表皮生长因子受体对小鼠关节软骨表层细胞增殖、分化、凋亡的影响

doi:10.12307/2023.190

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (11): 1728-1732.doi: 10.12307/2023.190

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表皮生长因子受体对小鼠关节软骨表层细胞增殖、分化、凋亡的影响

朱洲均1，张佳惠1，高健1，续斌1，王超 2，向伟2，贾昊若3，王国胜1

1新疆维吾尔自治区骨科医院，新疆医科大学第六附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；2石河子大学医学院第一附属医院，新疆维吾尔自治区石河子市 832000；3第四军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710000

收稿日期:2022-04-20 接受日期:2022-06-08 出版日期:2023-04-18 发布日期:2022-09-24
通讯作者: 王国胜，硕士，副主任医师，新疆医科大学第六附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000 贾昊若，博士，主治医师，第四军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710000
作者简介:朱洲均，男，1992年生，新疆维吾尔自治区昌吉市人，俄罗斯族，2021年石河子大学毕业，硕士，主要从事骨关节疾病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金项目(81702164)，项目负责人：贾昊若

Effects of epidermal growth factor receptor on proliferation, differentiation and apoptosis of mouse articular cartilage surface cells

Zhu Zhoujun1, Zhang Jiahui1, Gao Jian1, Xu Bin1, Wang Chao2, Xiang Wei2, Jia Haoruo3, Wang Guosheng1

1Orthopaedic Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2The First Affiliated Hospital of Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Department of Orthopedics, Xijing Hospital of Air Force Military Medical University, Xi’an 710000, Shaanxi Province, China

Received:2022-04-20 Accepted:2022-06-08 Online:2023-04-18 Published:2022-09-24
Contact: Wang Guosheng, Master, Associate chief physician, Orthopaedic Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Jia Haoruo, MD, Attending physician, Department of Orthopedics, Xijing Hospital of Air Force Military Medical University, Xi’an 710000, Shaanxi Province, China
About author:Zhu Zhoujun, Master, Orthopaedic Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81702164 (to JHR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
表皮生长因子受体：是一种分子质量为170 kD的跨膜糖蛋白，也被称为HER或ErbB受体家族，表达于大多数细胞膜表面；配体与细胞膜外受体结合后，其构象发生了改变，使得细胞内酪氨酸激酶磷酸化，将信号从细胞外传递到细胞内，调控细胞对外界刺激的反应，从而调节细胞的生长、存活、转化及凋亡等多种生物学活动。
转化生长因子α：是第一个被发现的表皮生长因子家族成员，它包含类表皮生长因子域，与表皮生长因子具有相似的结构和功能，在机体内所有组织细胞中，转化生长因子α首先以前肽的形式合成，并固定在细胞膜上，通过分泌信号激活表皮生长因子受体。

背景：表皮生长因子受体是调节细胞周期的关键因子，其介导的细胞下游信号通路广泛参与调控细胞的多种生物学过程，然而该信号通路对小鼠关节软骨表层细胞的增殖、分化及凋亡的影响有待进一步研究。
目的：分离并培养小鼠关节软骨表层细胞，验证表皮生长因子受体信号通路对小鼠关节软骨表层细胞的增殖、分化及凋亡的影响。
方法：通过纤连蛋白黏附及酶消化法体外分离培养小鼠关节软骨表层细胞并鉴定；取P3细胞分别给予表皮生长因子受体信号通路激动剂转化生长因子α 100 μg/L与抑制剂Gefitinib 10 μmol/L，常规培养基为对照组。通过CCK-8法检测细胞增殖情况同时利用实时荧光定量检测增殖相关基因Ki67的mRNA表达水平；肿瘤坏死因子α(25 μg/L)诱导细胞凋亡，AOEB染色鉴定凋亡情况，实时荧光定量PCR检测抑制凋亡基因Bcl-2与促进凋亡基因Bax的mRNA表达水平；对各组细胞进行成软骨、成骨、成脂连续诱导14-21 d，利用实时荧光定量PCR检测软骨相关基因Sox9、成骨相关基因Runx2、脂肪相关基因脂蛋白脂肪酶的mRNA表达水平。
结果与结论：①体外分离培养小鼠关节软骨表层细胞，形态偏长，免疫荧光鉴定阳性表达Prg4；②CCK-8检测结果提示转化生长因子α组细胞增殖能力明显增强，而Ki67 mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)；③AOEB染色结果提示转化生长因子α组细胞凋亡水平降低，Bcl-2 mRNA表达水平显著升高，Bax mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)；④诱导三系分化实时荧光定量PCR结果显示，转化生长因子α组Runx2 mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)，而Sox9的mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)；⑤结果表明，表皮生长因子受体信号通路参与关节软骨表层细胞的增殖、分化及凋亡，转化生长因子α介导表皮生长因子受体促进关节软骨表层细胞增殖及成骨分化，抑制其向成软骨分化及凋亡。

https://orcid.org/0000-0001-9624-8243(朱洲均)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 关节软骨表层细胞, 表皮生长因子受体, 转化生长因子α, 增殖, 分化, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Epidermal growth factor receptor is a key factor regulating the cell cycle and its downstream signaling pathway is widely involved in the regulation of various biological processes of cells.
OBJECTIVE: To isolate and culture articular cartilage surface cells from mice and to verify the effect of epidermal growth factor receptor signaling pathway on the proliferation, differentiation and apoptosis of articular cartilage surface cells.
METHODS: Articular cartilage surface cells from mice were isolated and cultured in vitro by fibronectin adhesion and enzyme digestion and identified. Passage 3 cells were separately treated with transforming growth factor α (100 μg/L), Gefitinib (10 μmol/L), and conventional medium (control group). Cell proliferation was detected by cell counting kit-8 and Ki67 gene expression was detected by RT-PCR. Cell apoptosis was induced by transforming growth factor α (25 μg/L) and AOEB staining was used to identify the apoptosis. RT-PCR was used to detect the expression of Bcl2 and Bax genes. Chondrogenic, osteogenic, and adipogenic induction were conducted for 14-21 days in each group and the mRNA expressions of Sox9, Runx2, and lipoprotein lipase were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Articular cartilage surface cells isolated and cultured in vitro were long-shaped and positively expressed PRG4 identified by immunofluorescence. Cell counting kit-8 results showed that after treatment with transforming growth factor α, cell proliferation ability and the mRNA level of Ki67 were significantly increased (P < 0.05). AOEB staining results showed that after treatment with transforming growth factor α, the apoptotic level was significantly decreased, the mRNA level of Bcl2 was significantly increased (P < 0.05), and the mRNA level of Bax was significantly decreased (P < 0.05). RT-PCR results revealed that the mRNA level of Runx2 was significantly increased (P < 0.05) and the mRNA level of Sox9 was significantly decreased after treatment with transforming growth factor α. To conclude, the epidermal growth factor receptor signaling pathway is involved in the proliferation, differentiation, and apoptosis of articular surface chondrocytes. Epidermal growth factor receptor mediated by transforming growth factor α can promote the proliferation and osteogenic differentiation of articular cartilage surface cells and inhibit the chondrogenic differentiation and apoptosis of articular cartilage surface cells.

Key words: osteoarthritis, articular cartilage surface cell, epidermal growth factor receptor, Transforming growth factor α, proliferation, differentiation, apoptosis

中图分类号:

朱洲均, 张佳惠, 高健, 续斌, 王超, 向伟, 贾昊若, 王国胜. 表皮生长因子受体对小鼠关节软骨表层细胞增殖、分化、凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(11): 1728-1732.

Zhu Zhoujun, Zhang Jiahui, Gao Jian, Xu Bin, Wang Chao, Xiang Wei, Jia Haoruo, Wang Guosheng. Effects of epidermal growth factor receptor on proliferation, differentiation and apoptosis of mouse articular cartilage surface cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(11): 1728-1732.

图/表（结果） 4

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引言

骨关节炎是最常见的肌肉骨骼系统疾病，影响全球10%-12%的人口[1]，其最早的变化包括组织纤维性颤动和关节软骨表面的机械完整性减弱，对于晚期骨关节炎则以关节周围组织的病理改变为特征。在软骨衰老过程中，表层细胞是最先消失的细胞[2-4]，众所周知，关节软骨包含几个具有独特结构、组成和生物力学特性的区域[5-6]。2004年有研究发现在关节软骨表浅区细胞体外培养可形成群落，因此被认为是软骨祖细胞[7]。另有研究表明，在幼年C57小鼠的关节软骨形成中，关节软骨表面的细胞是自我更新的软骨祖细胞即关节软骨表层细胞(articular cartilage surface cells，ACSC)并表达特定的信号分子[8]，包括蛋白多糖4、骨形态发生蛋白、转化生长因子家族及其受体和调制器[9-10]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)属于酪氨酸激酶受体家族，该家族还包含ErbB2、ErbB3和ErbB4，其配体包括表皮生长因子、双调蛋白和转化生长因子α且只与表皮生长因子受体结合，多篇研究表明该信号通路参与调解关节软骨细胞、表层细胞及其细胞外基质的合成与分解代谢[10-16]。有研究表明EGFR信号通路是一种重要的骨组织细胞调节因子，主要在骨组织代谢中起着合成代谢的作用，该研究证明小鼠表皮生长因子受体活性缺失改变了软骨生长板的发育，损害了软骨细胞成活，延缓了软骨内成骨[17-18]；另有研究通过EGFR基因敲除的骨关节炎小鼠模型发现，pEGFR激活EGFR信号通路可能会导致关节软骨的破坏即EGFR信号可能参与了调节软骨细胞外基质的合成和降解并影响着骨关节炎的进展[13]。近年来对于软骨缺损修复及软骨细胞生物学特性的研究受到了越来越多人的关注，此实验拟通过酶消化及纤连蛋白黏附法获取小鼠ACSC，通过EGFR信号通路激动剂转化生长因子α与抑制剂Gefitinib分析该信号通路对ACSC增殖、分化、凋亡的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞实验，组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年6月在石河子大学医学院第一附属医院骨科实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 C57BL/6小鼠购买自新疆医科大学实验管理中心，均为出生3-5 d幼鼠，雄性5只，体质量20-25 g；雌性10只，体质量18-23 g；经石河子大学医学院第一附属医院实验动物管理委员会批准饲养于该实验动物中心，批准号：A2019-173-01。1只雄鼠，2只雌鼠饲养于1个笼中进行繁殖，严格执行实验动物使用标准程序。实验方案经石河子大学医学院第一附属医院动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验试剂与仪器 DMEM系列、胎牛血清、青-链霉素联合抗生素、PBS、0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶(均购自Gibco公司，美国)；ITS、Cell Counting Kit8、prg4抗体(均购自Sigma公司，美国)；IBMX、地塞米松、丙酮酸钠、抗坏血酸、转化生长因子β、β-甘油磷酸钠、胰岛素、吲哚美辛(均购自APExBIO公司，美国)；荧光倒置相差显微镜(Olympus，日本)；CO2恒温恒湿细胞培养箱HF240型(力康Heal Force公司)；高速离心机TGL-16R(珠江黑马公司)；Step One RT-PCR仪(Appliped Biosystems公司，美国)；酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司，中国]；核酸蛋白测定仪(Eppendorf 公司，德国)；Trizol(Life-invitroge公司，美国)；反转录试剂盒(Thermo公司，美国)；实时荧光定量试剂盒(Qiagen公司，德国)；Gefitinib(APExBIO公司，美国)；转化生长因子α(Abcam公司，美国)。
1.4 方法
1.4.1 小鼠ACSC的分离培养及鉴定取3-5 d C57BL/6幼鼠，实施低温安乐死，取幼鼠膝关节软骨，体积分数75%乙醇浸泡消毒2.0-3.0 min，灭菌眼科剪镊剥离膝关节至看见透明软骨并剪碎，0.25%胰蛋白酶消化1 h，终止消化，离心，弃培养基，PBS冲洗后Ⅰ型胶原酶消化1.5-2.0 h，终止消化，细胞滤网过滤，并计数重悬细胞，按50×104细胞接种于已提前预孵0.1%纤连蛋白的100 mm培养皿中，37 ℃含体积分数5%的CO2细胞培养箱孵育过夜，次日换液。

鉴定：取出生长状态良好且生长至80%-90%的细胞，6孔板铺板培养细胞(1×106个/孔)生长至80%左右，取6孔板用体积分数95%乙醇固定20 min，PBS冲洗后加入0.2%Triton-100室温下10 min，PBS冲洗3次，加入PBS-BSA室温封闭5 min，PBS冲洗，加入Prg4抗体4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，加入PBS-BSA室温封闭15 min，PBS漂洗，加入荧光素标记的二抗(1∶1 000)，室温避光30 min，PBS漂洗，荧光显微镜下观察并取相。

1.4.2 ACSC增殖取生长状态良好的ACSC以每孔3 000个细胞接种于96孔板内，分别给予转化生长因子α(100 μg/L)、Gefitinib(10 μmol/L)，含体积分数10%胎牛血清完全培养基为对照组，每组4副孔，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育6-12 h，待细胞贴壁。遵照CCK-8试剂盒说明书进行操作，全程避光，分别测0，12，24，48，72 h时细胞增殖趋势。使用酶联检测仪450 nm下按照时间设置在各时间点进行吸光度(A)测量，根据副孔计算吸光度平均值；利用Graphpad Prism 8.0软件进行细胞增殖趋势分析；RT-PCR检测增殖相关基因Ki67。
1.4.3 肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡取生长状态良好的ACSC以1×104个/孔接种于12孔板内，孵育24 h，培养基更换为无血清的普通培养基，孵育24 h，进行分组：阴性对照组为普通培养基，阳性对照组为肿瘤坏死因子α(25 μg/L)，激动剂组为肿瘤坏死因子α(25 μg/L)+转化生长因子α(100 μg/L)，抑制剂组为肿瘤坏死因子α(25 μg/L)+Gefitinib(10 μmol/L)培养48 h。PBS冲洗孔板，加入100 μL染色缓冲液和5 μL AO与5 μL EB染色液，混匀。4 ℃避光20 min，PBS冲洗1次。荧光显微镜下观察取相；RT-PCR检测凋亡相关基因，Bcl-2为抑制凋亡基因，Bax为促进凋亡基因。
1.4.4 成软骨、成骨、成脂肪诱导及检测取生长状态良好的ACSC以2×105密度分别接种于3个6孔板内，用含体积分数10%胎牛血清普通培养基培养，待细胞长至40%以上时，将普通培养基分别更换为成软骨诱导液(低糖DMEM、体积分数10%胎牛血清、1%青-链霉素、1%ITS、地塞米松10-7 mol/L、丙酮酸钠1 mmol/L、抗坏血酸50 mg/L、转化生长因子β1 50 μg/L)、成骨诱导液(DMEM、体积分数10%胎牛血清、1%青-链霉素、地塞米松10-7 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸50 mg/L)、成脂诱导液(低糖DMEM、10%胎牛血清、1%青-链霉素、地塞米松1 μmol/L、IBMX 0.5 mmolo/L、胰岛素10 mg/L、吲哚美辛100 mg/L)，进行分组，分别给予转化生长因子α(100 μg/L)/Gefitinib(10 μmol/L)，对照组为各诱导培养基，每组1个副孔，每隔2 d换液1次，连续培养14-21 d；实时荧光定量PCR检测成脂相关基因脂蛋白脂肪酶、成骨相关基因Runx2、成软骨相关基因Sox9。
1.4.5 实时荧光定量PCR 在进行增殖/分化及凋亡实验的同时取P2代细胞以2×105密度分别接种于6孔板内，待细胞贴壁，给予分组处理同上；利用Trizol法提取细胞RNA，根据反转录试剂盒操作步骤反转录为cDNA，以β-actin为内参，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成(引物序列见表1)，反应条件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 cycles。最后以2-ΔΔCt表示，利用Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析。

1.5 主要观察指标 ①ACSC细胞形态，免疫荧光鉴定结果；②CCK-8检测ACSC增殖能力；③AOEB染色检测ACSC凋亡情况；④实时荧光定量PCR检测ACSC的Ki67、Bcl-2/Bax、Sox9、Runx2、脂蛋白脂肪酶等基因mRNA表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件及Graphpad Prism 8.0进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经石河子大学医学院生物统计学专家审核。

讨论

骨关节炎是一种由多因素引起的关节软骨退变，虽然关节软骨所固有的自我修复能力较低，但近期有研究者发现关节软骨与诸多的其他组织一样，也含有类干细胞群，并在维持关节软骨稳态中起到了重要的作用，这些细胞被称为软骨源性干/祖细胞[19]。研究发现小鼠关节软骨更新发生于出生后早期，所有胚胎期关节软骨细胞都被新生软骨细胞替代[8]；CANDELA等[20]研究者也发现关节软骨最表层是软骨祖细胞聚集区域。由此可以推测出存在于已分化软骨组织中的ACSC是一种可通过自我更新以维持细胞数量并具有一定单向分化能力的细胞群。表皮生长因子受体及其配体参与骨组织代谢，尤其在调节关节软骨各部位细胞的生物学过程中发挥着不可或缺的作用[21]，同时CHANDRA等[22]发现表皮生长因子受体及其配体可以影响并促进骨髓间充质干细胞的生物学过程，作者所在课题组前期建立了EGFR条件性敲除小鼠，证实了磷酸化的EGFR主要集中在小鼠关节软骨表层，EGFR信号通路在维持表层关节软骨功能及机械力学属性中起到至关重要的作用。
3.1 ACSC增殖作者根据JIA等[12]的方法，利用Ⅰ型胶原酶联合纤连蛋白黏附法体外分离培养小鼠ACSC，其特异性表达Prg4[23]，此次研究显示阳性表达Prg4。关节软骨的稳态维持得益于ACSC和软骨全层细胞自我更新能力及数量充足[24]，关节软骨的生长在一定程度上受软骨表层细胞及以下细胞进入和退出细胞周期的调节，Ki67是细胞周期活跃期的标志[25]，CCK-8实验结果显示转化生长因子α可介导EGFR信号通路促进ACSC数量的增加，PCR结果显示转化生长因子α组高表达Ki67，这在基因层面进一步提示转化生长因子α介导EGFR可促进ACSC增殖。
3.2 ACSC凋亡细胞凋亡在每个生物体的成长及发育和各种生理病理的发生发展中扮演着重要的角色[25]，骨关节炎主要特点是软骨退变，而软骨退变则是以软骨细胞数目减少或凋亡为主，ACSC位于软骨最表层并成为进入软骨层的第一道防御屏障[26]，因此，延缓ACSC凋亡可间接调控关节软骨的退变。结果显示转化生长因子α通过EGFR信号通路抑制ACSC凋亡，RT-PCR检测结果显示经转化生长因子α预处理的细胞Bcl-2 mRNA表达水平最高，而经Gefinitib预处理的细胞Bax mRNA表达水平最高，与AOEB染色结果一致，提示转化生长因子α通过介导EGFR信号抑制ACSC凋亡，进一步证明了EGFR信号激活或缺失可影响ACSC生物学过程进而调控关节软骨的稳态。
3.3 ACSC分化根据JIANG等[25]的研究，作者配置出成脂肪分化诱导液、成骨分化诱导液及成软骨分化诱导液。脂蛋白脂肪酶编码产物是脂肪代谢过程中的关键酶，是脂肪细胞早期分化的标志[27-28]；成骨分化相关的转录因子是核心蛋白基因(Runx2) [29]，Sox9基因具有转录因子的典型结构，主要在软骨细胞中表达[30]。早前有研究证明，利用mig-6敲除小鼠验证EGFR信号参与关节软骨发育及软骨细胞多种生物学过程，是一个非直接的途径[31-32]，由于mig-6对于EGFR信号并不敏感，故由此推论并不是很可靠。此次研究结果显示转化生长因子α通过介导EGFR信号抑制成软骨分化，促进成骨分化。

综上所述，EGFR信号通路参与ACSC的增殖、分化及凋亡，转化生长因子α介导EGFR促进ACSC增殖及成骨分化，抑制其向成软骨分化及凋亡；以ACSC为种子细胞，以关节软骨表层为靶点的转化生长因子α介导EGFR信号相关生物制剂可被考虑作为治疗早期骨关节炎的新方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

表皮生长因子受体对小鼠关节软骨表层细胞增殖、分化、凋亡的影响

Effects of epidermal growth factor receptor on proliferation, differentiation and apoptosis of mouse articular cartilage surface cells

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