2.1   UMSCs外泌体的提取和鉴定   通过慢病毒转染建立了高表达LncRNA H19的UMSCs系(H19-UMSCs)，与未转染UMSCs在相同条件下培养并留取培养上清，通过超速离心法成功提取其中的外泌体(UMSCs-Exos和H19-Exos)。2种外泌体在透射电镜下均呈现出典型的一侧凹陷半球形，见图1A。通过Zetaview仪器分析得出2种外泌体直径约130 nm，见图1B。Western blot检测2种外泌体表达特征蛋白CD63、CD81和TSG1010，不表达Calnexin，见图1C。PCR结果证明H19-Exos中的LncRNA H19水平远远超过对照组，见图1D，这表明UMSCs中高表达的LncRNA H19可以在外泌体中富集并被分泌。通过PKH67绿色荧光染料标记外泌体后与软骨细胞共培养，可以观察到软骨细胞中出现绿色荧光，这表明软骨细胞可以成功摄取2种外泌体，见图1E。上述结果表明H19-Exos拥有和普通Exos一样的典型外泌体特征，并且其中携带丰富的LncRNA H19分子，可被软骨细胞摄取。




2.2   miR-29b-3p对软骨细胞TGF-β1/Smad3的调控作用   在课题组前期发表的成果中，已经证明了外泌体LncRNA H19可以通过吸附miR-29b-3p对软骨细胞的下游通路产生作用，因此该研究的重点为验证miR-29b-3p是通过靶向TGF-β1/Smad3通路发挥下游作用。首先通过生物学信息软件预测发现TGF-β1的编码区有miR-29b-3p的结合位点，并且TGF-β1的下游信号通路基因Smad3的3’UTR区域也有miR-29b-3p的结合位点，见图2A；通过Western blot检测到在软骨细胞中过表达miR-29b-3p可以同时下调TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平，而沉默 miR-29b-3p后，TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平上调，见图2B；双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-29b-3p对下游靶基因TGF-β1和Smad3活性影响有显著差异，见图2C。上述结果表明软骨细胞中miR-29b-3p可以靶向抑制TGF-β1/Smad3通路的表达。



2.3   TGF-β1/Smad3通路抑制剂阻断了H19-Exos对软骨再生的生物学作用   通过特异性的小分子抑制剂SB-431542阻断软骨细胞的TGF-β1/Smad3通路，Western blot检测证明了该抑制剂的作用，见图3A。通过Western blot和PCR检测了与软骨增殖和再生的相关基因，发现H19-Exos组与其他组有显著差异，见图3B，C，表明高表达H19的外泌体对软骨细胞有显著的生物学作用，H19-Exos+抑制剂组与H19-Exos组比较差异有显著性意义。上述结果表明TGF-β1/Smad3通路被阻断后，H19在软骨细胞中的下游通路被阻断，影响了其促进软骨再生的作用，反向验证了H19-Exos是通过TGF-β1/Smad3通路促进软骨细胞的增殖和再生。



2.4   H19-Exos对大鼠骨关节炎的治疗作用   如图4A所示，大体观察发现骨关节炎造模组在4周后发生明显的骨关节炎样表现，以软骨剥脱、色泽变暗以及软骨下骨暴露为主要特征；H19-Exos组的大体表现接近正常软骨，仅有小部分软骨损伤；H19-Exos+抑制剂SB-431542组的严重程度介于前两组之间，主要变现为软骨菲薄，部分关节面损伤。如图4B所示，苏木精-伊红染色可见骨关节炎组软骨细胞排列紊乱，主要为纤维组织；H19-Exos组软骨细胞排列整齐均匀；H19-Exos+SB-431542组细胞排列较H19-Exos组紊乱，且细胞数量较少。甲苯胺蓝和COL2A1染色可见H19-Exos组软骨细胞中多糖物质和Ⅱ型胶原含量最高，H19-Exos+SB-431542组软骨细胞中多糖物质和Ⅱ型胶原含量高于骨关节炎组，表明SB-431542部分阻断了H19-Exos对软骨损伤修复的作用。用OARSI评分将上述病理染色结果作半定量分析发现H19-Exos组的骨关节炎表现最轻，与组织学染色结果一致，见图4C。

[1] VINA ER, KWOH CK. Epidemiology of osteoarthritis: literature update. Curr Opin Rheumatol. 2018;30(2):160-167. [2] LOESER RF, GOLDRING SR, SCANZELLO CR, et al. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 2012;64(6):1697-1707. [3] GAO SG, LI KH, ZENG KB, et al. Elevated osteopontin level of synovial fluid and articular cartilage is associated with disease severity in knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18(1):82-87. [4] MELDOLESI J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 2018;28(8):R435-R444. [5] 王新伟,赵英杰,常艳,等.间充质干细胞治疗骨关节炎软骨损伤：作用、应用与问题[J].中国组织工程研究,2021,25(31):5053-5058. [6] 王宪峰,欧昕,邓必勇.不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较[J].中国组织工程研究,2022,26(25):3980-3985. [7] YAN L, WU X. Exosomes produced from 3D cultures of umbilical cord mesenchymal stem cells in a hollow-fiber bioreactor show improved osteochondral regeneration activity. Cell Biol Toxicol. 2020;36(2):165-178. [8] YAN L, LIU G, WU X. Exosomes derived from umbilical cord mesenchymal stem cells in mechanical environment show improved osteochondral activity via upregulation of LncRNA H19. J Orthop Translat. 2021;26:111. [9] WU F, AN Y, ZHOU L, et al. Whole-transcriptome sequencing and ceRNA interaction network of temporomandibular joint osteoarthritis. Front Genet. 2022;13:962574. [10] CHEN H, CHEN L. An integrated analysis of the competing endogenous RNA network and co-expression network revealed seven hub long non-coding RNAs in osteoarthritis. Bone Joint Res. 2020;9(3):90-98. [11] YAN L, LIU G, WU X. The umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomal lncRNA H19 improves osteochondral activity through miR-29b-3p/FoxO3 axis. Clin Transl Med. 2021;11(1):e255. [12] LIU YL, YANG WH, CHEN BY, et al. miR‑29b suppresses proliferation and induces apoptosis of hepatocellular carcinoma ascites H22 cells via regulating TGF‑β1 and p53 signaling pathway. Int J Mol Med. 2021;48(2):157. [13] GUO J, LIN Q, SHAO Y, et al. miR-29b promotes skin wound healing and reduces excessive scar formation by inhibition of the TGF-β1/Smad/CTGF signaling pathway. Can J Physiol Pharmacol. 2017;95(4):437-442. [14] PRITZKER KP, GAY S, JIMENEZ SA, et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 2006;14(1):13-29. [15] SACITHARAN PK. Ageing and Osteoarthritis. Subcell Biochem. 2019;91:123-159. [16] FUJII Y, LIU L, YAGASAKI L, et al. Cartilage Homeostasis and Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(11):6316. [17] 王琦,易诚青.膝关节骨关节炎治疗的研究进展[J].复旦学报(医学版),2022, 49(5):765-770. [18] HUSSAIN SM, NEILLY DW, BALIGA S, et al. Knee osteoarthritis: a review of management options. Scott Med J. 2016;61(1):7-16. [19] KAN HS, CHAN PK, CHIU KY, et al. Non-surgical treatment of knee osteoarthritis. Hong Kong Med J. 2019;25(2):127-133. [20] MAKRIS EA, GOMOLL AH, MALIZOS KN, et al. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 2015;11(1):21-34. [21] LEE KB, HUI JH, SONG IC, et al. Injectable mesenchymal stem cell therapy for large cartilage defects--a porcine model. Stem Cells. 2007;25(11):2964-2971. [22] NEJADNIK H, HUI JH, FENG CHOONG EP, et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells versus autologous chondrocyte implantation: an observational cohort study. Am J Sports Med. 2010;38(6):1110-1116. [23] BACAKOVA L, ZARUBOVA J, TRAVNICKOVA M, et al. Stem cells: their source, potency and use in regenerative therapies with focus on adipose-derived stem cells - a review. Biotechnol Adv. 2018;36(4):1111-1126. [24] ZHANG S, CHU WC, LAI RC, et al. Exosomes derived from human embryonic mesenchymal stem cells promote osteochondral regeneration. Osteoarthritis Cartilage. 2016;24(12):2135-2140. [25] 凌华军,王其友,林伟文,等.骨髓间充质干细胞来源外泌体保护软骨细胞延缓骨关节炎的发生发展[J].中国组织工程研究,2021,25(31):4964-4969. [26] ZHANG Y, BI J, HUANG J, et al. Exosome: A Review of Its Classification, Isolation Techniques, Storage, Diagnostic and Targeted Therapy Applications. Int J Nanomedicine. 2020;15:6917-6934. [27] BATRAKOVA EV, KIM MS. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. J Control Release. 2015;219:396-405. [28] DUDEK KA, LAFONT JE, MARTINEZ-SANCHEZ A, et al. Type II collagen expression is regulated by tissue-specific miR-675 in human articular chondrocytes. J Biol Chem. 2010;285(32):24381-24387. [29] WANG CL, ZUO B, LI D, et al. The long noncoding RNA H19 attenuates force-driven cartilage degeneration via miR-483-5p/Dusp5. Biochem Biophys Res Commun. 2020;529(2):210-217. [30] NING B, JIN R, WANG D, et al. The H19/let-7 feedback loop contributes to developmental dysplasia and dislocation of the hip. Physiol Res. 2019;68(2):275-284. [31] 王伟康,刘晓冬,周长林,等.MiRNAs在骨关节炎发生发展中的调控作用[J].中国组织工程研究,2021,25(35):5709-5715. [32] CHEN L, LI Q, WANG J, et al. MiR-29b-3p promotes chondrocyte apoptosis and facilitates the occurrence and development of osteoarthritis by targeting PGRN. J Cell Mol Med. 2017;21(12):3347-3359. [33] LV M, ZHONG Z, HUANG M, et al. lncRNA H19 regulates epithelial-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer by miR-29b-3p as competing endogenous RNA. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017;1864(10):1887-1899. [34] DING D, LI C, ZHAO T, et al. LncRNA H19/miR-29b-3p/PGRN Axis Promoted Epithelial-Mesenchymal Transition of Colorectal Cancer Cells by Acting on Wnt Signaling. Mol Cells. 2018;41(5):423-435. [35] TIAN X, ZUO X, HOU M, et al. LncRNA-H19 regulates chemoresistance to carboplatin in epithelial ovarian cancer through microRNA-29b-3p and STAT3. J Cancer. 2021;12(19):5712-5722. [36] CAO B, DAI X. Platelet lysate induces chondrogenic differentiation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells by regulating the lncRNA H19/miR-29b-3p/SOX9 axis. FEBS Open Bio. 2020;10(12):2656-2665.

[1]	韦雨柔, 田佳庆, 何宪顺, 詹芝玮, 魏腾飞, 林天烨, 何 伟, 魏秋实. 慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 12-19.
[2]	张元澍, 何 旭, 薛 源, 金叶盛, 汪 凯, 施 勤, 芮永军. 鸢尾素缓解棕榈酸对骨髓间充质干细胞的成骨抑制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 26-31.
[3]	何莉君, 漆小娟. 脂肪间充质干细胞过表达骨形态发生蛋白2促进骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 32-37.
[4]	周明华, 胡晓宇. LncRNA SNHG4调控牙周膜干细胞成骨分化过程中的miR-152-3p[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 38-43.
[5]	郑嵘炅, 邓泽润, 韩 丹, 孙丽华. 骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 44-49.
[6]	郑明魁, 薛晨晖, 关晓明, 马 迅. 人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 50-55.
[7]	孙 菁, 廖 健, 孙江龄, 程 萍, 冯红超. 重组人生长激素促进人牙髓干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 56-61.
[8]	陈冠廷, 张琳琪, 李清茹. 外泌体在慢性肾脏病诊疗中的研究热点与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 86-92.
[9]	范永晶, 王 姝, 金武龙. 颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 100-106.
[10]	黄勇彬, 王 涛, 娄园一, 庞景群, 陈光华. 间充质干细胞促进肌肉组织修复的应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 107-112.
[11]	何宛俞, 程乐平. 干细胞移植修复脊髓损伤的策略与进展[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[12]	农复香, 蒋志雄, 李英豪, 许文聪, 施智兰, 罗 慧, 张晴朗, 钟 爽, 唐梅文. 外泌体调控铁死亡在疾病诊断治疗中的应用与作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-10.
[13]	潘钟杰, 秦志鸿, 郑铁军, 丁晓飞, 廖世杰. 股骨头坏死发病机制中非编码RNA的靶标性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1441-1447.
[14]	党 祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹 金, 熊 山, 张顶梅, 王 信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[15]	薛 婷, 张新日, 孔晓梅. 纳米材料多模态显像示踪技术在间充质干细胞治疗尘肺中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1133-1140.

骨关节炎的主要特征是软骨退化、滑膜炎、软骨下骨硬化以及骨赘形成[1-2]，其典型症状包括持续性疼痛、肿胀以及关节僵硬。目前还未研发出能治愈骨关节炎的药物，大多数治疗仅能缓解疼痛症状。骨关节炎的病因复杂多变，其中主要病因是软骨损伤退变，因此逆转并恢复损伤软骨的正常生理功能是治疗骨关节炎的有效手段[3]。近年来，间充质干细胞凭借其强大的自我更新和分化能力成为了治疗组织损伤的新兴细胞疗法。间充质干细胞发挥疗效的主要机制是通过外泌体传递多种信号分子来调控受体细胞的增殖、迁移、分化和代谢，并协调后续的再生过程[4-5]。
课题组前期研究证实了人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs)外泌体促进软骨损伤修复的有效作用[6-7]，并鉴定出外泌体中高表达的长链非编码RNA H19(long non-coding RNA H19，LncRNA H19)作为上游分子促进了软骨细胞的再生和修复[8]，但其下游靶分子以及相关信号通路仍不明确。LncRNAs可以发挥“分子海绵”的作用吸附某些 miRNAs，而miRNA是转录后水平基因调控的主要参与者，它以负性调控方式结合到mRNA进而抑制靶基因的表达。目前，软骨细胞中已发现多种LncRNAs能发挥内源性竞争作用[9-10]。课题组前期已经发现在软骨细胞中LncRNA H19可以吸附miR-29b-3p从而促进软骨细胞的增殖[11]，并且有其他文献报道在其他细胞系中miR-29b-3p可以直接抑制TGF-β1/Smad3的表达，从而在LncRNAH19和TGF-β1/Smad3通路间形成新的调控反馈回路[12-13]。该研究旨在明确UMSCs外泌体中LncRNA H19通过miR-29b-3p/TGF-β1/Smad3轴促进软骨细胞增殖和再生的分子机制。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   体外细胞实验和体内动物实验，两组数据采用非配对t检验，多组数据采用单因素方差分析比较差异的显著性。
1.2   时间及地点   实验于2022年1-10月在贵州医科大学天然产物化学重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞   UMSCs购买于北纳生物(lot.340316)，人软骨细胞购买于北纳生物(lot.339995)。
1.3.2   实验试剂和仪器   DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素溶液(美国Gibco公司)；单克隆抗体CD63、CD81、TSG101和Calnexin(美国Abcam公司)；单克隆抗体GAPDH、TGF-β1、Smad3、COL2A1、Aggrecan、Cyclin D1、PCNA(美国Abcam公司)；Ⅱ型胶原酶(中国索莱宝)；反转录试剂盒(日本TakaRa公司)；Real-time PCR试剂盒(日本TakaRa公司)；Trizol、异丙醇、DEPC、氯仿(上海生工)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(中国ABclonal)；免疫荧光二抗(美国Proteintech公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(武汉赛维尔公司)；甲苯胺蓝染色试剂盒(上海生工)；miR-29b-3p mimic和miR-29b-3p inhibitor(锐博生物，miR10000100-1-5)；细胞孵育箱(美国Thermo公司)；低温高速离心机(美国Eppendorf公司)；PCR仪(美国Eppendorf公司)；荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯)；台式高速离心机(美国Beckman公司)；纳米颗粒跟踪分析仪Zetaview(德国Particle metrix公司)；切片机(上海莱卡仪器公司)。
1.3.3   实验动物   SD大鼠18只，6周龄，雌性，SPF级，体质量200 g左右，随机分为3组，每组6只，由贵州医科大学动物中心提供，生产许可证号：SCXK(黔)2018-0001；使用许可证号：SYXK(黔)2018-0001。
1.4   实验方法 
1.4.1   构建过表达LncRNA H19的稳定UMSCs   根据NCBI数据库，设计LncRNA H19 过表达序列，构建真核表达质粒；将待转染UMSCs(1×105个)接种至6孔板，至细胞融合度为80%左右时进行转染，将含体积分数为10%胎牛血清的低糖完全培养基替换为含有LncRNA H19慢病毒的培养基，其中polybrene质量浓度为6 μg/mL，12 h后更换新鲜含体积分数为10%胎牛血清的低糖完全培养基，48 h后更换为最低筛选浓度嘌呤霉素的培养基筛选稳定细胞。
1.4.2   外泌体的分离   收集过表达LncRNA H19的UMSCs和普通UMSCs的培养上清，4 ℃条件下2 000×g离心30 min收集上清，20 000×g离心60 min收集上清，100 000×g离心60 min，收集超离管底部沉淀至EP管中，滴入数滴PBS将外泌体完全稀释，100 000×g离心60 min，最后将收集的沉淀以100 μL PBS重悬，分装，-80 ℃保存，即为H19-Exos和UMSCs-Exos。
1.4.3   外泌体的鉴定   将外泌体样品用PBS稀释至107 particles/mL后加入ZetaView仪器的样品孔内，观察粒子的布朗运动。将1滴外泌体样品滴加到铜网上，室温静置晾干后滴加3%磷钨酸溶液染色2 h，然后用2%醋酸铀负染30 s，将铜网置于透射电镜下观察并拍照。通过BCA方法蛋白定量后利用Western blot检测外泌体相关蛋白TSG101、CD63、CD81以及阴性蛋白Calnexin的表达量。
1.4.4   软骨细胞摄取外泌体的示踪   利用Exo-Green荧光示踪技术标记UMSCs-Exos。首先用500 μL的PBS重悬外泌体，加入60 μL Exo-Green混匀后在37 ℃培养箱孵育10 min，加入90 μL ExoQuick-TC试剂终止反应；置于冰上反应30 min后12 000 r/min离心留沉淀，用500 μL PBS重悬后待用。将Exo-Green荧光标记的外泌体加入体外培养的软骨细胞中，通过显微荧光成像系统观察软骨细胞对外泌体的摄取及摄取后的亚细胞定位。
1.4.5   双荧光素酶报告基因   运用基因工程方法，预测miR-29b-3p和其靶通路TGF-β1/Smad3启动子的结合位点，构建野生型(TGF-β1 Wt、Smad3 Wt)和突变型(TGF-β1 Mut、Smad3 Mut)各2种质粒，将miR-29b-3p mimics和miR-NC分别与上述2种质粒以及海肾荧光素酶质粒(psiCHECK2)转入293T细胞内孵育72 h，采用双荧光报告载体分析系统检测萤火虫与海肾素荧光的比值。
1.4.6   细胞总RNA的提取   将软骨细胞分为对照组、H19-Exos组和H19-Exos+抑制剂组，以每孔1×105个加入到6孔板中，采用10 ng/mL白细胞介素1β预处理软骨细胞24 h模拟体外骨关节炎环境，预处理完毕后加入H19-Exos和TGF-β/Smad通路抑制剂SB-431542，其中H19-Exos(1×108 particles/mL)加入 3 mL TGF-β/Smad通路抑制剂SB-431542(10 μmol/L)加入0.5 mL；每3 d换液1次，培养6 d后每孔加入500 μL Trizol充分摇匀，用枪头将消化好的细胞裂解液转移到离心管中，加入等体积Trizol后混匀，室温下放置5 min；加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温下静置5 min；4 ℃下12 000 r/min离心15 min；转移上清液至一新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻混匀，静置10 min；4 ℃下12 000 r/min离心5 min；弃上清液，加1 mL无水乙醇，轻弹管底充分洗涤；4 ℃下7 500 r/min离心5 min；弃上清，待RNA干燥后，加入20 μL焦碳酸二乙酯水溶解沉淀，测定浓度，保存于-80 ℃。

1.4.7   实时荧光定量PCR   根据PrimeScriptTM RT-PCR kit说明书将RNA反转录合成cDNA，按照以下反应条件进行实时荧光定量PCR反应：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环，以GAPDH作为内参，根据2-ΔΔCT值计算各基因表达情况。实验中各引物序列见表1。

1.4.8   siRNA转染   将待转染软骨细胞接种至6孔板，每孔1×105个，细胞密度达50%，取30 µL稀释液和1.25 µL 20 µmol/L miRNA mimic或inhibitor，然后加入3 µL riboFECTTMCP Reagent室温孵育15 min形成转染复合物；将转染复合物加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖完全培养基(无双抗)与软骨细胞共培养72 h后换成常规含体积分数为10%胎牛血清的低糖培养基。转染完成后，通过Western blot和qRT-PCR检测miR-29b-3p的靶基因TGF-β1、Smad3的蛋白和mRNA水平变化。
1.4.9   大鼠骨关节炎模型的构建   该动物实验经过贵州省骨科医院医学伦理委员会批准。6周龄雌性SD大鼠18只，随机分为3组：PBS组，H19-Exos组，H19-Exos+抑制剂组，每组6只。用 3%戊巴比妥钠(1 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，关节腔内注射0.5 mgⅡ型胶原酶构建大鼠骨关节炎模型。术后1周开始在各组大鼠关节腔内注射10 μL的PBS、H19-Exos(1×    1010 particles/mL)、H19-Exos+TGF-β/Smad通路抑制剂SB-431542(1 μmol/L，100 μL)。共注射4次，每周1次，在第4次注射后1周处死大鼠，收集膝关节组织进行下一步实验。
1.4.10   组织学染色   膝关节标本经100 g/L多聚甲醛固定48 h后，浸入EDTA慢脱液缓慢摇晃，每3 d换液1次，共脱钙4周；将标本梯度脱水，用石蜡包埋并切片，行苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色，采用Ⅱ型胶原抗体进行免疫组化染色；由病理科医师对骨关节炎严重程度进行OARSI评分[14]。
1.5   主要观察指标   ①外泌体的鉴定结果；②miR-29b-3p对TGF-β1和Smad3的调控作用；③抑制剂SB-431542对H19-Exos的阻断作用；④H19-Exos对大鼠骨关节炎的治疗作用。
1.6   统计学分析   计量资料以x±s表示，使用SPSS 19.0软件进行处理。采用非配对t检验比较两组数据间的差异，采用单因素方差分析比较多组数据间的差异。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过邱冰专家审核。

关节软骨受到损伤时，其自我再生修复能力往往有限[15]。关节软骨损伤是骨关节炎的高危因素，因此若能修复软骨损伤对于阻止或逆转骨关节炎有重要意义[16]。对于早期骨关节炎的治疗，临床治疗包括非类固醇抗炎药、透明质酸、镇痛药以及重组人成纤维细胞生长因子[17-18]，这些治疗只能缓解症状，减轻疼痛和肿胀，不具备修复受损软骨的组织形态和恢复软骨代谢平衡的能力[19]。晚期骨关节炎的治疗方法包括截骨、关节镜手术和关节置换，然而费用高昂、材料寿命、二次手术等限制了这些手术方案的有效性[20]。迄今为止，仍没有根治骨关节炎的治疗方法，因此迫切需要研发新的药物。
近年来，间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞，有望成为一种治疗软骨病变和骨关节炎的新兴细胞疗法[21-23]。2016年ZHANG等[24]首次提出间充质干细胞主要通过其外泌体参与了软骨损伤的修复治疗。采取外泌体替代间充质干细胞疗法是目前研究的趋势之一，外泌体具有一系列的优势，如体积小无肺栓塞风险、无代谢功能避免形成肿瘤等[25-27]。
课题组前期已经发现UMSCs外泌体可以促进软骨细胞的增殖和基质分泌，并有效修复了动物膝关节软骨缺损模型，但是UMSCs外泌体中发挥作用的分子物质仍然未知[7]。进一步实验发现UMSCs外泌体中高表达的LncRNA H19作为上游分子促进了软骨细胞的再生和修复，但其下游靶分子以及相关信号通路仍不明确[8]。
目前，软骨细胞中已发现多种LncRNAs能发挥内源性竞争作用。LncRNA H19是一段母源表达的高度保守序列，长度2.3 kb，主要参与细胞增殖分化、胚胎发育和肿瘤生长。H19在正常组织中低表达，但是在软骨细胞中高表达，H19的缺失会导致发育不良性髋关节脱位[28-29]。LncRNAs可以发挥“分子海绵”的作用，吸附某些 miRNAs，而miRNA是转录后水平基因调控的主要参与者，它以负性调控方式结合到mRNA进而抑制靶基因的表达。Ning等[30]已经发现LncRNA H19可与let-7结合，促进软骨细胞增殖。多种miRNAs均参与软骨的损伤与修复[31]。Chen等[32]发现软骨细胞中过表达miR-29b-3p会显著抑制增殖、诱导凋亡，并抑制细胞周期从G0/G1进入S期。目前有多项研究表明LncRNA H19可以作为海绵吸附miR-29b-3p发挥生物学功能[33-36]。上述研究表明在软骨细胞中LncRNA H19可能通过吸附miR-29b-3p发挥软骨损伤修复的作用。
课题组前期实验证实了UMSCs外泌体中LncRNA H19可以竞争性结合软骨细胞中的miR-29b-3p来发挥生物学作用；当软骨细胞转染miR-29b-3p mimics后，LncRNA H19的促软骨再生作用被抵消。该研究对miR-29b-3p的下游通路进一步解析，发现TGF-β1的编码区有miR-29b-3p的结合位点，并且TGF-β1的下游信号通路基因Smad3的3’UTR区域也有miR-29b-3p的结合位点；过表达miR-29b-3p可以同时下调TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平，而沉默 miR-29b-3p后，TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平上调；双荧光素酶报告基因实验验证了miR-29b-3p对下游靶基因TGF-β1、Smad3活性影响；体内实验进一步验证了H19-Exos是通过激活TGF-β1/Smad3通路发挥软骨损伤的修复作用，见图5。 综上所述，该研究通过体内和体外实验系统论证高表达LncRNA H19的UMSCs外泌体对软骨细胞再生修复的促进作用，并详细解析LncRNA H19通过内源竞争RNA机制激活TGF-β1/Smad3通路促进软骨再生的具体分子机制。这将为发现一个新的治疗靶点提供可能的研究基础，为干细胞外泌体在软骨损伤中的运用提供可能的理论基础，对于软骨修复的基础和临床研究具有重要意义。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

#br#

文题释义：

外泌体：是一类直径在50-150 nm的脂质双层囊泡，能够从母体细胞运载脂质、蛋白质、mRNA和DNA等生物分子到靶细胞，进而调节相应的生物反应。干细胞来源外泌体具有干细胞的一些特性，但外泌体更加安全和稳定，无伦理限制，且具有大规模化生产使用的优势。因此干细胞来源外泌体是未来生物医疗领域的新策略和新方法。

长链非编码RNA：是一类真核生物中长度大于200个核苷酸的非蛋白编码转录RNA分子，在转录水平和转录后水平参与多种生物过程，如调控翻译、促进或者抑制mRNA、吸附miRNA。有研究证实长链非编码RNA可以在多种细胞中富集，并且通过外泌体的形式释放。因此，解析干细胞来源外泌体中关键的长链非编码RNA是进一步探明外泌体相关生物功能机制的重要方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨关节炎是是常见的退行性关节疾病，临床表现为关节疼痛、僵硬和功能丧失，严重影响日常生活，目前仍没有根治的药物或手术方法。关节软骨损伤是骨关节炎的高危因素，因此若能修复软骨损伤对于阻止或逆转骨关节炎有重要意义。间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞，有望成为一种治疗软骨缺损和骨关节炎的新兴细胞疗法。最新研究表明，来自间充质干细胞的外泌体可以调节软骨细胞稳态，并协调后续的再生过程。LncRNAs可以在多种细胞中富集，并且通过外泌体的形式释放。本项目前期研究发现间充质干细胞来源外泌体通过传递LncRNA H19至软骨细胞，从而激活TGF-β/Smad通路介导软骨再生修复，但是该通路中涉及到的重要靶点分子和内在联系仍未清楚。该研究将从表观遗传到转录调控多个层面分析间充质干细胞来源外泌体LncRNA H19参与软骨再生的具体分子机制，属于间充质干细胞修复软骨缺损的前沿领域，为软骨组织工程的基础研究提供新的思路，有望取得具有国际影响力的成果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

	阅读次数
	全文
	摘要