慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达

doi:10.12307/2023.901

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (1): 12-19.doi: 10.12307/2023.901

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达

韦雨柔1，2，田佳庆1，2，何宪顺1，2，詹芝玮1，2，魏腾飞1，2，林天烨2，3，何伟2，3，魏秋实2，3

1广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510378；2广东省中医骨伤研究院，广东省广州市 510378；3广州中医药大学第三附属医院关节中心，广东省广州市 510378

收稿日期:2022-11-18 接受日期:2023-01-29 出版日期:2024-01-08 发布日期:2023-06-28
通讯作者: 魏秋实，博士，博士生导师，副主任医师，广东省中医骨伤研究院，广东省广州市 510378；广州中医药大学第三附属医院关节中心，广东省广州市 510378
作者简介:韦雨柔，女，1996年生，贵州省兴义市人，广州中医药大学在读硕士，主要从事骨与关节的临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81873327)，项目负责人：何伟；国家自然科学基金面上项目 (82274544)，项目负责人：魏秋实；国家自然科学基金青年科学基金(82004392)，项目负责人：何敏聪；广东省教育厅普通高校重点领域专项(2021ZDZX2005)，项目负责人：魏秋实；广州中医药大学“双一流”与高水平大学学科协同创新团队重大项目(2021XK05)，项目负责人：何伟；广州中医药大学“双一流”与高水平大学学科协同创新团队培育项目(2021XK41)，项目负责人：魏秋实；广州市科学技术重点研发计划农业和社会发展科技项目专题(202206010184)，项目负责人：魏秋实；广东省中医药局科研项目(20221199)，项目负责人：魏秋实；广东省中医骨伤研究院开放课题重点项目(GYH202101-01)，项目负责人：何伟；广东省中医骨伤研究院开放课题重点项目(GYH202101-04)，项目负责人：魏秋实；广东省新黄埔中医药联合创新研究院2022年度第一批联合创新研究项目(2022IR012)，项目负责人：魏秋实；毕节市科学技术局2022 年度“揭榜挂帅”项目(毕科合重大专项〔2022〕1号)，项目负责人：魏秋实

Effect of lentiviral silencing of Piezo1 on osteogenic differentiation and TAZ expression in human bone marrow mesenchymal stem cells

Wei Yurou1, 2, Tian Jiaqing1, 2, He Xianshun1, 2, Zhan Zhiwei1, 2, Wei Tengfei1, 2, Lin Tianye2, 3, He Wei2, 3, Wei Qiushi2, 3

1Third Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China; 2Guangdong Research Institute for Orthopedics and Traumatology of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China; 3Joint Center, Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China

Received:2022-11-18 Accepted:2023-01-29 Online:2024-01-08 Published:2023-06-28
Contact: Wei Qiushi, MD, Doctoral supervisor, Associate chief physician, Guangdong Research Institute for Orthopedics and Traumatology of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China; Joint Center, Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China
About author:Wei Yurou, Master candidate, Third Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China; Guangdong Research Institute for Orthopedics and Traumatology of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81873327 (to HW); National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82274544 (to WQS); Young Science Foundation of the National Natural Science Foundation of China, No. 82004392 (to HMC); General University Key Fields Special Project of Guangdong Provincial Department of Education, No. 2021ZDZX2005 (to WQS); Major Project of "Double First-Class" and High-Level University Discipline Collaborative Innovation Team of Guangzhou University of Chinese Medicine, No. 2021XK05 (to HW); The Cultivation Project of "Double First-Class" and High-Level University Discipline Collaborative Innovation Team of Guangzhou University of Chinese Medicine, No. 2021XK41 (to WQS); Special Topic of Agricultural and Social Development Science and Technology Project of the Key Research and Development Plan of Guangzhou Science and Technology, No. 202206010184 (to WQS); Scientific Research Project of Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine, No. 20221199 (to WQS); Key Open Project of Guangdong Academy of Traditional Chinese Medicine Osteopathy, No. GYH202101-01 (to HW); Key Open Project of Guangdong Academy of Traditional Chinese Medicine Osteopathy, No. GYH202101-04 (to WQS); The First Batch of Joint Innovation Research Project of Guangdong New Huangpu Joint Innovation Institute of Traditional Chinese Medicine in 2022, No. 2022IR012 (to WQS); the "Unveiling and Commanding" Project of Bijie Municipal Bureau of Science and Technology in 2022, No. [2022]1 (to WQS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Piezo1：是一种非选择性机械传感离子通道，可对外界机械刺激做出反应激活细胞内信号传导，参与了如骨质疏松、心血管疾病、癌细胞转移等疾病的发生和发展进程。

TAZ：是具有PDZ结合基序的转录共激活因子，也被称为含有WW结构域的转录调节子1。它作为Hippo信号通路的一个核心成员，通过感知生物结构力学参与调节细胞增殖、组织发育等过程。

背景：Piezo1作为机械敏感蛋白与成骨分化密切相关，TAZ也被证明参与调节成骨分化，但Piezo1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化时TAZ是否参与其中目前尚不明确，故研究其具体机制对防治股骨头坏死具有重要意义。
目的：探讨Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ表达的影响。
方法：构建靶向Piezo1的siRNA，转染至293T细胞，通过RT-qPCR检测其沉默效率并筛选出Piezo1-Homo-2337进行包装，使用荧光染色检测其最佳感染复数值。Piezo1沉默重组慢病毒进一步被转染至人骨髓间充质干细胞中，通过RT-qPCR、Western blot检测其沉默效果；通过茜素红染色、碱性磷酸酶活性分析、免疫荧光染色、RT-qPCR及Western blot检测分析沉默Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力及TAZ表达的影响。

结果与结论：①与正常组、阴性对照组比较，转染si-Piezo1后人骨髓间充质干细胞中Piezo1的mRNA及蛋白水平明显降低；②与阴性对照组比较，si-Piezo1组碱性磷酸酶活性明显降低，钙沉积明显减少；③与阴性对照组比较，si-Piezo1组成骨相关基因Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin及TAZ的mRNA水平明显降低。si-Piezo1组TAZ、β-catenin的蛋白表达明显降低；相反，si-Piezo1组p-TAZ、p-β-catenin的蛋白表达明显增加；④与阴性对照组比较，免疫荧光染色结果提示si-Piezo1组人骨髓间充质干细胞中TAZ、β-catenin的表达较少；⑤结果表明Piezo1可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化，沉默Piezo1后人骨髓间充质干细胞的成骨能力明显降低，同时TAZ的表达也同样降低。

https://orcid.org/0000-0003-0088-9893(韦雨柔)；https://orcid.org/0000-0002-1274-9997(魏秋实)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 股骨头坏死, 人骨髓间充质干细胞, Piezo1, TAZ, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Piezo1, a mechanosensitive protein, is tightly connected to osteogenic differentiation, and it has been demonstrated that TAZ has a role in regulating osteogenic differentiation. It is unclear whether TAZ participates in the regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells by Piezo1, so it is crucial to investigate its unique mechanism to prevent osteonecrosis of the femoral head.
OBJECTIVE: To elucidate what function Piezo1 plays in osteogenic differentiation and TAZ expression in human bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The siRNA targeting Piezo1 was constructed and transfected into 293T cells. The silencing efficiency was detected by RT-qPCR. The selected Piezo1-Home-2337 was packaged according to the silencing efficiency, and its optimal multiplicity of infection value was assayed by immunofluorescence staining. The packaged Piezo1 silencing recombinant lentivirus was transfected into human bone marrow mesenchymal stem cells, and its silencing effect was detected by RT-qPCR and western blot assay. Alizarin red staining, alkaline phosphatase activity analysis, immunofluorescence staining, RT-qPCR and western blot assay were utilized to analyze the effect of silencing Piezo1 on the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The mRNA and protein levels of Piezo1 in human bone marrow mesenchymal stem cells transfected by si-Piezo1 were decreased significantly, with a statistically significant difference compared with normal and negative control groups. (2) The alkaline phosphatase activity in the si-Piezo1 group was much lower and the calcium deposition in the si-Piezo1 group was significantly reduced compared with the negative control group. (3) The mRNA levels of osteogenesis-related genes including Runt-related transcription factor 2 (Runx2), osteopontin (OPN), distal-less homeobox 5 (DLX5), osteocalcin, β-catenin and Tafazzin (TAZ) in the si-Piezo1 group were significantly decreased compared with the negative control group. Afterward, the expression levels of TAZ and β-catenin protein in the si-Piezo1 group were down-regulated significantly compared with the negative control group, whereas the expression levels of p-TAZ and p-β-catenin protein in the si-Piezo1 group had the opposite condition. (4) The results of immunofluorescence staining showed that the expression of TAZ and β-catenin in human bone marrow mesenchymal stem cells in the si-Piezo1 group was less compared with the negative control group. (5) These findings indicate that Piezo1 can promote the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. The osteogenic ability of human bone marrow mesenchymal stem cells is significantly reduced after silencing Piezo1, and the expression of TAZ is also reduced.

Key words: osteonecrosis of the femoral head, human bone marrow mesenchymal stem cell, Piezo1, TAZ, osteogenic differentiation

中图分类号:

韦雨柔, 田佳庆, 何宪顺, 詹芝玮, 魏腾飞, 林天烨, 何伟, 魏秋实. 慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 12-19.

Wei Yurou, Tian Jiaqing, He Xianshun, Zhan Zhiwei, Wei Tengfei, Lin Tianye, He Wei, Wei Qiushi. Effect of lentiviral silencing of Piezo1 on osteogenic differentiation and TAZ expression in human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 12-19.

图/表（结果） 8

2.1 Piezo1慢病毒沉默效率慢病毒转染后，空白对照组、阴性对照组、Piezo1-Homo-3201组、Piezo1-Homo-1837组、Piezo1-Homo-2337组Piezo1的mRNA的表达量分别为1.00±0.11，1.12±0.12，0.35±0.05，0.37±0.04，0.20±0.02。Piezo1-Homo-3201组、Piezo1-Homo-1837组、Piezo1-Homo-2337组的沉默效率分别为65%，63%，80%，其中Piezo1-Homo-2337沉默效率最高，故选择用于后续实验，见图1。

2.2 Piezo1慢病毒鉴定
2.2.1 Piezo1慢病毒感染复数值确定转染后，在荧光显微镜下可观察到细胞呈绿色。当感染复数为1，10，50，100时，荧光比率分别为0-10%，10%-20%，70%-80%，80%-90%，故感染复数为100被确定为慢病毒转染最佳感染复数值。使用CCK8实验检测以感染复数为100转染人骨髓间充质干细胞，未见明显毒性作用，3组间无统计学差异，见图2。

2.2.2 慢病毒转染对人骨髓间充质干细胞中Piezo1表达的影响 Western blot和RT-qPCR检测结果显示si-Piezo1组Piezo1的表达明显降低，与空白组、阴性对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.3 Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化影响
2.3.1 碱性磷酸酶活性成骨诱导3，7，14 d，各组人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性随着时间增加呈现上升趋势。与阴性对照组相比，同一时间段si-Piezo1组的碱性磷酸酶活性明显降低(P < 0.05)，见图4。

2.3.2 茜素红染色成骨诱导14 d后，与阴性对照组比较，茜素红染色结果可见si-Piezo1组钙沉积明显减少(P < 0.000 1)，见图5。

2.3.3 RT-PCR检测成骨相关基因Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin 及TAZ mRNA表达水平 RT-PCR检测结果显示，与阴性对照组相比，si-Piezo1组Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin mRNA表达明显降低 (P < 0.05)。TAZ mRNA表达也明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.3.4 Western blot检测成骨相关蛋白β-catenin及TAZ的表达成骨诱导培养7 d后，Western blot检测结果显示si-Piezo1组TAZ、β-catenin蛋白表达均低于阴性对照组。相反，si-Piezo1组p-TAZ、p-β-catenin蛋白表达均高于阴性对照组，见图7。

2.3.5 免疫荧光检测β-catenin和TAZ的表达成骨诱导培养7 d后，免疫荧光检测结果显示与阴性对照组相比，si-Piezo1组人骨髓间充质干细胞的TAZ阳性区域面积减少。同时，与阴性对照组相比，si-Piezo1组人骨髓间充质干细胞的β-catenin阳性区域面积也出现减少，见图8。

参考文献

[1] HINES JT, JO WL, CUI Q, et al. Osteonecrosis of the Femoral Head: an Updated Review of ARCO on Pathogenesis, Staging and Treatment. J Korean Med Sci. 2021;36(24):e177.
[2] ZHAO D, ZHANG F, WANG B, et al. Guidelines for clinical diagnosis and treatment of osteonecrosis of the femoral head in adults (2019 version). J Orthop Translat. 2020;21:100-110.
[3] RAHMANI-MOGHADAM E, ZARRIN V, MAHMOODZADEH A, et al. Comparison of the Characteristics of Breast Milk-derived Stem Cells with the Stem Cells Derived from the Other Sources: A Comparative Review. Curr Stem Cell Res Ther. 2022;17(1):71-90.
[4] XU Y, JIANG Y, XIA C, et al. Stem cell therapy for osteonecrosis of femoral head: Opportunities and challenges. Regen Ther. 2020;15:295-304.
[5] 吴竖光.骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死的进展[J].中国医药指南,2021,19(12):22-23.
[6] SUN Y, YUAN Y, WU W, et al. The effects of locomotion on bone marrow mesenchymal stem cell fate: insight into mechanical regulation and bone formation. Cell Biosci. 2021;11(1):88.
[7] SUGIMOTO A, MIYAZAKI A, KAWARABAYASHI K, et al. Piezo type mechanosensitive ion channel component 1 functions as a regulator of the cell fate determination of mesenchymal stem cells. Sci Rep. 2017;7(1):17696.
[8] 魏腾飞,何晓铭,韦雨柔,等.Piezo1在激素性和酒精性股骨头坏死骨组织中的差异表达[J].中国组织工程研究,2023,27(2):270-275.
[9] JEONG MG, KIM HK, HWANG ES. The essential role of TAZ in normal tissue homeostasis. Arch Pharm Res. 2021;44(3):253-262.
[10] CAI X, WANG KC, MENG Z. Mechanoregulation of YAP and TAZ in Cellular Homeostasis and Disease Progression. Front Cell Dev Biol. 2021;9:673599.
[11] 吴忠书,韦雨柔,陈哓俊,等.活血通络胶囊促进骨髓间充质干细胞成骨中的ERα-Wnt/β-catenin信号通路[J].中国组织工程研究, 2022,26(25):3937-3943.
[12] TSCHUMPERLIN DJ. Mechanotransduction. Compr Physiol. 2011;1(2): 1057-1073.
[13] UDA Y, AZAB E, SUN N, et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 2017;15(4):318-325.
[14] BRODERS-BONDON F, NGUYEN HO-BOULDOIRES TH, FERNANDEZ-SANCHEZ ME, et al. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. J Cell Biol. 2018;217(5):1571-1587.
[15] QIN L, LIU W, CAO H, et al. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 2020;8:23.
[16] QIN L, HE T, CHEN S, et al. Roles of mechanosensitive channel Piezo1/2 proteins in skeleton and other tissues. Bone Res. 2021;9(1):44.
[17] RANADE SS, SYEDA R, PATAPOUTIAN A. Mechanically Activated Ion Channels. Neuron. 2015;87(6):1162-1179.
[18] COSTE B, MATHUR J, SCHMIDT M, et al. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science. 2010;330(6000):55-60.
[19] ZHAO Z, ZLOKOVIC BV. Endothelial Tip Cell Finds Its Way with Piezo1. Neuron. 2020;108(1):5-7.
[20] LIU Y, TIAN H, HU Y, et al. Mechanosensitive Piezo1 is crucial for periosteal stem cell-mediated fracture healing. Int J Biol Sci. 2022; 18(10):3961-3980.
[21] 杨丽丽,康静,刘建勋,等.Piezo1通道在心血管疾病中的作用及中医药研究进展[J].中国中药杂志,2022,47(24):6533-6540.
[22] 王媛,赵星成,王永春,等.Piezo通道在心血管系统中的作用[J].心脏杂志,2022,34(5):573-578.
[23] 虎瑞. Piezo1调控LIPUS在牙周膜干细胞的内皮分化和血管生成中的作用研究[D].重庆:重庆医科大学,2022.
[24] XU X, LIU S, LIU H, et al. Piezo Channels: Awesome Mechanosensitive Structures in Cellular Mechanotransduction and Their Role in Bone. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6429.
[25] CHEN G, XU R, ZHANG C, et al. Responses of MSCs to 3D Scaffold Matrix Mechanical Properties under Oscillatory Perfusion Culture. ACS Appl Mater Interfaces. 2017;9(2):1207-1218.
[26] SHI F, XIAO D, ZHANG C, et al. The effect of macropore size of hydroxyapatite scaffold on the osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells under perfusion culture. Regen Biomater. 2021;8(6):rbab050.
[27] LIM KT, PATEL DK, DUTTA SD, et al. Fluid Flow Mechanical Stimulation-Assisted Cartridge Device for the Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Micromachines (Basel). 2021;12(8):927.
[28] MOUSAWI F, PENG H, LI J, et al. Chemical activation of the Piezo1 channel drives mesenchymal stem cell migration via inducing ATP release and activation of P2 receptor purinergic signaling. Stem Cells. 2020;38(3):410-421.
[29] 王林,王熙,季楠,等.机械激活性离子通道压电蛋白Piezo1通过Notch信号通路介导牙周膜干细胞成骨分化作用机制研究[J].华西口腔医学杂志,2020,38(6):628-636.
[30] YAN L, JIANG J, MA C, et al. Effect of knocking down Piezo1 mechanically sensitive protein on migration of MC3T3-E1 osteoblast cells. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2019;33(1):28-34.
[31] YONEDA M, SUZUKI H, HATANO N, et al. PIEZO1 and TRPV4, which Are Distinct Mechano-Sensors in the Osteoblastic MC3T3-E1 Cells, Modify Cell-Proliferation. Int J Mol Sci. 2019;20(19):4960.
[32] WANG L, YOU X, LOTINUN S, et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 2020;11(1):282.
[33] LI X, HAN L, NOOKAEW I, et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. Elife. 2019;8:e49631.
[34] SUN W, CHI S, LI Y, et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. Elife. 2019;8:e47454.
[35] HONG JH, HWANG ES, MCMANUS MT, et al. TAZ, a transcriptional modulator of mesenchymal stem cell differentiation. Science. 2005; 309(5737):1074-1078.
[36] MERRICK D, MISTRY K, WU J, et al. Polycystin-1 regulates bone development through an interaction with the transcriptional coactivator TAZ. Hum Mol Genet. 2019;28(1):16-30.
[37] YANG W, LU X, ZHANG T, et al. TAZ inhibits osteoclastogenesis by attenuating TAK1/NF-κB signaling. Bone Res. 2021;9(1):33.
[38] ZHANG Y, WANG Z, DING L, et al. Lentivirus-TAZ Administration Alleviates Osteoporotic Phenotypes in the Femoral Neck of Ovariectomized Rats. Cell Physiol Biochem. 2016;38(1):283-294.
[39] YU B, HUO L, LIU Y, et al. PGC-1α Controls Skeletal Stem Cell Fate and Bone-Fat Balance in Osteoporosis and Skeletal Aging by Inducing TAZ. Cell Stem Cell. 2018;23(2):193-209.e5.
[40] PANCIERA T, AZZOLIN L, CORDENONSI M, et al. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017; 18(12):758-770.
[41] ARAGONA M, PANCIERA T, MANFRIN A, et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 2013;154(5):1047-1059.
[42] COBBAUT M, KARAGIL S, BRUNO L, et al. Dysfunctional Mechanotransduction through the YAP/TAZ/Hippo Pathway as a Feature of Chronic Disease. Cells. 2020;9(1):151.
[43] XIE Z, HOU L, SHEN S, et al. Mechanical force promotes dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1-mediated hydrolysis of the metabolite asymmetric dimethylarginine to enhance bone formation. Nat Commun. 2022;13(1):50.
[44] WEI Q, HOLLE A, LI J, et al. BMP-2 Signaling and Mechanotransduction Synergize to Drive Osteogenic Differentiation via YAP/TAZ. Adv Sci (Weinh). 2020;7(15):1902931.
[45] XIAO Z, BAUDRY J, CAO L, et al. Polycystin-1 interacts with TAZ to stimulate osteoblastogenesis and inhibit adipogenesis. J Clin Invest. 2018;128(1):157-174.
[46] WANG L, LU Y, CAI G, et al. Polycystin-2 mediates mechanical tension-induced osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by activating transcriptional co-activator with PDZ-binding motif. Front Physiol. 2022;13:917510.
[47] HE MC, ZHANG J, CHEN XJ, et al. Osteoclastic activity was associated with the development of steroid-induced osteonecrosis of femoral head. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2020;48(1):1036-1046.
[48] ZHAO J, ZHANG X, GUAN J, et al. Identification of key biomarkers in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head and their correlation with immune infiltration by bioinformatics analysis. BMC Musculoskelet Disord. 2022;23(1):67.
[49] TIAN L, WEN Q, DANG X, et al. Immune response associated with Toll-like receptor 4 signaling pathway leads to steroid-induced femoral head osteonecrosis. BMC Musculoskelet Disord. 2014;15:18.
[50] FAN X, XU X, WU X, et al. The protective effect of DNA aptamer on osteonecrosis of the femoral head by alleviating TNF-α-mediated necroptosis via RIP1/RIP3/MLKL pathway. J Orthop Translat. 2022; 36:44-51.
[51] ATCHA H, JAIRAMAN A, HOLT JR, et al. Mechanically activated ion channel Piezo1 modulates macrophage polarization and stiffness sensing. Nat Commun. 2021;12(1):3256.
[52] LIU Q, WANG D, YANG X, et al. The Mechanosensitive Ion Channel PIEZO1 in Intestinal Epithelial Cells Mediates Inflammation through the NOD-Like Receptor 3 Pathway in Crohn’s Disease. Inflamm Bowel Dis. 2023;29(1):103-115.
[53] NOWELL CS, ODERMATT PD, AZZOLIN L, et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nat Cell Biol. 2016;18(2):168-180.
[54] YANG Y, WANG D, ZHANG C, et al. Piezo1 mediates endothelial atherogenic inflammatory responses via regulation of YAP/TAZ activation. Hum Cell. 2022;35(1):51-62.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学体外实验，多组比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年3-10月在广州中医药大学岭南医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要细胞及试剂人骨髓间充质干细胞、293T细胞购自中国科学院(干细胞库)。前期研究中所使用的人骨髓间充质干细胞已通过流式细胞仪检测CD73、CD44、CD29、CD11b、CD45及HLA-DR的表达水平，实验结果已鉴定该细胞为人骨髓间充质干细胞[11]。重组慢病毒由上海吉玛基因生物技术有限公司合成并鉴定；引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计与合成。DMEM培养基(Gibco，美国，11995065)；胎牛血清(Gibco，美国，10099133)；TRIzol试剂(TaKaRa，日本，9108)；PrimeScript™ RT reagent Kit (TaKaRa，日本，RR037A)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，上海，P0010)；茜素红S染色试剂盒(索莱宝，北京，G1452)；碱性磷酸酶检测试剂盒(万类生物，辽宁，WLA064)；氯化十六烷基吡啶(索莱宝，北京，C9890)；CCK-8试剂盒(GLPBIO，美国，GK10001)；抗Piezo1(Life，美国，MA5-32876)；抗p-TAZ(CST，美国，59971S)；抗TAZ(CST，美国，83669S)；抗p-β-catenin (Santa Cruz，美国，sc-57535)；抗β-catenin(Abcam，美国，Ab32572)；二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)(Bioss，美国，bs-0295G-Biotin)；二抗山羊抗兔IgG H&L (HRP) (Abcam，美国，AB97051)。
1.3.2 主要仪器细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)；荧光定量PCR仪(Eppendorf，德国)；多功能酶标仪(BIO-RAD，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；蛋白电泳仪(Bio-Rad，美国)。
1.4 方法
1.4.1 Piezo1慢病毒构建依据siRNA设计原理，设计3条Piezo1 siRNA序列，Piezo1-Homo-3201：GCC TCA AGT ACT TCA TCA ACT；Piezo1-Homo-1837：GCT CCT GCT GCG CCA GTT TGT；Piezo1-Homo-2337：GCA TCC TGC AGC TGC ACT ACT。siRNA序列由上海吉玛基因生物技术有限公司合成。
1.4.2 Piezo1慢病毒包装及转染根据Piezo1 siRNA沉默效率筛选的结果，选择Piezo1-Homo-2337：GCA TCC TGC AGC TGC ACT ACT siRNA序列，设计成对应的shRNA序列并分别加入BamHⅠ、Bbs Ⅰ酶切点：Piezo1 shRNA F：5’-GAT CCG CAT CCT GCA GCT GCA CTA CTT TCA AGA GAA GTT GAT GAA GTA CTT GAG GCT TTT TTG-3’；Piezo1 shRNA R：5’-CAC CCA AAA AAG CAT CCT GCA GCT GCA CTA CTT CTC TTG AAA AGT TGA TGA AGT ACT TGA GGC G-3’。Piezo 1 shRNA退火后连接至慢病毒载体，包装重组慢病毒。将293T细胞培养至80%融合时，接种至新的培养皿，放入37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养过夜。按比例加入含Piezo1 CDS序列的穿梭质粒和包装质粒，混匀，室温放置20 min。将转染混合物逐滴加入至培养皿中，轻轻混合均匀，6 h后更换新的DMEM完全培养基继续放入培养箱中培养，72 h后收集上清，4 ℃，4 000 r/min离心4 min，再用0.45 μm滤器过滤，收集滤液，4 ℃，20 000 r/min离心滤液2 h，收集后置4 ℃冰箱保存。
将293T细胞以每孔1×105接种于96孔板，感染复数为1，10，50，100，转染72 h后使用荧光显微镜观察转染情况后得出最佳感染复数。转染效率计算：将细胞置于200倍视野下，随机挑选10个视野并计算其中的细胞总数和荧光细胞数，细胞转染效率=10个视野内带荧光细胞总数/10个视野内细胞总数。
1.4.3 Piezo1慢病毒转染人骨髓间充质干细胞实验分为3组：①空白对照组：在正常培养基中培养未经转染的人骨髓间充质干细胞；②阴性对照组：用携带阴性对照的慢病毒载体转染人骨髓间充质干细胞；③si-Piezo1组：用携带si-Piezo1的慢病毒载体转染人骨髓间充质干细胞。第3代人骨髓间充质干细胞培养至80%-90%时消化并计数，按6×105个/孔的细胞密度接种到6孔板中，第2天换无血清DMEM培养基并以感染复数为100加入慢病毒；培养箱中孵育2 h，换成含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养；72 h后消化收集细胞，用于提取RNA和蛋白检测干扰效果。
1.4.4 转染后Piezo1 mRNA和蛋白表达检测
(1) RT-qPCR检测Piezo1 mRNA的表达：人骨髓间充质干细胞感染重组慢病毒72 h后收集细胞沉淀，加入1 mL的Trizol Reagent提取各组细胞RNA，使用PrimeScript™ RT reagent Kit进行反转录。使用RT-qPCR检测转染后Piezo1 mRNA的表达，引物序列见表1。PCR反应体系(10 μL)：上下游引物各2 μL、cDNA 2 μL、50× Rox Reference Dye 0.4 μL、ddH2O 3.6 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃for 35 s，40个循环。相对表达量以2-ΔΔCt法计算，内参为GAPDH。
(2)Western blot检测Piezo1 蛋白的表达：人骨髓间充质干细胞感染重组慢病毒72 h后收集细胞沉淀，加入适当体积的 RIPA(使用前数分钟内已加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)，冰浴30 min，反复用移液枪吹打至细胞充分裂解，12 000×g离心15 min后收集上清，使用BCA试剂盒根据说明书测定其浓度；待测样品与5X SDS上样缓冲液以4∶1的比例混合，加热至100 ℃持续5 min后置于冰上。将制备好的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入一抗Piezo1(稀释比例1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次去除未结合抗体后加二抗室温孵育2 h，再洗膜3次后使用凝胶成像系统和Image Pro Plus软件对条带进行分析。
1.4.5 CCK8细胞毒性实验实验分为3组：①空白对照组：未经转染的人骨髓间充质干细胞；②阴性对照组：用携带阴性对照的慢病毒载体转染人骨髓间充质干细胞；③si-Piezo1组：用携带si-Piezo1的慢病毒载体转染人骨髓间充质干细胞。将第3代人骨髓间充质干细胞以每孔5×104个接种于96孔板中，在37 ℃培养箱中培养24 h，第2天换无血清DMEM培养基并以感染复数为100加入慢病毒；培养箱中孵育2 h，换成含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养48 h，向每孔中加入10 μL CCK8溶液，孵育3 h。使用酶标仪测量各组细胞在波长450 nm处的吸光度值。
1.4.6 成骨诱导培养收集第3代对数生长期人骨髓间充质干细胞并计数，将细胞以1×109 L-1的浓度接种于6孔板，每孔加入2 mL细胞悬液。细胞培养过夜贴壁后，分别感染重组Piezo1沉默慢病毒或携带阴性对照的慢病毒载体，感染复数为100。感染24 h后，加入2 mL成骨诱导液进行成骨诱导。
1.4.7 碱性磷酸酶活性测定人骨髓间充质干细胞感染重组慢病毒后成骨诱导3，7，14 d时收集细胞，严格按碱性磷酸酶检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定各组细胞在波长520 nm处的吸光度值，计算其碱性磷酸酶活性。
碱性磷酸酶活性的计算：细胞中碱性磷酸酶的活性(金氏单位/g)=(测定吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)×标准品浓度(0.1 mg/mL)÷待测样本蛋白浓度(g/mL)。
1.4.8 茜素红染色人骨髓间充质干细胞感染重组慢病毒后成骨诱导培养14 d时，倒掉培养基用PBS清洗细胞2次，
40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后按1 mL/孔加入茜素红染色液，室温孵育20 min并轻微振荡，再次PBS清洗后显微镜下观察各组细胞染色情况，拍照后使用10%氯化十六烷基吡啶溶解钙化结节，并检测波长562 nm处的吸光度值。

1.4.9 RT-qPCR检测成骨相关基因Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin及TAZ mRNA的表达人骨髓间充质干细胞感染重组慢病毒并成骨诱导7 d后，弃孔内培养基，消化收集细胞，提取RNA，qPCR检测Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、TAZ、β-catenin mRNA的表达。RNA提取及qPCR检测方法同1.4.4。引物序列见表1。

1.4.10 Western blot检测成骨相关蛋白β-catenin及TAZ的表达人骨髓间充质干细胞感染重组慢病毒并成骨诱导7 d后，弃孔内培养基，消化收集细胞，提取蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，Western blot检测p-TAZ(1∶1 000)/TAZ(1∶1 000)、p-β-catenin(1∶1 000)/β-catenin(1∶5 000)蛋白表达。蛋白提取及Western blot检测方法同1.4.4。
1.4.11 免疫荧光染色人骨髓间充质干细胞感染重组慢病毒并成骨诱导7 d后，弃孔内培养基，加入40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗3遍；用0.2% Triton X-100(PBS配制)对细胞透化处理10 min，PBS洗3遍； 2%BSA封闭30 min，PBS洗2遍；加入一抗TAZ(1∶100)、β-catenin(1∶200)，室温孵育1 h，PBS洗3遍；加入APC标记的二抗(1∶500)，室温孵育30 min；PBS洗4遍；加入0.5 μg/mL DAPI(PBS配制)染色10 min；PBS洗3遍，去除多余的DAPI，荧光显微镜观察并拍照记录。
1.5 主要观察指标 ①Piezo1慢病毒沉默效率；②沉默Piezo1对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响；③沉默Piezo1对骨髓间充质干细胞中TAZ表达的影响。
1.6 统计学分析采用SPPS 20.0软件分析，数据以x±s表示，2组间比较采用t检验，3组间比较采用单因素方差分析。使用Graphpad prism 9.0进行统计及绘图。P < 0.05为差异有显著性意义，所有实验均重复3次。文章统计学方法已经通过广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

机械传导作为一种基本能力，涉及许多人体包括触觉、听觉、生长发育等在内的多个生理过程[12]。机械传导在人体骨骼生长中发挥关键作用，正确的机械传导可维持人体骨骼、肌肉及其他组织器官正常工作，反之则会导致疾病的发生和发展，如骨质疏松、心血管疾病、癌细胞转移等[13-16]。机械转导的实现需要依靠人体中特殊蛋白将其转换成生化信号并诱导细胞一系列的反应变化。机械激活离子通道受到机械力的刺激后，可快速响应激活细胞内信号传导[17]。2010年，PATAPOUTIAN团队发现了一种新型机械激活离子通道，并命名为Piezo家族[18]。其中Piezo1在既往研究中主要被发现在兴奋性细胞类型中表达，对血管发育和功能、轴突生长分化等起重要作用[19]。越来越多研究发现，Piezo1的主要作用发挥在骨骼系统中，可以影响骨形成和骨重塑[20]。股骨头坏死作为骨科常见疾病，虽然目前病理机制尚不明确，但其坏死后处于修复期时骨吸收囊变及新血管生成促进了新骨的形成，当骨修复不足时软骨下骨小梁发生应力性骨折导致塌陷的发生。塌陷作为股骨头坏死疾病过程的重要转折点，对患者日常生活产生重要的影响。在股骨头坏死治疗过程中，促进成骨、抑制破骨的骨修复区域需要充足的血运，研究发现Piezo1可以通过介导血管内皮细胞促进血管生成[21-23]。当Piezo1被敲除后，血管发育明显受损[16，24]。由此可见，血管生成及骨重塑都与Piezo1关系密切，因此作者认为在进行股骨头坏死相关研究时，能够充分认识Piezo1在其中发挥的作用具有重要意义。
骨骼中间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞等都能够感知机械刺激并做出反应[25-27]。MOUSAW等[28]发现激活Piezo1能刺激人牙髓来源间充质干细胞的迁移，这一过程包括Piezo1诱导碱性磷酸酶释放并随后激活P2受体嘌呤信号和下游的PYK2和MEK/ERK信号通路。王林等[29]发现机械牵张应力促进了Piezo1的表达，并且Ca2+可作为第二信使进一步激活Notch1信号通路从而促进人牙髓来源间充质干细胞成骨分化。SUGIMOTO等[7]还发现使用Piezo1 蛋白通道激动剂Yoda1后，骨形态发生蛋白2表达增加并促进成骨细胞分化，同时负向调节间充质干细胞向脂肪细胞分化。除了间充质干细胞，Piezo1还可以调节成骨细胞、破骨细胞的分化。YAN等[30]研究表明，沉默Piezo1后MC3T3-E1成骨细胞的迁移能力被明显抑制。YONEDA等[31]也发现使用Piezo1激活剂Yoda1后，促进了MC3T3-E1成骨细胞的增殖。WANG 等[32]发现机械力刺激Piezo1后通过YAP调控Ⅱ型和Ⅸ型胶原酶的表达，从而抑制破骨细胞活性。LI等[33]还发现Piezo1通过YAP1/TAZ控制Wnt1以及Rankl表达，以调节成骨和破骨的分化。SUN等[34]证明Piezo1缺失后通过CaMKⅡ/Creb信号通路使得成骨相关蛋白降低，抑制成骨细胞分化。此次研究中，在人骨髓间充质干细胞中使用慢病毒沉默Piezo1，随后检测发现人骨髓间充质干细胞中Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin等成骨相关蛋白表达明显下降，说明沉默Piezo1后人骨髓间充质干细胞的成骨分化受到抑制。
TAZ与YAP同为Hippo信号通路中的关键转录共激活因子，可与多种转录因子相互作用，还与骨骼、脂肪、肌肉、心肺组织的发育密切相关[8]。同时，TAZ在维持干细胞自我更新中起重要作用，调节间充质干细胞成脂分化和成骨分化的平衡。TAZ还是Bglap基因的Runx2共激活因子，其中Bglap基因是成骨细胞分化的晚期标志物。TAZ通过共激活Runx2依赖性基因转录促进间充质干细胞向成骨细胞谱系分化，同时还通过抑制PPARγ依赖性基因转录阻断间充质干细胞向脂肪细胞谱系分化，可用于治疗骨质疏松等疾病[35]。当斑马鱼敲除TAZ时其骨矿化能力降低[36]，小鼠敲除TAZ后呈现骨质疏松的低骨量表型是由于TAZ缺乏导致体内破骨细胞形成和骨吸收增强而引发的[37]。ZHANG等[38]将TAZ过表达的慢病毒注射到去卵巢大鼠的股骨颈后，发现股骨颈区的骨密度、刚度明显增加；在股骨颈同一区域，注射TAZ过表达慢病毒的大鼠骨小梁分离度降低，而骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量明显增加。YU等[39]发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)缺失抑制了TAZ的表达，而使得骨形成被抑制并促进了骨吸收。在此次研究中，沉默Piezo1的人骨髓间充质干细胞成骨诱导后，TAZ表达明显下降，证明了Piezo1沉默影响了TAZ的转录，进一步抑制了成骨分化。
值得注意的是，TAZ除了作为转录共激活因子调节成骨-成脂平衡外，近年来的大量研究还证明了TAZ调节的主要决定因素是细胞机械转导，并主要以独立于LATS的方式进行。TAZ读取了众多生物力学信号并以特定于每种类型的细胞和机械应力的方式将它们转化为生物效应[40]。当细胞浓度由低转高时，TAZ则由细胞核迁移至细胞质中，细胞增殖受到影响[41]。表面积较小的细胞中TAZ位于细胞质中，当对细胞进行拉伸后，细胞表面积增大，TAZ由质迁移至核，促进了细胞增殖。3D细胞外基质培养细胞时，软外基质的细胞中TAZ定位在细胞质，而硬外基质的细胞中TAZ则是定位在细胞核[10，42]。因此，细胞浓度、细胞形态、细胞外基质改变都会传递力学信号，并调控TAZ以调节细胞的增殖。当TAZ受到升高的机械信号输入后，促进了人胚胎干细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、体细胞、心脏祖细胞等增殖分化、间充质干细胞成骨分化、受伤的上皮细胞愈合、成纤维细胞纤维化等。而低机械刺激会引起内皮细胞和血管平滑肌细胞自噬、人胚胎干细胞神经元分化、间充质干细胞成脂分化、微血管内皮细胞失巢凋亡等[40]。同时异常的机械信号参与了疾病的发生发展，在动脉粥样硬化等心血管疾病、纤维化疾病、肌肉骨骼疾病及癌症等疾病中，TAZ作为机械转导关键因子参与其中。机械力刺激激活了TAZ/SMAD4以诱导DDAH1的转录表达并促进了ADMA的水解，这增强了骨形成[43]。WEI等[44]发现骨形态发生蛋白2及机械转导可协同作用，并通过TAP/TAZ诱导成骨分化的发生。XIAO等[45]发现在成骨细胞中多囊蛋白PC1可以与TAZ互相影响并形成一个机械感应复合物。当细胞外基质硬度增加以及对骨髓间充质干细胞进行机械拉伸刺激了PC1-CTT/TAZ复合物核移位，促进了成骨并抑制了成脂。WANG等[46]发现机械刺激下多囊蛋白PC2激活TAZ促进人脂肪干细胞成骨分化。由此可见，TAZ响应了不同机械信号，这证明了其作为通用机械传感器和机械效应器的核心作用。
在此次研究中将TAZ作为一项重要指标进行观测，不仅仅是由于其在成骨分化中发挥的重要作用，更是由于其作为通用机械传感器和效应器可以读取众多生物力学信号的核心作用。同时，股骨头坏死相关研究还发现机械应力在股骨头坏死塌陷及骨重塑过程中产生重要影响[47]。作者所在团队前期研究在股骨头坏死组织样本中发现，正常区、硬化区和坏死区中Piezo1的表达具有明显差异，坏死区Piezo1的表达最高，正常区最低，推测这可能由于坏死区机械应力集中，而正常区及硬化区负重应力较低，还有可能因为坏死区有着强烈的机械转导信号刺激导致[8]。因此作者认为Piezo1促进坏死区修复并调节骨稳态可能是通过感知应力刺激所产生的。综上，不论是Piezo1还是TAZ都与机械应力刺激密切相关。作者推测TAZ不仅通过调节成骨-成脂影响骨代谢，还可能由于机械应力因素在股骨头坏死塌陷及重塑过程中发挥重要作用，同时在这一过程中TAZ还可能与Piezo1之间有着密切联系。因此，这可能是未来研究股骨头坏死的重要研究方向。然而，此次研究中仍存在着一定局限性，未进一步对细胞进行机械刺激，故无法更直观地观察在机械刺激下TAZ和Piezo1的表达变化以及它们是否有重要相关性。
此外，研究者们还发现，无论是激素性股骨头坏死还是酒精性股骨头坏死，炎症反应都参与其中，而Piezo1及TAZ都在机械刺激介导的炎症相关反应中发挥重要作用。在激素性股骨头坏死中，糖皮质激素激活了相关炎症通路，使得包括白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等在内的大量炎症相关因子被释放，破坏了骨吸收与骨形成的平衡，加速了股骨头坏死的进程[48-50]。在酒精性股骨头坏死中，经典的TLR/MyD88/NF-kB炎症通路被激活促使了疾病的发生和发展。近年来，研究者们发现Piezo1在巨噬细胞及其他免疫细胞中高度表达。ATCHA等[51]研究发现Piezo1可调节干扰素γ和脂多糖诱导的炎症并抑制白细胞介素4和白细胞介素13诱导的愈合反应。LIU等[52]研究发现Piezo1可促进NLRP3炎症小体的激活。在慢性炎症中，细胞外基质僵硬与YAP/TAZ信号改变存在联系。角膜损失诱导角膜基质引起慢性炎症和细胞外基质沉积，随后进行YAP、TAZ核定位，这种机械异常环境导致了失明[53]。此外，YANG等[54]发现Piezo1可以通过调节YAP/TAZ活化和核定位来介导内皮致动脉粥样硬化炎症反应。因此，除了推测的机械应力因素外，Piezo1及TAZ作为介导炎症的关键因素，可以通过调控相关炎症反应途径以达到延缓股骨头坏死发展的重要靶点。故在股骨头坏死相关研究中，深入挖掘TAZ和Piezo1具有重要意义。
综上，研究结果显示Piezo1能够影响人骨髓间充质干细胞的成骨分化，沉默Piezo1后人骨髓间充质干细胞的成骨能力明显降低，沉默Piezo1后其TAZ的表达也明显降低，这为Piezo1和TAZ在干细胞方面以及股骨头坏死治疗方面的研究提供思路，尤其是TAZ和Piezo1作为重要机械应力刺激影响因素在股骨头坏死中方面的研究。后期可考虑继续深入挖掘相关机制，进一步开展动物实验或相关临床研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达

Effect of lentiviral silencing of Piezo1 on osteogenic differentiation and TAZ expression in human bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	范永晶, 王姝, 金武龙. 颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 100-106.
[2]	张元澍, 何旭, 薛源, 金叶盛, 汪凯, 施勤, 芮永军. 鸢尾素缓解棕榈酸对骨髓间充质干细胞的成骨抑制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 26-31.
[3]	周明华, 胡晓宇. LncRNA SNHG4调控牙周膜干细胞成骨分化过程中的miR-152-3p[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 38-43.
[4]	潘钟杰, 秦志鸿, 郑铁军, 丁晓飞, 廖世杰. 股骨头坏死发病机制中非编码RNA的靶标性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1441-1447.
[5]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[6]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[7]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[8]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[9]	袁维, 刘静东, 徐广辉, 康健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[10]	秦宇星, 任前贵, 李子龙, 全嘉星, 沈佩锋, 孙韬, 王浩宇. 骨微血管内皮细胞在股骨头坏死中的作用机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 955-961.
[11]	李辉, 张堃, 郝阳泉, 冯磊, 杨治, 许鹏, 鲁超. 机器人辅助髓芯减压植骨治疗ARCO Ⅱ期股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 547-551.
[12]	陶新, 徐逸, 宋志文, 刘锦波. Hippo信号通路参与脊髓损伤的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 619-625.
[13]	赵俊, 陈昌胜, 徐众华, 陈红峰, 张锋, 王秋平, 周金龙, 阙云端. 股骨颈内固定系统与单纯空心螺钉内固定治疗65岁以下股骨颈骨折的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(36): 5823-5827.
[14]	环大维, 袁兆丰, 窦维强, 夏天卫, 邱越, 张超, 沈计荣. 动态对比增强核磁评价股骨头坏死微循环灌注的改变[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(36): 5864-5869.
[15]	梁学振, 骆帝, 李嘉程, 温明韬, 张建, 许波, 李刚. 激素性股骨头坏死中的PTGS2和STAT3：潜在铁死亡相关诊断生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(36): 5898-5904.