3.1 外泌体研究的总体态势 研究领域的被关注度可用文献的发表数量来表示，为了更好地掌握当前国内外对外泌体的研究动态，根据1983-2021年外泌体研究的发文量数据绘制折线图，如图1所示，外泌体的概念最早于1983年提出，此后的十余年间外泌体并未受到足够的重视。2013年的诺贝尔生理或医学奖颁发，使外泌体的研究热度提升，2014年后论文呈现指数型增长趋势。中国科学家于2004年发表了第1篇关于外泌体研究的文献，虽然起步较晚，但自2014年后发文量增长迅猛，近2年发文量占据全球外泌体领域发文量的近1/3。
3.1.1 外泌体领域基础研究成为精准医疗研究热点 由于2005年之前发文量较少，文章统计了2005-2020年的发文情况，见表1，由环比增长速度可知，2007年后，外泌体领域的发文量在逐步提升，且每年以超过24%的环比速度增长，这可能与LOTVALL等[4]在该年发现细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质有关。对1983-2021年全球外泌体领域的累积发文量进行回归分析，结果显示累积发文量与年份呈指数型函数分布，其方程为Y=9.695E-210* e0.243X，R2=0.99，P < 0.01，符合普赖斯提出的科学文献指数增长规律。迅猛的增长趋势也说明了外泌体是当今“精准医疗”领域的研究热点，拥有相当可观的研究前景。
3.1.2 外泌体技术开发已步入成熟阶段 通过对外泌体领域国内外专利进行统计，见图2，1998-2009年属于外泌体专利研发的萌芽期，专利技术申请量增长缓慢。2014年之后全球增速变快，自2012年以来，中国也加大对外泌体技术研发的关注。2019年开始上升趋势逐渐减缓，可能与全球新冠疫情的爆发有关，其在一定程度上对世界学术研究造成影响。至2020年全球外泌体专利产出猛增，大量的基础研究为外泌体的技术研发注入新的活力，中国也加快了相关专利技术的研发布局。
专利权人分布能够彰显领域内代表性机构或企业的技术水平，表2显示了再生医学应用中外泌体专利量前10名的主要专利权人，包含韩国、日本、中国与美国。专利数量最多的专利权人是韩国的MDimune医疗健康公司，致力于开发人造外泌体作为药物递送系统的技术，代表性科学家为浦项科技大学生命科学教授Kim Yoon-Keun。专利数量排名前3的还有日本的盐野义制药公司和中国的浙江大学，前者在分子靶向疗法等抗癌药物领域取得了显著成就，后者的生命科学研究院张龙课题组揭示了肿瘤外泌体在宿主固有免疫失衡中的重要作用[5]。前10名主要专利权人以美国为主，包括麻省理工学院、外泌体领头企业Codiak BioSciences公司与博德研究所、加州大学等，说明美国在外泌体领域中仍具有绝对的技术优势。
3.1.3 肿瘤生物学研究已成为外泌体研究的新热点
(1)高频词统计：Mesh主题词是指能够体现生物医药领域文献主题的词，将检索到的文献题录导入BICOMB 2.0软件，进行主要主题词词频统计，统计出现频次为1的主题词共15 734个，利用齐普夫第二定律高低词频分界公式
，其中I1表示出现频次为1的主题词个数，n为高低频分界点频次，可得到频次阈值为177。
通过Bicomb进行主题词频次排序，统计得到高频词37个，累计出现频次占总主题词的22.86%，如表3所示。外泌体、细胞外囊泡与细胞衍生微粒的代谢组学出现频次最高居前3，高频主题词还包括外泌体成分(miRNA、蛋白质组等)、外泌体来源(间充质干细胞、内皮细胞、巨噬细胞、血小板等)、外泌体功能(肿瘤、细胞通讯等)3大类。统计结果显示外泌体研究涉及遗传基因学、化学、生理学、病理学、免疫学等学科，可用于基因水平、蛋白质水平、代谢水平的研究，成为疾病诊断和医疗的强有力工具。
常见的外泌体诊断或生物标志物研究都集中在外泌体的蛋白质、RNA、DNA、脂质成分和其他小分子代谢物研究[6]。间充质干细胞因其重要的增殖和分化潜力，成为细胞治疗中最常用的细胞类型，它能产生大量的细胞外囊泡，可应用于多种慢性肾病的治疗[7]。肿瘤相关巨噬细胞来源外泌体可能具有激活抗肿瘤免疫的作用，其介导的细胞间通讯已成为肿瘤生物学研究的热点[8]。
(2)高频词共现与聚类：在BICOMB中获得高频词词篇矩阵后，导出输入到统计分析软件SPSS中，选择系统聚类的方法进行层次聚类分析，聚类结果见图3。聚类树最左边2列为高频主题词与频次排名，采取系统聚类法的凝聚聚类算法。由图可知，所有主题词大致可以分为5类。
第1类为外泌体的遗传基因研究，结合相关文献可知，此方向以外泌体中的miRNA作为生物标志物的研究为主，包括收集与提取miRNA、高通量测序筛选miRNA、miRNA表达差异分析、miRNA靶向给药等；第2类为外泌体的免疫调节功能；第3类为肿瘤治疗与外泌体的病理学，由于外泌体能够促进组织间通讯，且易于从血样中分离出来，具有成为疾病诊断和预后生物标志物的潜力，有助于抗瘤药物研发与应用；第4类为外泌体组成，包括外泌体内含物研究与分离、纯化技术的改善；第5类为不同细胞来源外泌体的代谢分析，不同来源的外泌体携带不同的核酸、蛋白质和脂质[9]，通过不同的成分在细胞间传递信息并对不同疾病的发展产生不同的影响[10]。
(3)论文关键词时序分析：Citespace中的时间线视图能够反映出专利技术各主题出现的年份、热度以及持续时间。构建关键词共现时间线图谱，如图4所示，能够得到每个研究方向的发展态势与活跃度。
由全球外泌体研究的关键词图谱可知，肿瘤微环境、循环微粒细胞、肿瘤来源、细胞衍生、循环微粒等不同来源的外泌体等主题出现时间早，自2012年开始，关键词突现强度明显增大，科学家对外泌体领域的研究关注度逐渐提高。循环微粒是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的直径小于1 μm的小囊泡，而外泌体的大小在30-150 nm之间，属于循环微粒的研究范围。但从2016年开始，在循环微粒层面的研究趋冷，随着超高灵敏流式检测技术的发展，对外泌体的检测精度在不断提高[11]。肿瘤微环境等相关研究时间跨度长，从1983年持续至2021年，为外泌体领域的经典研究主题，且从2013年诺贝尔奖颁布开始，活跃度居高不下，出现了一系列里程碑式的研究成果，其中利用外泌体对肿瘤微环境细胞进行改造是再生医学领域的研究热点，外泌体对肿瘤细胞的代谢具有调控作用，它能够参与到抗肿瘤治疗的过程中[12]。阿尔茨海默病等主题出现紫色年轮，说明其具有高中介中心度，是外泌体领域的标志性关键词。该病是最普遍的神经退行性疾病，尚未出现有效的治疗方法，但外泌体及其成分能够作为阿尔茨海默病的生物标志物和治疗靶标[13]。近年来，间充质干细胞分泌组已成为外泌体领域的新兴研究主题，间充质干细胞可用于外泌体大规模生产，作为当今用于治疗应用的外泌体的主要来源，其分泌的外泌体具有强大的肿瘤趋向性，在抗肿瘤药物递送方面具有较大前景[14]。但该主题突现时间较晚，在肿瘤治疗应用中的研究仍处于起步阶段，间充质干细胞来源外泌体的作用机制研究与临床应用极有可能成为下一个热点研究方向。
利用Citespace提供的词频探测功能将突现强度高的词从大量的主题词中探测出来，突现强度能够反映出词频变化率的高低，突现强度越大，词频随时间的变化率越高。外泌体领域的论文主题突现强度如表4所示。由表可知，“肿瘤微环境”的突现强度最高，从1983年持续到2013年，“微观粒子”“流式细胞术”于2013年突现，外泌体研究者对流式细胞术的关注度越来越高，该技术在再生医学的临床和基础研究中已经得到十分广泛的应用，在肿瘤预后预测、疗效评价及诊断中发挥着关键的参考价值[15]。此外，头颈部肿瘤、分泌组、肿瘤干细胞、免疫抑制等都是经典的研究主题。“诊断”“肝细胞癌”等关键词出现时间晚，但强度高居前10，总体来看，高突现主题词由外泌体成分与来源分析等微观研究转向提取技术、肿瘤诊断与治疗等方面。
3.1.4 干细胞技术将占据外泌体技术开发的最前沿
(1) 技术热点领域识别：分析专利的热点技术共现可以发现某一领域的主要研发方向，预测未来发展趋势。该研究使用德温特手工代码(Derwent Manual Code，DMC)作为分类标准，利用DMC对热点技术进行共现分析能够提高准确性，显示出领域的技术特点。利用Citespace工具中的共现频次统计功能，得到出现频次较高的前10个DMC技术，如表5所示，可知该领域专利在DMC应用分类中有细胞器、微生物探测、基因序列、抗癌、免疫、蛋白质等相关技术类别。
(2)技术主题时序分析：利用Citespace构建时间线图谱，如图6所示，能够得到每个研究方向的发展态势与活跃度，由于再生医学领域中外泌体领域的技术最早出现于2001年，其DMC为D05-H08(一般性或未指定的细胞或组织培养技术)，因此时间线图显示了2001年后的技术时间演化图谱。
外泌体技术近20年的兴起阶段以提取分离技术研发较为活跃，例如生物样品、氨基酸序列的聚类，也是开展外泌体研究的基础。外泌体作为液体活检的理想材料，如何提高其分离纯化的效率和精准度仍是巨大的挑战，也是再生医学领域的研究重点[16]。其中，目标生物分子与生物样品相关的技术共现频次相当多，主要技术包括D05-H09、B12-K04A(一般性动物疾病的诊断技术)、B12-K04A1(肿瘤或癌症的诊断技术)等。
2007年，研究发现细胞间可通过外泌体中的RNA来交换遗传物质，极大地推动了外泌体技术的发展。2013年诺贝尔奖对外泌体研究的表彰，使其达到全新的高度，越来越多的实验证实外泌体用于疾病治疗的有效性，研究者对分离培养外泌体、稳定且有效保存外泌体的需求日益增加[17]。在此之后，与生物样品、间质干细胞等相关的技术均处于活跃状态，出现了多个技术爆发点。随着研究的深入，外泌体技术极有可能显示出与论文研究一致的态势，加强对肿瘤治疗技术的研发。
外泌体研究的专利主题突现强度如表6所示。由表可知，突现强度高的前10名技术类别出现时间均较晚，集中于2016年以后。B12-K04A的突现强度最高，从2001年持续到2014年，此领域的核心技术为利用外泌体进行动物疾病诊断。此外，肿瘤等疾病诊断、外泌体的提取与检测等高突现强度技术都是前沿领域。但随着精准医学的提出与探测技术的加强，外泌体相关技术类别在肿瘤治疗领域将受到更加广泛的关注与研究。
3.2 中国外泌体研究态势分析
3.2.1 肿瘤诊断与治疗是中国的研究重点
(1)高频词统计：将清洗后的中国产出文献题录导入BICOMB 2.0，统计得出出现频次为1的主题词共8 923个，利用齐普夫第二定律高低词频分界公式得到频次阈值为133。
利用主题词频次排序，统计得到高频词26个，累计出现频次占总主题词的18.22%，如表7所示。中国外泌体领域论文高频词大致包括外泌体的代谢功能(#1，#15，#16，#20，#22)、肿瘤诊断与预后监测(#2，#7，#8，#14，#19，#25)、外泌体制备与分离(#3，#10，#13)、外泌体载药(#5，#6，#12，#17，#18，#21，#23，#26)等，与全球外泌体论文高频词相比，与外泌体免疫疗法相关的研究涉及较少。
(2)高频词共现与聚类：在BICOMB中获得高频词词篇矩阵后，导入SPSS中进行层次聚类分析，聚类结果见图7。所有主题词大致可以分为3类：第1类为miRNA的遗传基因学等，外泌体中含有多种可能性的miRNA，miRNA进入外泌体的分选机制、在肿瘤发生与发展中的作用均是目前的研究热点[18]。第2类为细胞培养与试验，由于外泌体内容物含量较少，研究时需富集有效内容物。第3类与肿瘤治疗与预后监测有关。
(3)论文关键词时序分析：中国在该领域的论文关键词演化如图8所示，关键词被聚类成13簇，大致包括外泌体来源、外泌体成分、外泌体功能、肿瘤治疗等方面，微囊泡、细胞通讯、胃癌恶性腹水、泌尿、结肠直肠癌等不同来源的外泌体等主题在早期出现，面积最大的节点出现在2004年左右外泌体类的研究中，说明中国科学家们紧跟着全球外泌体研究的热潮，对外泌体及其功能展开了广泛研究。
统计主题突现时序表可知，中国在该领域的研究与疾病的诊断和治疗密切相关，见表8，早期突现的关键词包括疾病、信使RNA、T细胞、肿瘤等，且以高热度持续到近年。除了肿瘤领域，外泌体在神经系统疾病、心血管领域中也有广阔的应用前景。随着精准医疗的提出与发展，细胞通讯、微环境、体外等主题词相继突现，说明中国开始聚焦微环境研究疾病的发展机制，并大力研究将外泌体作为药物载体用于靶向肿瘤的领域。此外，液体活检是体外诊断的重要分支，以外泌体为基础的液体活检是未来肿瘤诊断发展的方向，也是中国在外泌体领域的研究重点。近年来肿瘤免疫学飞速发展，免疫反应、免疫疗法等主题词突现强度高，彰显出中国在该领域的研究从基础研究向临床应用方向转化，特别是围绕外泌体分离与检测技术的难题展开研究，加快实现外泌体基础研究与转化应用的成功衔接。
3.2.2 再生医学领域的外泌体技术方兴未艾
(1)技术热点领域识别：利用Citespace得到外泌体领域中国专利出现频次较高的前10个DMC技术，如表9所示，热点技术领域包括微生物检测、基因序列等相关技术，与全球专利研发热点大致相同，中国高频技术类别还包括动植物细胞培养、肿瘤治疗探针等，主要涉及外泌体的制备方法与肿瘤诊断等。通过分析具体专利内容，发现中国专利申请量最多的是外泌体作为生物标志物的技术，在外泌体基因水平研究技术的专利布局居多，但外泌体的免疫功能方面的技术较少。
中国专利DMC共现聚类图谱如图9所示，该领域的专利技术集中在疾病诊断、制药成分、外泌体来源与制备的相关领域。中国在外泌体领域的技术均以疾病诊断为主，在肿瘤治疗方面的专利申请量较少，这可能与外泌体分离技术不够完善、临床试验不足有关。
(2)技术主题时序分析：图10显示了中国外泌体技术主要研发领域的技术演化情况，中国相较于全球该领域技术研发来说起步较晚，技术主题于2006-2013年开始快速增长。其中，肿瘤诊断是外泌体领域在中国持续热度最久的主题，不同细胞来源的外泌体具有不同的生理病理状态，能够作为不同疾病的肿瘤标志物，应用于早期临床诊断，以胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌等为主。同时，药物载体方向的研究在中国的热度不断高涨。
根据技术主题词突现表可知，中国在外泌体领域的高突现强度技术以肿瘤诊断与检测、外泌体制备与分离为主，见表10，于较早期突现，且持续时间久。而计算机药理学模型的相关专利则是外泌体研究的最新热点。随着中国精准医疗计划的实施以及2019年COVID-19引发的疫情席卷全球，抗体研发技术、基因治疗技术于近两年突现，且突现强度高，这与全球外泌体技术的研发趋同，中国在外泌体的免疫功能方面技术布局与全球水平比较偏弱。
