大鼠，创面取材，多聚甲醛固定后制备石蜡切片，脱蜡后分别进行苏木精-伊红与Masson染色，观察创面肉芽组织生长及胶原纤维合成情况。
1.4.7 创面CD31免疫组化染色取创面组织石蜡切片，以PBS冲洗3次×5 min；加入体积分数3% H2O2室温孵育10 min，再次以PBS冲洗5 min×3次；滴加5%牛血清白蛋白室温孵育10 min，随后加入兔抗鼠CD31抗体(稀释比例为1∶200)，置于湿盒内4 ℃孵育24 h；再次以PBS冲洗3次×5 min，滴加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(稀释比例为1∶500)，置于湿盒内37 ℃孵育1 h；再次以PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，随后依次进行苏木精染色、脱水透明及封固，镜下观察。
1.4.8 创面Western blot检测利用Western blot检测创面Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白9、基质金属蛋白酶抑制剂1蛋白表达。将创面组织剪碎，加入组织裂解液后匀浆、冰浴，30 min后将裂解液移至离心管内，4 ℃环境下12 000 r/min离心5 min，将制取的上清液分装于新的离心管内，置于-20 ℃保存。采用BCA方法检测组织样本蛋白浓度。依据组织样本蛋白浓度确定总蛋白上样量为40 µg，向蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液，95 ℃煮沸5 min；配制分离胶、上样、转膜，向转好的膜加入封闭液中，室温孵育1 h；加入稀释的一抗(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白9、基质金属蛋白酶抑制剂1，稀释比例分别为1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶3 000)，4 ℃孵育24 h；回收一抗，以TBST清洗5 min×
3次；加入稀释的二抗(稀释比例为1∶2 000)，室温孵育30 min，以TBST清洗5 min×4次；最后，加入ECL显影液，利用凝胶成像仪对条带进行成像。
1.5 主要观察指标各组大鼠皮肤创面愈合率、炎症因子水平、组织形态及相关蛋白表达。
1.6 统计学分析所有统计分析均使用软件SPSS 25.0进行，计量资料以x±s表示，多组间比较进行方差分析，两两比较进行t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经西安交通大学医学院生物统计学专家审核。

讨论

支架是组织工程皮肤的重要组成部分。胶原是细胞外基质的重要成分，在皮肤中具有一定的力学强度，可有效缓解外界机械压力，在生物医学中应用广泛。胶原是真皮组织的重要组成成分，其占真皮干质量的70%-80%，主要成分为Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白，故而，在构建皮肤组织工程中多采用胶原作为主要支架材料。丝素蛋白是从蚕丝中分离出来的天然高分子纤维蛋白，具有良好的理化性能与机械性能、良好的韧性与可塑性，同时其还含有缩氨酸成分，可促进皮肤组织成纤维细胞的增殖与分化，可促进创面的愈合。因此，胶原与丝素蛋白是构建组织工程皮肤的较理想材料。CUI等[17]采用冷冻干燥法制备了胶原丝素蛋白支架，通过一系列检测证实该支架具有良好的孔隙率、保水性、热稳定性和生物相容性，可促进细胞的增殖、黏附与分化，可作为皮肤组织工程支架材料。李青等[18]以丝素胶原蛋白支架为载体负载氧化锌纳米粒，动物实验证实该复合支架可有效抑制创面炎症反应，促进皮肤创面修复。综上，此次实验采用冷冻干燥法制备了丝素胶原蛋白支架，应用于大鼠皮肤创面修复。
富血小板血浆是自体全血经过2次离心后获得的富含生长因子的浓缩血小板的血浆，其所含血小板浓度为全血的4倍以上[19]。此次实验应用的富血小板血浆中的血小板浓度是945.34×109 L-1，为全血血小板浓度(205.46×109 L-1)的4倍以上，获得了合格的富血小板血浆制品。所以，富血小板血浆是自体生长因子的制品之一，而生长因子主要来源于血小板，血小板在止血、血管形成、组织修复等过程中具有重要作用。当血小板被激活后，可释放多种生物活性生长因子[20-21]，例如：血小板衍生生长因子，转化生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、纤维母细胞生长因子及胰岛素生长因子等，发挥抑制炎症反应、促进微循环的建立、加速创面的修复的作用，这些生长因子在组织修复中具有重要的临床意义。
创面的愈合过程需要经历炎症、增殖与塑形3个过程[22]，其中炎症阶段是愈合的基础。人体中产生的各种炎症因子可以破坏或者促进组织的愈合。白细胞介素6与肿瘤坏死因子α均为促炎症因子[23-24]。有研究发现，急性创面中肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的浓度显著升高[25]；如果人体内释放过量的肿瘤坏死因子α与白细胞介素6，将导致局部组织坏死，抑制组织修复进程。也有研究发现，创面渗液增加与渗液中白细胞介素6浓度升高是造成创面延迟愈合的重要因素。此次实验利用Elisa法检测创面组织内肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的浓度，结果显示：皮肤创面造模后的白细胞介素6与肿瘤坏死因子α水平显著升高，而丝素胶原蛋白支架、富血小板血浆都可以明显降低创面组织内肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的水平，二者联合应用时降低两种炎症因子浓度的作用优于单一治疗方法，有利于创面愈合。
创面的病理形态学观察结果显示，未进行治疗的创面新生血管与胶原纤维形成非常有限，而经过丝素胶原蛋白支架、富血小板血浆治疗后，创面的血管形成与胶原纤维均明显增加，并且二者联合应用时的新生血管形成与胶原纤维数量均进一步增加，说明丝素胶原蛋白支架联合富血小板血浆可促进创面的愈合。CD31又称为血小板-内皮细胞黏附分子，存在于血小板、中性粒细胞、单核细胞和某些类型的T细胞表面及内皮细胞间紧密连接处，参与白细胞的迁移、血管生成和整合素的激活。在免疫组化染色中，CD31主要用于证明内皮细胞组织的存在，用于评估血管生成。此次实验免疫组化染色结果证实，丝素胶原蛋白支架、富血小板血浆均可促进创面新生血管的形成，并且二者联合作用时的新生血管形成更加明显。作者分析：丝素胶原蛋白支架为细胞增殖与分化提供了三维结构空间，而富血小板血浆被激活后释放出大量的生物活性因子，这些因子进一步相互协调，进一步促进细胞的增殖与分化，改善创面局部微环境，促进创面愈合。
基质金属蛋白酶是参与细胞外基质降解的主要蛋白酶类，在创面愈合、血管形成等正常生理过程中，参与基质蛋白的细胞外降解与分解，促进细胞穿越基底膜。细胞外基质与创面成纤维细胞、角质形成细胞的增殖与迁移以及毛发再生等具有密切的关系，细胞外基质的变化与重构、基质降解酶及其抑制酶的共同作用是创面修复的关键。基质金属蛋白酶组织抑制剂可特异性抑制基质金属蛋白酶活性，正常生理情况下，二者之间维持着良好的动态平衡。Western blot检测结果显示，丝素胶原蛋白支架、富血小板血浆治疗可以降低创面基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9蛋白的表达，提高基质金属蛋白酶组织抑制剂1蛋白的表达，说明二者可以调整基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶组织抑制剂之间的平衡，提高创面愈合质量，并且丝素胶原蛋白支架与富血小板血浆联合应用时的创面愈合更快、更好。
此次实验结果显示，与单一治疗方法相比，丝素胶原蛋白支架与富血小板血浆联合应用时可通过抑制炎症反应、增加微血管密度、调节细胞外基质的代谢平衡来促进创面愈合。但是实验还存在很多不足，例如：病理组织学观察时间点较少，未来需要增加时间点来验证实验结果；缺少阳性对照；未来可考虑将富血小板血浆负载于丝素胶原蛋白支架上，观察其对创面愈合的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程