2.1   筛选H2O2诱导神经元衰老的合适的条件   通过检测β-半乳糖苷酶活性及细胞的存活率来筛选诱导神经元衰老的合适的条件，见图1。结果显示，β-半乳糖苷酶的阳性率随着H2O2浓度的增加及诱导时间的增长呈现上升趋势，其中在10 μmol/L-2 h的条件下显著上升，见图1A，C。神经元细胞不具备增殖功能，H2O2刺激后，细胞存活率出现明显下调趋势，其中10 μmol/L-2 h的条件可使细胞的存活率达到66%，之后的条件下细胞的存活率越来越低，见图1B，D。统计分析结果显示，与0 μmol/L-0 h组相比，神经元的细胞纯度从10 μmol/L-2 h组开始出现下降的趋势，此后随着诱导条件的变化细胞纯度持续降低，见图1B，E。综上结果认为10 μmol/L-2 h为诱导衰老的合适条件。但是，一种衰老标志物不足以证明10 μmol/L-2 h的H2O2可以成功诱导神经元衰老，因此为检测该诱导条件的稳定性，需要通过以下研究进一步验证。



2.2   10 μmol/L的H2O2刺激细胞2 h后自噬受体SQSTM1/p62的表达量下降   SQSTM1/p62是一种自噬相关受体，研究发现衰老会引发自噬功能的缺陷，这与SQSTM1/p62蛋白水平的降低有关[26]。因此在此将SQSTM1/p62的表达作为检测细胞衰老的标志物。通过对体外培养的细胞进行免疫荧光染色发现，经过10 μmol/L-2 h的H2O2刺激后，细胞SQSTM1/p62的荧光强度具有明显的下降趋势，与作为对照的0 μmol/L-0 h组比较差异有显著性意义(aP < 0.01)，见图2A，B。细胞培养结束后，经过提取总蛋白进行Western blot进一步检测SQSTM1/p62的表达变化，结果显示， 10 μmol/L-2 h组的SQSTM1/p62蛋白水平明显降低，且与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2C，D。




2.3   10 μmol/L的H2O2刺激细胞2 h后活性氧的表达量上调    众所周知，活性氧主要产生于线粒体中，细胞衰老往往伴随着线粒体功能障碍以及活性氧产生的增加[27]。因此细胞中活性氧的水平也可作为检测细胞衰老的标准。在体外培养的细胞中加入10 μmol/L H2O2刺激细胞2 h后继续培养3 d，使用活性氧检测试剂盒对细胞中的活性氧水平进行测定，染色结果显示10 μmol/L-2 h组中DCFH-DA的荧光强度明显升高，见图3A，统计分析结果显示两组的荧光强度差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3B。基于DCFH-DA的荧光强度代表细胞中活性氧水平的原理，表明经过10 μmol/L-2 h H2O2刺激后的细胞活性氧产生显著增多。



2.4    10 μmol/L的H2O2刺激细胞2 h后轴突生长能力明显变弱    随着寿命的延长，线粒体功能发生障碍，神经元可塑性受损，因此轴突的生长能力是检测神经元衰老的特异性标准[28]。在10 μmol/L的H2O2刺激细胞2 h后继续培养3 d，通过免疫荧光染色标记Tuj-1并测量轴突长度发现，0 μmol/L-0 h组的神经元轴突长度的平均值达到400 μm左右，而10 μmol/L-2 h组的只能达到100 μm左右，两组轴突长度差异有显著性意义(aP < 0.001)，见图4A-D。

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在众多与衰老相关的疾病中，神经退行性疾病是严重威胁全球人类健康的重大疾病，其中非常具有代表性的阿尔茨海默症、帕金森病通常发生于老年群体中，且发病率随着年龄呈指数增长[1]。神经元的衰老是神经退行性疾病发生的潜在重要贡献者，针对衰老神经元的研究及靶向治疗为治愈疾病带来了希望[2-3]。然而神经系统作为机体内起主导作用的重要系统，发生功能障碍的原因非常复杂。目前已有的基因疗法、细胞疗法、药物治疗虽然具有潜在的治疗作用，但达到治愈疾病的目的还要做非常多的临床前实验工作[2，4-8]。

为了加快对神经元衰老相关疾病的研究进展，迫切需要寻求一种方式来快速得到大量的衰老神经元用于科学研究。尽管目前已有无脊椎动物衰老模型、基因敲除动物模型、小鼠疾病模型等多种实验动物模型应用到研究工作中，但基于神经元不增殖、难获取的特征，体外细胞衰老模型的建立仍然不成熟[9-12]。小鼠的大脑皮质神经元、海马神经元对于衰老的研究具有重要价值[13-14]，但通常只能从胎鼠中提取进行体外培养[15-18]。背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)处于将所有的躯体感觉信号传递到大脑的重要位置，具有容易从胚胎和成年动物中分离出来的优势，神经元的轴突在体外培养3 d内便可成功延伸，且常被用于体细胞和轴突的退行性机制的研究[19-21]，因此背根神经节神经元是用于尝试建立体外衰老模型的优秀选择。

与动物模型相比，细胞衰老模型或许可以更直观地展现神经元衰老的机制以及更精准判断靶向治疗的效果，且降低了某些实验的复杂性，因此实验尝试通过体外诱导的方式快速获取衰老神经元。该体外衰老模型的成功建立将为深入探究神经元衰老的机制提供帮助，且能为筛选对抗衰老的新药物的前期工作提供非常大的便利。

过氧化氢(H2O2)本身是一种细胞内线粒体呼吸和超氧化物歧化酶的稳定副产物，正常情况下会被H2O2酶分解代谢来维持细胞的生理平衡[22]。而有研究证明过高的H2O2会破坏线粒体的功能从而对细胞的健康状态造成威胁。目前已有越来越多的研究将H2O2成功应用到建立各种细胞衰老模型中，这或许得益于H2O2的快速诱导性、结果稳定性以及高效性等优势[23-25]。但对于H2O2的浓度和诱导时间选择大相径庭，这或许与细胞的耐受力不同有关。基于以上特征，作者决定选择使用H2O2来进行体外诱导背根神经节神经元衰老实验，探索合适的诱导条件并通过检测相关的衰老指标来确认所获得的细胞为衰老的背根神经节神经元，从而建立一种快速有效且稳定的背根神经节神经元的体外衰老模型。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学实验观察。设置H2O2诱导细胞衰老的浓度和时间范围，检测多种衰老标志物，建立神经元的体外衰老模型。多组之间比较采用One-way ANOVA，两组之间比较采用t-test检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年6月至2021年11月在苏州大学医学部骨科研究所神经再生实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   采用1月龄的ICR小鼠，SPF级，雌雄不限，体质量12-15 g，饲养于苏州大学动物中心，SYXK(苏)2017-0043。所有动物实验均遵守苏州大学动物伦理与使用委员会批准的实验方案进行处理。
1.3.2   实验试剂   MEM培养基(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS，Gibco 公司，美国)；5- 氟-2’- 脱氧尿苷、尿苷、青霉素 / 链霉素、多聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、Tuj-1抗体均为Sigma-Aldrich公司(美国)产品；胶原酶A(Roche公司，美国)；胰酶(Life Technology公司，美国)；H2O2(南国药业公司，中国)；β-半乳糖苷酶检测试剂盒(碧云天公司，中国)；神经元特异性核蛋白(NeuN)抗体、SQSTM1/p62抗体、抗兔 IgG抗体均为CST公司(美国)产品；线粒体红色荧光探针、活性氧检测试剂盒均为碧云天公司(中国)产品；多聚甲醛(阿拉丁公司，中国)。
1.3.3   实验仪器   万向显微镜(欧米特公司，中国)；正置显微镜、倒置显微镜均为Zeiss公司(德国)生产；冰冻切片机(Leica公司，德国)；凝胶成像仪(Bio-Rad公司，美国)；全波长酶标仪(Biotek Instruments公司，美国)；细胞培养箱、高速离心机均为Thermo Fisher Scientific公司(美国)生产。
1.4   实验方法   
1.4.1   层粘连蛋白铺板   在超净台中，将无菌圆形玻片铺到24孔板内，紫外照射30 min，而后将多聚-D-赖氨酸(100 mg/L)和层粘连蛋白(10 mg/L)混合后，滴到圆玻片上，放于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中至少2 h，然后吸去混合物，用无菌的1×PBS洗涤3遍后备用。
1.4.2   背根神经节组织的提取   通过腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和噻拉嗪(10 mg/kg)的混合物将小鼠麻醉后，使用颈椎脱臼法快速处死小鼠，用高压灭菌后的剪刀去除皮毛、内脏、四肢等组织器官，留下完整的脊柱，用1×PBS冲洗掉残留的毛发和血，而后放入体积分数75%的乙醇中浸泡1 min进行表面消毒。消毒后，将脊柱固定在操作台上，于显微镜下从腹侧剪开椎体，剔除椎间盘，暴露背根神经节，用显微剪剪断相连的神经纤维和周围粘连组织，完整取下背根神经节放于装有MEM培养基的1.5 mL EP管中。
1.4.3   背根神经节细胞体外培养   取材完毕后，吸掉MEM培养基，加入1 mL胶原酶A，于37 ℃ 金属浴中消化90 min，然后吸去胶原酶A，换成400 μL胰酶继续消化15 min。待消化结束后，于超净台中吸掉胰酶，加入1 mL含体积分数10% FBS的MEM培养基，重复洗涤3次终止消化。用1.0 mL的移液枪轻轻吹打背根神经节直到直视看不见明显的组织块为止，然后将吹散的细胞高速离心(700 r/min，6 min)。结束离心后，去除上层培养基，加入含体积分数5% FBS的MEM培养基，将细胞沉淀轻轻吹起与培养基混匀，按所需密度将细胞种植于已准备好的24孔板中，并放于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。

1.4.4   体外H2O2刺激细胞   用含体积分数5% FBS的MEM培养基将H2O2稀释成10，20，50 μmol/L浓度后放于超净台中备用。按照每孔1.5个背根神经节的密度将细胞种植于24孔板中，每孔加入500 μL含体积分数5% FBS的MEM培养基。待大约4 h后细胞基本完全贴附，将细胞从培养箱转移到超净台中，吸掉孔板中的培养基，按照0 μmol/L-0 h，10 μmol/L-1 h，10 μmol/L-2 h，20 μmol/L-1 h，20 μmol/L-2 h，50 μmol/L-1 h的诱导条件每孔分别加入500 μL含H2O2的体积分数5% FBS MEM培养基刺激细胞，放于细胞培养箱中继续培养，待达到所设定的刺激时间后，吸掉培养基，用无菌的1×PBS洗涤3次，避免H2O2残留，重新加入500 μL含体积分数5%FBS的MEM培养基，放于培养箱中继续培养3 d。待细胞培养结束后进行以下实验。
1.4.5   检测衰老标志物β-半乳糖苷酶的活性   待上述1.4.4的条件H2O2刺激细胞并培养3 d后，吸掉培养基，用1×PBS洗涤1次，每孔加入500 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温条件下固定15 min。按照试剂盒说明书中的比例配置好工作液。固定结束后，用1×PBS洗涤细胞3次，每次3 min，去除残留的固定液。然后每孔加入500 μL染色工作液，用封口膜封住孔板并放于不含CO2的37 ℃ 保温箱中过夜，待染色结束后，去除工作液，加入1×PBS于倒置显微镜下观察，若不能及时观察则可于4 ℃ 保存数天。经筛选得出10 μmol/L的H2O2刺激细胞2 h(10 μmol/L-2 h)可作为合适的细胞衰老诱导条件，后续实验均用10 μmol/L-2 h进行细胞刺激培养，以0 μmol/L-0 h组为对照。
1.4.6   通过免疫荧光染色检测SQSTM1/p62的表达变化   待细胞培养结束后，吸去培养基，加入40 g/L 多聚甲醛(4% PFA)固定细胞15-20 min。固定结束后，用1×PBS洗涤细胞3次避免固定液残留。而后在常温下用含有0.1% Triton X-100 的2% BSA封闭细胞1 h。在封闭结束前，将目标一抗用封闭液按1∶1 000的比例稀释备用。封闭结束后，室温下孵育一抗90 min。一抗孵育结束经1×PBS洗涤细胞3次后，用对应属性的二抗在常温下避光孵育1 h。用1×PBS洗涤细胞3次，经防荧光猝灭封片剂封固后于显微镜下观察。若需要同时孵育两种不同属性的抗体，则在第1种抗体孵育结束后重新进行封闭，再重复以上过程。
1.4.7   SQSTM1/p62的蛋白质免疫印迹   待细胞培养结束后，吸掉孔板中的培养基，加入适量体积的含有1% 蛋白酶抑制剂和1% 磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，充分研磨后转移到1.5 mL EP管中冰浴30 min，然后进行高速离心(4 ℃，10 000 r/min，  10 min)。离心结束后，弃沉淀转移上清至干净的EP管中，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行浓度测定。在每组上清液中加入1/4体积的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，放于100 ℃ 的金属浴中5 min使蛋白变性，而后将制备的蛋白样品放于-80 ℃ 冰箱中保存。按照目标蛋白的大小提前制备好特定浓度的SDS-PAGE电泳凝胶，装置好电泳槽后将蛋白样品按等质量的要求逐孔上样，两侧的孔中均加入适量的蛋白分子量标准品，于80 V恒压条件下浓缩蛋白样品，而后换成110 V恒压直至电泳结束。然后在250 mA恒流的条件下将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后，将含有目标蛋白的硝酸纤维素膜完全浸润在用1×TBS稀释的5% 脱脂奶粉中，于室温下封闭1 h。用封闭液将SQSTM1/p62和GAPDH蛋白的一抗按照1∶1 000的比例稀释后，于4 ℃条件下孵育过夜。洗涤去除残留的一抗后，按照1∶1 000的比例稀释对应属性的二抗，于室温条件下孵育1 h。将结合抗体后的硝酸纤维素膜在凝胶成像仪中显影后用Image Lab软件进行灰度值分析。
1.4.8   活性氧水平的检测   使用碧云天活性氧检测试剂盒对神经元中活性氧水平进行检测。首先原位装载探针，将DCFH-DA用MEM培养基按照1∶1 000的比例进行稀释，使最终浓度为10 μmol/L。待细胞培养结束，去除孔板中的培养基，加入适当体积的DCFH-DA，以充分覆盖住细胞为宜，放入37 ℃ 细胞培养箱内孵育20-30 min，然后吸去孵育液，用MEM培养基洗涤3次，以充分去除未进入细胞的残余的DCFH-DA。然后放到显微镜下直接观察。在染色结束后，可以将细胞固定，进行其他探针的染色或免疫荧光染色。
1.4.9   NeuN染色计算神经元的存活率及细胞纯度   待细胞培养结束后，进行免疫荧光染色标记神经元胞核(NeuN)，并孵育DAPI标记所有的细胞核，每个诱导条件的细胞爬片均按“S”型走向拍摄10个视野，而后用ImageJ软件对NeuN阳性细胞及所有的细胞核进行计数，10个视野的NeuN阳性细胞总数代表该诱导条件的细胞活率；NeuN阳性细胞数与所有的细胞核数的比值代表神经元的细胞纯度。每组实验均需进行3次独立重复实验。图例中的“n”则代表独立重复实验的次数。
1.4.10  Tuj-1染色测量轴突长度  细胞培养结束后，吸去培养基加入4% PFA将细胞固定，进行免疫荧光染色标记Tuj-1。用AxioVision软件完成轴突长度的测量。对所有测量的神经元的选择标准为轴突长度需超过胞体直径的2倍，且选择每个神经元中最长的轴突进行手动追踪。每组随机测量100个神经元的轴突并进行3次独立重复实验。图例中的“n”表示独立实验的次数。
1.5   主要观察指标   ①不同的H2O2诱导条件下神经元的β-半乳糖苷酶活性和存活率；②细胞衰老的标志物SQSTM1/p62的蛋白表达；③H2O2刺激细胞后活性氧的表达量及轴突的生长能力。
1.6   统计学分析   所有数据都以x±s的形式表示，使用Graphpad Prism软件进行统计分析，使用One-way ANOVA检验进行多组之间的比较，用t-test来确定两组之间的统计学差异。当3次独立实验的P < 0.05时，表示组间差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过赛吉拉夫教授审核。

在此次研究的预实验中，首先参考其他细胞的体外衰老模型中使用的H2O2条件来刺激背根神经节神经元[29-31]，但实验结果发现，H2O2浓度过高或诱导时间过长会导致培养板中的神经元几乎全部死亡。因此经过调整，将H2O2的诱导条件设置为了0 μmol/L-0 h，10 μmol/L-1 h，10 μmol/L-2 h，20 μmol/L-1 h，20 μmol/L-2 h，50 μmol/L-1 h，通过检测β-半乳糖苷酶的活性以及细胞存活率，发现10 μmol/L-2 h的H2O2使神经元呈现出β-半乳糖苷酶高活性，并且大部分神经元的存活率得到维持，此外细胞的纯度仅与0 μmol/L-0 h组具有微弱的统计学差异。尽管更高浓度的H2O2还能再提高β-半乳糖苷酶的活性，但神经元的存活率大幅度下降，且细胞纯度也随之下降。

此后作者又通过检测神经元中的自噬受体SQSTM1/p62的表达水平、活性氧的活性以及神经元的轴突生长能力等多种衰老指标来进一步验证10 μmol/L-2 h的H2O2可以成功诱导神经元衰老。实验结果显示，在10 μmol/L-2 h的H2O2刺激下，神经元中SQSTM1/p62的表达量明显下降，活性氧活性明显升高，神经元的轴突生长能力显著变弱。实验结果说明10 μmol/L-2 h的H2O2引发了神经元中的线粒体功能障碍，从而产生了更多的活性氧。这与神经元的衰老特征相一致[27，32-33]。正常的细胞可以通过自噬过程来清除功能受损的线粒体，从而帮助恢复活性氧水平。在10 μmol/L-2 h的H2O2刺激下，SQSTM1/p62的蛋白水平降低说明神经元发生自噬缺陷。功能障碍的线粒体在神经元中累积无法为轴突的生长提供足够的能量[34]，因此神经元的轴突生长受到影响。这些衰老相关指标的变化说明10 μmol/L-2 h的H2O2可以成功诱导神经元衰老。

虽然通过以上实验成功得到了体外快速衰老的神经元，但H2O2对神经元存活率的影响令人感到意外。从实验结果可以看出，10 μmol/L-1 h的H2O2已经对神经元的存活率有影响，当条件达到10 μmol/L-2 h时，神经元的存活率继续降低，这无疑对体外培养的神经元具有一定的损耗性。结合β-半乳糖苷酶染色结果综合分析，只能说明10 μmol/L-2 h是相对合适的诱导条件，但绝不是最佳条件。在未来对实验方法的改进中，或许可以尝试延长H2O2刺激前神经元的培养时间，使神经元更加适应体外培养的环境进而状态更加稳定[35]。此外，细胞纯度的统计分析结果或许可以进一步说明神经元对H2O2的刺激性比较敏感，而背根神经节中除神经元之外的其他细胞对H2O2的耐受性更高。通过体外诱导的方式可以快速得到神经元的衰老模型，但与体内复杂的衰老机制相比，细胞模型是否具有完全的替代性还不明确。该细胞衰老模型能精确对应多少月龄的自然衰老的神经元，以及是否能够模拟机体内神经元的衰老模式，未来还需要做大量的研究工作来证明。

综上所述，在体外通过10 μmol/L-2 h的H2O2诱导成功得到了衰老的神经元，但该衰老模型还需要进一步完善。该模型具有高效性、稳定性，为衰老神经元的获取节省了大量的人力、物力和时间，并且为未来更深入地挖掘神经元衰老的机制，评估不同类型细胞的衰老行为，以及探索与神经元衰老相关疾病的治疗方法提供了重要的实验材料。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)：是一种水解酶，催化β-半乳糖苷水解成单糖。使β-半乳糖苷酶作用的底物包括神经节苷脂GM1、乳糖苷、乳糖、各种糖蛋白。β-半乳糖苷酶广泛使用在衰老以及衰老细胞的生物标记物，因其有可靠和容易检测的特性。
DNA损伤应答：是指细胞通过由多条信号传导通路构成的网络检测和传递损伤信号，抵御外界及内在因素诱导DNA损伤的机制。当监控到DNA损伤时，细胞会快速启动应答机制正确修复受损的DNA，以确保细胞的功能正常。

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神经退行性疾病是随着时间的推移，神经元结构或功能丧失而导致功能障碍的一类疾病，包括阿尔兹海默病、帕金森病、脊髓性肌萎缩症等，其中阿尔茨海默病和帕金森病多发于中老年，而脊髓性肌萎缩症在各个年龄段都可能发生。背根神经节处于将所有的躯体感觉信号传递到大脑的重要位置，具有容易从胚胎和成年动物中分离出来的优势，神经元的轴突在体外培养3 d内便可成功延伸，且常被用于体细胞和轴突的退行性机制的研究，因此背根神经节神经元是用于尝试建立体外衰老模型的优秀选择。

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