2.1   大鼠脂肪来源干细胞形态观察及鉴定结果   大鼠脂肪来源干细胞提取后接种在培养皿中，24 h后倒置显微镜观察显示，细胞形态大多呈梭形，少数呈三角形或多边形，见图1A。第3代大鼠脂肪来源干细胞成脂诱导过程中，细胞内逐渐出现形态大小不一的脂滴，诱导2周后油红O染色呈阳性；成骨诱导4周的过程中，大鼠脂肪来源干细胞的形态逐渐由梭形变为多边形，可观察到细胞间有钙结节形成，茜素红染色呈阳性，见图1B，C。流式细胞术结果表明大鼠脂肪来源干细胞表面抗原CD29、CD90阳性表达率分别为84.51%，99.95%，CD34、CD45的阳性表达率分别为0.52%，0.06%，见图1D。
2.2   糖尿病大鼠模型评估结果   注射链脲佐菌素后第3，5，7天大鼠随机血糖值均大于正常值16.7 mmol/L，大鼠第7天随机血糖(26.66±4.91) mmol/L较造模前(5.68±0.18) mmol/L明显增加(P < 0.001)，说明糖尿病大鼠模型是合格的，见图1E。



2.3   直流电场作用后的大鼠脂肪来源干细胞对糖尿病大鼠难愈性创面愈合的影响    
2.3.1   大鼠脂肪来源干细胞促进糖尿病大鼠创面愈合   测量大鼠治疗前(0 d)和治疗后3，7，14 d创面愈合率，结果表明：PBS组各时间点创面愈合率均明显低于未刺激脂肪来源干细胞组和直流电场刺激脂肪来源干细胞组(P < 0.05)，与未刺激脂肪来源干细胞组相比，直流电场刺激脂肪来源干细胞组的创面愈合速度更快(P < 0.05)。第14天，直流电场刺激脂肪来源干细胞组创面已经基本愈合，愈合率达到95%，未刺激脂肪来源干细胞组愈合率为87%，PBS组为81%，见图2A，B，表明直流电场作用后的脂肪来源干细胞可促进糖尿病大鼠创面愈合，其促进糖尿病大鼠创面愈合的效率显著高于未刺激组。
2.3.2   大鼠脂肪来源干细胞促进创面上皮化   大鼠皮肤全层缺损后表现为表皮、真皮层结构明显缺失。术后第3天，各组大鼠创面均未见明显上皮化，可见大量炎症细胞；治疗第7天，直流电场刺激脂肪来源干细胞组表皮及真皮增生更加明显；治疗第14天，各组基本形成表皮及真皮结构，其中直流电场刺激脂肪来源干细胞组的表皮较其他组更完整，而PBS组表皮则不连续，未刺激脂肪来源干细胞组则介于二者之间，各组炎性细胞均明显减少，见图2C。



2.3.3   大鼠脂肪来源干细胞促进创面血管生成   通过高倍镜下苏木精-伊红染色视野计数和免疫荧光观察CD31的表达来评估创面新生血管的形成，结果显示：术后第3，7，14天，与未刺激脂肪来源干细胞组和PBS组相比，直流电场刺激脂肪来源干细胞组血管密度和CD31表达均明显增加(P < 0.05)， 未刺激脂肪来源干细胞组在第7，14天时与PBS组相比稍多(P < 0.05)，见图3(箭头表示血管生成)。



2.3.4   大鼠脂肪来源干细胞促进血管内皮生长因子的生成   血管生成与血管内皮生长因子等细胞因子关系密切，为此通过免疫组化方法对不同组间创面组织血管内皮生长因子的表达进行图像软件分析。数据显示：随着创面愈合的进展各组血管内皮生长因子的表达逐渐增加，治疗第3天，直流电场刺激脂肪来源干细胞组中可见较少血管内皮生长因子表达，但多于未刺激脂肪来源干细胞组和PBS组(P < 0.05)；第7天时各组大鼠创面血管内皮生长因子表达明显增加，与未刺激脂肪来源干细胞组和PBS组相比，直流电场刺激脂肪来源干细胞组血管内皮生长因子表达增加明显(P < 0.05)，未刺激脂肪来源干细胞组和PBS组间也存在明显差异(P < 0.05)；第14天时创面组织血管内皮生长因子表达丰富，其中直流电场刺激脂肪来源干细胞组表达最多的血管内皮生长因子(P < 0.05)，其余两组无明显差异，见图4。



2.3.5   大鼠脂肪来源干细胞促进创面血流灌注   激光散斑对比成像仪测量不同时间点大鼠创面及周围正常皮肤血流灌注，结果显示，治疗后第3，7，14天，直流电场刺激脂肪来源干细胞组创面与周围正常皮肤血流灌注比值均高于PBS组(P < 0.05)。与未刺激脂肪来源干细胞组相比，第3，7天时直流电场刺激脂肪来源干细胞组创面血流灌注明显增高(P < 0.05)，第14天时两组则无明显差异。未刺激脂肪来源干细胞组在第7天也表现出较PBS组更高的血流灌注(P < 0.05)，而在第3，14天时则无统计学意义。此外，3组大鼠的血流灌注在第3天时稍低，第7天达到峰值，随后出现不同程度下降，表现出相同的趋势，见图5。




2.4   生物相容性   术后没有发生与植入细胞有关的不良反应。

[1] OLSSON M, JÄRBRINK K, DIVAKAR U, et al. The humanistic and economic burden of chronic wounds: A systematic review. Wound Repair Regen. 2019;27(1):114-125. [2] SUN X, NI P, WU M, et al. A Clinicoepidemiological Profile of Chronic Wounds in Wound Healing Department in Shanghai. Int J Low Extrem Wounds. 2017;16(1):36-44. [3] KERN S, EICHLER H, STOEVE J, et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006;24(5):1294-1301. [4] ENGELA AU, BAAN CC, PEETERS AM, et al. Interaction between adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and regulatory T-cells. Cell Transplant. 2013;22(1):41-54. [5] CAWTHORN WP, SCHELLER EL, MACDOUGALD OA. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 2012;23(6):270-277. [6] PUISSANT B, BARREAU C, BOURIN P, et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 2005;129(1):118-129. [7] LU C, KOLBENSCHLAG J, NÜSSLER AK, et al. Direct Current Electrical Fields Improve Experimental Wound Healing by Activation of Cytokine Secretion and Erk1/2 Pathway Stimulation. Life (Basel). 2021;11(11): 1195. [8] 刘兰,刘星可,刘梦嫦,等.直流电场对人脂肪间充质干细胞增殖和干细胞生物学特性的影响 [J]. 第三军医大学学报,2021,43(11): 1010-1017. [9] HOLM JS, TOYSERKANI NM, SORENSEN JA. Adipose-derived stem cells for treatment of chronic ulcers: current status. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):142. [10] SUN Y, SONG L, ZHANG Y, et al. Adipose stem cells from type 2 diabetic mice exhibit therapeutic potential in wound healing. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):298. [11] STOJANOVIĆ S, NAJMAN S. The Effect of Conditioned Media of Stem Cells Derived from Lipoma and Adipose Tissue on Macrophages’ Response and Wound Healing in Indirect Co-culture System In Vitro.  Int J Mol Sci. 2019;20(7):1671. [12] KLAR AS, MICHALAK-MIĆKA K, BIEDERMANN T, et al. Characterization of M1 and M2 polarization of macrophages in vascularized human dermo-epidermal skin substitutes in vivo. Pediatr Surg Int. 2018;34(2): 129-135. [13] ZOMER HD, JEREMIAS TDS, RATNER B, et al. Mesenchymal stromal cells from dermal and adipose tissues induce macrophage polarization to a pro-repair phenotype and improve skin wound healing. Cytotherapy. 2020;22(5):247-260. [14] MAZINI L, ROCHETTE L, ADMOU B, et al. Hopes and Limits of Adipose-Derived Stem Cells (ADSCs) and Mesenchymal Stem Cells (MSCs) in Wound Healing. Int J Mol Sci. 2020;21(4):1306. [15] ZHOU X, NING K, LING B, et al. Multiple Injections of Autologous Adipose-Derived Stem Cells Accelerate the Burn Wound Healing Process and Promote Blood Vessel Regeneration in a Rat Model. Stem Cells Dev. 2019;28(21):1463-1472. [16] ALEXANDRUSHKINA N, NIMIRITSKY P, EREMICHEV R, et al. Cell Sheets from Adipose Tissue MSC Induce Healing of Pressure Ulcer and Prevent Fibrosis via Trigger Effects on Granulation Tissue Growth and Vascularization. Int J Mol Sci. 2020;21(15):5567. [17] HUANG SP, HUANG CH, SHYU JF, et al. Promotion of wound healing using adipose-derived stem cells in radiation ulcer of a rat model. J Biomed Sci. 2013;20(1):51. [18] GENG Y, YANG J, LI S, et al. Chyloid Fat Carried Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Accelerate Wound Healing Via Promoting Angiogenesis. Ann Plast Surg. 2021;87(4):472-477. [19] NAMBU M, KISHIMOTO S, NAKAMURA S, et al. Accelerated wound healing in healing-impaired db/db mice by autologous adipose tissue-derived stromal cells combined with atelocollagen matrix. Ann Plast Surg. 2009;62(3):317-321. [20] AJIT A, SANTHOSH KUMAR TR, KRISHNAN LK. Engineered Human Adipose-Derived Stem Cells Inducing Endothelial Lineage and Angiogenic Response. Tissue Eng Part C Methods. 2019;25(3):148-159. [21] QIAN L, PI L, FANG BR, et al. Adipose mesenchymal stem cell-derived exosomes accelerate skin wound healing via the lncRNA H19/miR-19b/SOX9 axis. Lab Invest. 2021;101(9):1254-1266. [22] RODRIGUEZ J, BOUCHER F, LEQUEUX C, et al. Intradermal injection of human adipose-derived stem cells accelerates skin wound healing in nude mice. Stem Cell Res Ther. 2015;6:241. [23] LOVE MR, PALEE S, CHATTIPAKORN SC, et al. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. J Cell Physiol. 2018; 233(3):1860-1876. [24] BROUGHTON G 2ND, JANIS JE, ATTINGER CE. Wound healing: an overview. Plast Reconstr Surg. 2006;117(7 Suppl):1e-S-32e-S. [25] 颜洪.着眼瘢痕防治，促进创面愈合 [J].第三军医大学学报,2021, 43(11):997-1002. [26] WILKINSON HN, HARDMAN MJ. Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes. Open Biol. 2020;10(9):200223. [27] WU Y, CHEN L, SCOTT PG, et al. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem Cells. 2007;25(10):2648-2659. [28] NIE C, YANG D, MORRIS SF. Local delivery of adipose-derived stem cells via acellular dermal matrix as a scaffold: a new promising strategy to accelerate wound healing. Med Hypotheses. 2009;72(6):679-682. [29] HUANG S, HU Z, WANG P, et al. Rat epidermal stem cells promote the angiogenesis of full-thickness wounds. Stem Cell Res Ther. 2020; 11(1):344. [30] DOMINICI M, LE BLANC K, MUELLER I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4):315-317. [31] BAO P, KODRA A, TOMIC-CANIC M, et al. The role of vascular endothelial growth factor in wound healing. J Surg Res. 2009;153(2):347-358. [32] BATES DO, JONES RO. The role of vascular endothelial growth factor in wound healing. Int J Low Extrem Wounds. 2003;2(2):107-120. [33] JOHNSON KE, WILGUS TA. Vascular Endothelial Growth Factor and Angiogenesis in the Regulation of Cutaneous Wound Repair. Adv Wound Care (New Rochelle). 2014;3(10):647-661. [34] CHUNG AS, FERRARA N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011;27:563-584. [35] ONG HT, DILLEY RJ. Novel non-angiogenic role for mesenchymal stem cell-derived vascular endothelial growth factor on keratinocytes during wound healing. Cytokine Growth Factor Rev. 2018;44:69-79. [36] ZHANG P, LU J, JING Y, et al. Global epidemiology of diabetic foot ulceration: a systematic review and meta-analysis. Ann Med. 2017; 49(2):106-116. [37] YANG M, SHENG L, ZHANG TR, et al. Stem cell therapy for lower extremity diabetic ulcers: where do we stand? Biomed Res Int. 2013; 2013:462179. [38] SORG H, TILKORN DJ, MIRASTSCHIJSKI U, et al. Panta Rhei: Neovascularization, Angiogenesis and Nutritive Perfusion in Wound Healing. Eur Surg Res. 2018;59(3-4):232-241. [39] REGE A, THAKOR NV, RHIE K, et al. In vivo laser speckle imaging reveals microvascular remodeling and hemodynamic changes during wound healing angiogenesis. Angiogenesis. 2012;15(1):87-98.

[1]	王 继, 张 敏, 杨中亚, 张 龙. 体力活动干预2型糖尿病肌少症的研究现状[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1272-1277.
[2]	宋荷花, 魏在荣. 糖尿病的周围神经病变：研究与治疗[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1278-1285.
[3]	孙佳佳, 朱海迪, 卢 赟, 张 凯. 髋部骨折合并2型糖尿病和非2型糖尿病患者骨代谢标志物的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1156-1160.
[4]	李梦菲, 仉 红, 赵少剑, 殷广浩, 王其宝. 叉头样转录因子3在粪肠球菌感染模型大鼠难治性根尖周炎病变中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1187-1192.
[5]	张永强, 潘 凤, 孙 鹏, 谭明辉, 轩留明, 王勤章. Gja1基因重组慢病毒对糖尿病豚鼠膀胱病变模型中缝隙连接蛋白43蛋白及mRNA表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1161-1165.
[6]	赵 璐, 赵逸菲, 高 达, 刘艳芳, 付婷婷, 徐江雁. Zeste基因抑制子基因12在糖尿病肾脏病模型大鼠肾组织中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1179-1186.
[7]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣 慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[8]	乔鲁卉, 马子雨, 郭浩宇, 侯玉东. 葛根素与淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 872-877.
[9]	廖益东, 明 江, 宋文学, 王梓力, 张 宇, 廖一飞, 徐卡娅, 杨 华. 一种同时培养原代皮质及海马神经元的实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 897-902.
[10]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋 震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
[11]	许其静, 杨伊春, 雷 微, 杨 莹, 余 江, 夏婷婷, 张 萌, 章 涛, 张 潜. 糖尿病皮肤慢性创面无细胞治疗的进展与问题[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 962-969.
[12]	王金玲, 黄夏荣, 屈萌艰, 黄福锦, 尹林伟, 钟培瑞, 刘 静, 孙光华, 廖 阳, 周 君. 运动训练老年骨质疏松大鼠骨量及骨微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 676-682.
[13]	杨 恒, 郑丽英, 刘志立, 王勤章, 郝志强, 王敬珅, 汪 渊, 李永乐, 谭明辉, 邹晓峰, 张国玺, 黄若辉, 江 波, 钱 彪. 结扎不同部位输精管大鼠睾丸的生理功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 720-725.
[14]	陈晓驷, 谭小艳, 刘田丰, 韩登鹏, 魏 波, 胡资兵, 吴少科. 积雪草酸对骨质疏松模型大鼠生物力学特性与骨小梁面积及Runx2蛋白的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 246-251.
[15]	王欢欢, 王 青, 唐 鹏, 张 睿, 闵红巍. 体外冲击波干预骨关节炎大鼠软骨细胞的增殖和自噬[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 252-257.

因各种原因造成愈合缓慢或不愈合超过1个月的创面称为慢性创面或难愈性创面，主要包括术后无法愈合的伤口、压力性溃疡、血管性溃疡、糖尿病性溃疡和难愈性烧伤等。难愈性创面治疗至今是全球医疗卫生系统的重大挑战，在给患者带来身心痛苦的同时，也给患者家庭和社会带来沉重的经济负担[1-2]。目前脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)因其具有分化成不同细胞群和通过旁分泌相关细胞因子发挥作用的能力，正在成为干细胞领域的超级明星。同时脂肪干细胞来源丰富[3]，具有易于获取、取材方便、免疫排异反应低[4-6]、可进行自体和异体移植等优势，使其成为组织工程和再生医学应用领域理想的种子细胞。然而脂肪来源干细胞的临床应用过程繁杂且细胞需求量大，并且在体外培养过程中发现随着传代次数的增加干细胞会逐渐老化，丧失增殖能力和干细胞特性，因此，在体外培养脂肪来源干细胞过程中，如何提高增殖能力并保持其干细胞特性以及加快临床转化应用成为目前亟待解决的问题。

直流电场是一项有效且具有临床转化应用潜力的促进脂肪来源干细胞体外快速扩增的技术，是一种用于诱导细胞增殖的物理方法。有研究表明体外直流电场刺激人表皮细胞可促进细胞因子分泌进而促进创面愈合[7]。课题组前期的研究也发现，0-150 mV/mm的直流电场强度可不同程度地促进人脂肪来源干细胞的增殖并保持干细胞特性；随着电场强度的增加，细胞增殖能力也逐渐提高，当增加到 100 mV/mm 时，细胞增殖最为明显[8]。然而，直流电场作用后的脂肪来源干细胞对难愈性创面愈合的影响及其潜在机制目前尚未可知。因此，该研究拟从直流电场刺激入手，根据课题前期研究得出促进脂肪来源干细胞增殖的最佳处理方案，观察直流电场刺激的脂肪来源干细胞对糖尿病大鼠难愈性创面愈合的影响，以期为难愈性创面的治疗提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验。两组间比较用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2022年1-3月在西南医科大学附属医院中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   6-8周龄的SPF级健康雄性SD大鼠23只，体质量为180-250 g，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号： SCXK(川)2019-031，动物处理及实验操作方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准(伦理批号swmu20220038)，实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   实验试剂与仪器   胎牛血清购自美国 Gibco公司；DMEM高糖培养基、胰酶、胰蛋白酶-EDTA、青霉素-链霉素溶液购自美国 HyClone公司；大鼠脂肪来源干细胞表面抗体购自美国BD公司；成脂、成骨诱导分化试剂盒(RAXMD-90031、RAXMD-90021)购自美国Cyagen公司；血管内皮生长因子抗体购自Abcam(Ab1316)；CD31抗体购自 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY(sc-376764)；流式细胞仪购自美国BD公司；二氧化碳孵箱、超低温离心机购自美国Thermo公司； 荧光倒置显微镜购自日本 Olympus公司；恒温摇床购自上海一恒公司；PeriScan PIMⅡ型激光散斑对比成像仪(LSCI)购自瑞典PERIMED公司。
1.3.3   直流电场设备   该设计由固定在细胞/组织培养室顶盖上的镀金电极组成，该培养室适合标准的 6 孔细胞/组织培养板，便于操作和灭菌，并将培养基蒸发降至最低。每组电极板由 13 根直径为 1 mm 镀金电极并联组成(根据6孔培养盒培养孔的尺寸和直流电场的均匀性确定)，并且每组电极板均使用聚甲基丙烯酸甲酯密封，以防止电刺激过程中释放的毒性递质干扰实验结果。从盖子上伸出的电极尖端在并联电路中焊接到镀银铜线上，并通过香蕉连接器连接到标准电源。电量及其应用模式可以通过调节电源来调节。该设备使用前用体积分数为 75%乙醇浸泡 2 h，用生理盐水冲洗，紫外灯照射下过夜灭菌。
1.4   实验方法   
1.4.1   大鼠脂肪来源干细胞的分离、培养   随机选取SD雄性大鼠2只，麻醉后离颈处死，浸没于体积分数为75%乙醇中浸泡10 min，无菌条件下获取大鼠双侧腹股沟处脂肪，剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶摇床消化，200 r/min离心1 h后加入相同体积的完全培养基(高糖DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1%双抗)终止消化，300 r/min离心5 min，去除上清，完全培养基重悬沉淀后使用100目的尼龙网过滤残渣，接种到培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，24 h后观察大部分细胞贴壁并换液，三四天换液1次。培养7-10 d，根据细胞的融合度决定是否传代。
1.4.2   大鼠脂肪来源干细胞的传代   去掉培养基，PBS洗涤1次，以去除培养基中的血清，加入1 mL 0.25%胰酶消化2 min，倒置显微镜下观察到细胞间隙变大、细胞变圆，立即用完全培养基终止消化，吹打混匀，300 r/min离心3 min，弃上清，2 mL完全培养基重悬细胞，轻轻吹打成单细胞悬液，按1∶3的比例传代，当细胞生长融合至70%-80%即可传代。

1.4.3   大鼠脂肪来源干细胞形态学观察及表面抗原鉴定   取第3代脂肪来源干细胞用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×109 L-1。取5个1.5 mL EP管并标记1-5号，分别在EP管中加入100 μL细胞悬液，随后1-4号管各加入1 μL阳性抗体CD29-FITC、CD90-PE-Cy7、阴性抗体CD34-FITC、CD45-FITC，5号管为同型对照组，加入抗体后于4 ℃避光孵育30 min，孵育结束后加入200 μL PBS清洗样品2次，250 r/min离心 5 min，弃去上清，加入400 μL PBS，混匀后上机检测。
1.4.4   成脂诱导   取第3代脂肪来源干细胞经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液并计数，以3×104/cm2的细胞密度接种到6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基并置于CO2培养箱中培养。每隔3 d换液，当细胞融合度达到100%，更换为成脂诱导分化培养基A液，诱导3 d后，更换为成脂诱导分化培养基 B 液，1 d后换回A液继续诱导，A液和B液交替作用，直到出现足量、大小适宜的脂滴，诱导第14天后用油红O染色定性观察体外诱导分化的结果。
1.4.5   成骨诱导   取第3代脂肪来源干细胞经胰蛋白酶消化后以3×104/cm2的细胞密度接种到6孔板，每孔加入2 mL完全培养基并置于培养箱中培养。当细胞融合度达到70%时，将培养基更换为成骨诱导分化完全培养基，诱导2-4周后视细胞形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。
1.4.6   直流电场作用   在前期研究中，课题组已经验证了不同直流电场刺激强度下对人脂肪来源干细胞增殖和活性的影响[8]，并发现100 mV/mm直流电场刺激强度下脂肪来源干细胞的增殖率最高。第3代大鼠脂肪来源干细胞经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，按3×104/cm2的细胞密度接种在2组6孔板中，分为电场刺激组和未刺激组，培养24 h后刺激组给予100 mV/mm直流电场刺激，刺激频率为1 h/d，连续刺激3 d；未刺激组(0 mV/mm)插入电极但未通电。3 d后用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，并调整细胞浓度为1×109 L-1，注射到大鼠皮下。
1.4.7   糖尿病大鼠创面模型的建立及治疗   21只SD大鼠适应性喂养 3 d后，采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(65 mg/kg)的方法建立糖尿病大鼠模型，链脲佐菌素注射后48，72 h及5，7 d ，通过艾科血糖仪测量大鼠尾静脉随机血糖值，以随机血糖值≥16.7 mmol/L  视为糖尿病模型制备成功，糖尿病大鼠模型完成后，所有大鼠均腹腔注射2%戊巴比妥钠(2 mL/kg)麻醉，于背部正中处标记直径为2 cm大小区域，用手术刀及眼科剪造成标记区域全层皮肤缺损，伤口止血。随后将21只大鼠随机分为3组，每组7只，每组大鼠创缘周围6个等距部位皮下分别注射1 mL电场刺激细胞悬液(含1×106个大鼠脂肪来源干细胞)、1 mL正常细胞悬液(含1×106个大鼠脂肪来源干细胞)和等体积PBS。注射后伤口予以无菌包扎固定。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   创面愈合率   创面造模后0，3，7，14 d用相机(佳能，日本)拍摄创面照片，并用Image Pro Plus 6.0软件计算创面面积百分比，创面面积计算公式为：Sn/ S0×100%，S0表示初始创面面积，Sn表示第n天时未愈创面面积，在该实验中，n分别为3，7，14。
1.5.2   创面血流灌注情况   创面造模后第3，7，14天使用激光散斑对比成像仪(LSCI)测量大鼠创面血流灌注情况，该仪器使用随机附带软件系统分析图像，可在计算机显示屏上同步显示测量目标的血流灌注数据图像、强度图和彩色照片，并进行灌注成像的记录、分析、处理和存贮。血流灌注测量值为血流灌注单位(perfusionunit，PU)，血流灌注强度由低到高，颜色则蓝到黄，所有测量由同一位研究者在专用室(恒温恒光)完成。测量前大鼠戊巴比妥钠浅麻醉5 min安静后进行测量，以减轻麻醉应激及呼吸动度干扰结果，激光扫描装置固定于同一位置并平行于创面放置，激光红点对准创面，调整距离为20 cm，采集帧率为5图/s，共计采集30 s，在生成的血流斑点图像上选择2个感兴趣的区域(创面灌注：ROI1，创面周围正常的皮肤灌注：ROI2)。每次测量时，系统计算并记录连续图像中ROI1和ROI2的平均灌注值，再计算血流灌注的比值R(ROI1/ROI2)。
1.5.3   苏木精-伊红染色   创面造模后第3，7，14天分批处死大鼠，每批次每组分别为2，2，3只，采集创面组织在15 min内固定于40 g/L多聚甲醛溶液，24-48 h后石蜡包埋，按说明切成4 μm厚切片后苏木精、伊红染色。染色完成后观察大鼠创面愈合程度和上皮化程度，随后每张切片按照“从上到下、从左往右”顺序随机拍摄 5 个不重复视野，由专业病理科技术人员计数各视野下微血管数量，以每张切片血管计数均值进行统计分析。血管计数原则：管腔内有红细胞可直接计数，管腔内无红细胞，但管壁明显可见内皮细胞，并与周围组织和细胞界限清楚，都应当计为微血管。
1.5.4   免疫组化检测血管内皮生长因子的表达和免疫荧光检测CD31的表达   组织石蜡切片通过血管内皮生长因子(免疫组化，1∶1 000)和CD31 (免疫荧光，1∶1 000)染色，染色后的切片由盲法观察者进行复查。每张切片随机拍摄 5 个不重复视野，观察血管内皮生长因子和CD31的表达并通过 Image J分析计数。
1.6   统计学分析   用SPSS 26.0软件进行统计分析，所有数据均以x±s表示，采用独立样本t检验评价糖尿病大鼠模型差异，创面愈合率、血流灌注等组间差异采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过西南医科大学生物统计学专家审核。

近年来脂肪来源干细胞在创面修复中扮演着越来越重要的角色[9]。已有研究证实，脂肪来源干细胞可以通过旁分泌抑制炎症反应[10-14]、促进血管生成[15-18]、加速上皮化[19-21]、细胞外基质沉积等在难愈性创面修复过程中发挥作用[22]。然而脂肪来源干细胞的临床转化应用需要大量的细胞，现有的细胞体外增殖手段远远达不到临床转化的要求，且干细胞的增殖能力和活性随着传代次数的增加会逐渐减弱。因此研究合适的扩增方式将有助于开发适当的条件以促进干细胞大规模、质量控制的扩增，从而促进其临床转化应用。研究表明体外直流电场能影响到细胞的增殖和凋亡，并且电场参数的不同对增殖影响也表现不一[8，23]。课题组前期研究比较了不同强度的直流电场对人脂肪来源干细胞增殖能力和多向分化特性的影响[8]，证实人脂肪来源干细胞增殖受到外加电场的影响，不同强度的电场作用后其增殖能力存在差异，其中100 mV/mm强度下细胞增殖能力最强。然而直流电场作用后的脂肪来源干细胞对难愈性创面修复的影响目前还不清楚。该研究成功提取并鉴定了大鼠脂肪来源干细胞，通过构建糖尿病大鼠动物模型，探究直流电场作用后的脂肪来源干细胞对糖尿病大鼠难愈性创面愈合的影响，并探索其潜在的机制。

皮肤创面愈合需要经历止血期、炎症期、增殖期和重塑期4个连续的阶段[24-26]，其中主要包括内皮细胞、成纤维细胞增殖、迁移、血管生成以及细胞外基质沉积等几个关键的环节[27]。以糖尿病溃疡为代表的难愈性创面炎症期和增殖期受到影响，导致创面长期不愈。难愈性创面的修复过程中血管生成起着至关重要的作用[28]，新生血管受损以及血流灌注供应不足将直接导致创面延迟愈合或愈合不良[29]。在该研究中，成功获取并鉴定大鼠脂肪来源干细胞：①其具有梭形或者长梭形的形态结构；②具有成脂、成骨的分化能力；③高表达特异性的表面标记物CD29和CD90， 低表达CD34和CD45 [30]。根据前期实验结果选取100 mV/mm的直流电场强度作用于大鼠脂肪来源干细胞 3 d(每天1 h)，余未刺激组大鼠脂肪来源干细胞放入电极不通电，收集细胞观察其对糖尿病大鼠难愈性创面愈合的影响，结果表明与注射PBS组相比，注射脂肪来源干细胞能够加速大鼠创面愈合，并且直流电场刺激脂肪来源干细胞组创面愈合速度明显更快，第14天创面达到了基本愈合。第3，7，14天大鼠创面组织进行苏木精-伊红染色发现，直流电场刺激脂肪来源干细胞组上皮化程度和完整性较其他两组更好，并且创面血管生成数量更多，这可能是其创面愈合较快的原因，表明直流电场作用后的大鼠脂肪来源干细胞对糖尿病难愈性创面的愈合效果优于非刺激的大鼠脂肪来源干细胞，并且可能和其促进创面血管生成增多有关。

血管内皮生长因子作为研究血管生成和成熟过程信号通路最常见的细胞因子，具有强大的促血管修复作用。血管内皮生长因子的表达水平对新生血管的数量具有积极作用， 它和抗体结合后，血管残端基膜溶解，内皮细胞明显增生，从而促进新生血管形成[31-32]，此次研究中，通过免疫组化发现糖尿病大鼠创面组织血管内皮生长因子的表达和新生血管数量在愈合进程相一致，直流电场刺激脂肪来源干细胞组第3，7，14天时血管内皮生长因子的表达最多。有研究报道在难愈性创面中，血管内皮生长因子往往会出现不同程度的下降，如糖尿病相关的难愈性创面常常伴随着血管内皮生长因子产生减少，血管生成和调节出现障碍，血管生成受
损[33-37] 。然而该研究证明直流电场作用后的大鼠脂肪来源干细胞能促进糖尿病难愈性创面血管内皮生长因子的表达增加和血管生成，从而加速愈合，这与发现的创面血管数量增加、创面愈合加快结论是一致的。

除血管生成受影响以外，创面血流灌注不良也是难愈性创面愈合受阻一大原因。难愈性创面长期低灌注可能无法为伤口修复提供足够的营养和相关细胞因子。因此，改善创面血流循环、增加营养灌注对创面愈合至关重要。激光散斑血流对比成像仪常用于描述短期生理实验中的血流动力学变化。该研究发现，治疗第3，7，14天，直流电场刺激脂肪来源干细胞组创面皮肤灌注与正常皮肤灌注的比值均明显高于相同时间点的PBS组，未刺激脂肪间充质干细胞组在第7天时灌注比值明显高于PBS组。直流电场刺激脂肪来源干细胞组在治疗第7天时观察到创面血流灌注最高，基于此，作者推测其原因可能是直流电场刺激脂肪来源干细胞组促进创面新生血管形成、抑制炎症反应。有趣的是，3组都出现了血流灌注先增加到一个峰值后，在创面愈合后期出现不同程度的下降，目前这种现象出现的原因还有待进一步探究。有学者提出创面愈合中的血管生成可分为2个主要阶段：在创面愈合初期的促血管生成阶段和后期抗血管生成阶段。在创面修复早期，新生血管生成增加并随着修复进程达到一个峰值，修复后期伴随着血管成熟，血管新生过程便开始消退[38]，血流灌注则恢复到未受伤前状态。基于此，作者猜测这种现象发生可能与修复后期炎症反应的消退和血管成熟度增加有关。有学者用激光散斑血流对比成像仪对小鼠耳朵伤口周围进行12 d的活体成像，发现微血管密度在炎症初期增加，在组织形成阶段保持升高，创面开始愈合完成后消退，在组织重塑阶段后期恢复到基线水平[39]，与该研究观察到的血流灌注现象是一致的，但血管密度却没有出现相同趋势，这有待进一步探究。

既往研究证明直流电场刺激后的脂肪来源干细胞增殖活性增强[8]，结合以上结果，直流电场刺激后的大鼠脂肪来源干细胞可以促进糖尿病创面愈合进程，其促进创面修复的效率显著高于未刺激的正常大鼠脂肪来源干细胞，其机制可能是电刺激后脂肪来源干细胞增殖活性增加及其在体内的旁分泌功能表现增强，从而促进血管新生和血流灌注有关[9-10，13，15]，这有待于进一步探究证实。该研究对于加快干细胞的临床应用和转化具有重要意义，为体外大量扩增干细胞提供了新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
脂肪来源干细胞：是脂肪来源的干细胞，具有来源丰富、获取方便、免疫排异反应低等优点，可分化成不同细胞群和通过旁分泌相关细胞因子发挥作用。
难愈性创面：指各种原因造成创面愈合缓慢或无法愈合超过1个月，主要包括术后无法愈合的伤口、压力性溃疡、血管性溃疡、糖尿病性溃疡和难愈性烧伤等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

创面治疗是一个需要不断探索的过程，脂肪来源干细胞在促进创面愈合中已被证明是一项有前景的新疗法。然而创面治疗中干细胞需求量大，过程复杂，如何增强脂肪来源干细胞的体外培养，加快其临床实际转化应用的研究较少，提高脂肪来源干细胞在体外的增殖并在实际应用中得到转化对于提高干细胞在创面修复中的应用效果尤为重要。直流电场是一项有效且具有临床转化应用潜力的促进脂肪来源干细胞体外快速扩增的技术，是一种用于诱导细胞增殖的物理方法。然而，直流电场作用后的脂肪来源干细胞对难愈性创面愈合的影响及其潜在机制目前尚未可知。因此，该研究拟从直流电场刺激入手，根据课题前期研究得出促进脂肪来源干细胞增殖的最佳处理方案，观察直流电场刺激的脂肪来源干细胞对糖尿病大鼠难愈性创面愈合的影响，以期为难愈性创面的治疗提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

	阅读次数
	全文
	摘要