2.1   芯片间归一化质控   使用R“limma”包中的normalize BetweenArrays( )函数分别对3个GEO数据集的数据进行芯片间归一化处理，见图1。




2.2   差异表达基因的筛选   应用 R 软件对GSE1919和 GSE55235数据集进行标准化处理，以|Log2FoldChange|> 0.5且 P < 0.05 为初筛条件分析差异表达基因。GSE1919 芯片筛选出318个差异表达基因，其中174个上调基因、144个下调基因，见图2A，B。GSE55235 芯片共筛选出 2 147个差异表达基因，其中1 224个上调基因、923个下调基因，见图2C，D。



2.3   构建WGCNA筛选类风湿关节炎表型相关枢纽模块   通过R分别对 GSE1919和 GSE55235数据集进行样本聚类，两样本均展现出较好的聚类趋势。计算GSE1919芯片软阈值=9，基于软阈值构建基因模块，见图3A；构建共表达矩阵网络，并通过动态混合剪切得到11个以热图方式呈现的基因模块，见图3B；选择与类风湿关节炎相关性最强的蓝绿色模块标记为“GSE1919模块基因”进行后续分析，见图3C。该模块包括1 711个基因，与类风湿关节炎表型相关性最强(r=0.95，P < 0.01) ，见图3D。

同上分析GSE55235数据集获得枢纽模块与类风湿关节炎相关性散点图(软阈值=5，17个与类风湿关节炎相关模块)。选择与类风湿关节炎相关性最强的蓝绿色模块标记为“GSE55235模块基因”进行后续分析，该模块包括2 156个基因，与类风湿关节炎的相关性强(r=0.98，P < 0.01)，见图4。此次研究挑选出与类风湿关节炎相关性最强的蓝绿色模块，这与LU等[19]对GSE55235数据集的分析结果一致。



2.4   筛选与类风湿关节炎相关的枢纽基因    通过韦恩图绘制GSE1919差异基因、 GSE55235差异基因、GSE1919模块基因和GSE55235模块基因的交集，筛选出150个交集基因，见图5。

通过 String-Cytoscape-cytoHubba 分析 150个交集基因网络，MCC 算法筛选分值最高的10个基因为枢纽基因：CD4、CD27、 IL2RG、CD247、CD8A、CD79A、CD3D、CD52、LCK和NKG7，见图6。

10个枢纽基因基因本体论功能注释，结果主要富集在淋巴细胞分化、T细胞分化、抗原受体介导的信号通路等生物过程；脂膜外侧、质膜信号受体复合物、T细胞受体复合物等细胞组分；主要组织相容性复合体蛋白结合、辅助受体活性、细胞因子受体活性等分子功能，见图7及表2。使用Cytoscape软件ClueGO插件进行KEGG富集分析显示，10个枢纽基因富集于T细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、肿瘤细胞程序性死亡-配体1表达和程序性死亡受体1检查点通路及原发性免疫缺陷5个通路，见图8。











2.5   GSEA分析结果   GSEA用于评估预定义的基因集在两种生物表型(例如对照组和类风湿关节炎组)之间的差异是否具有统计学意义。标准化处理 GSE1919(10个样本包含8 621个基因)和 GSE55235(13个样本包含12 548个基因)矩阵数据，根据分析结果的过滤阈值，2个数据集类风湿关节炎样本有3个共有KEGG通路：哮喘、自身免疫性甲状腺疾病和细胞黏附分子均显著上调，见图9。



2.6   外部数据集验证   验证枢纽基因在其他类风湿关节炎患者滑膜组织中的表达。选择GSE55457为测试数据集，分析10个枢纽基因在健康对照与类风湿关节炎患者滑膜组织的表达量。除CD4之外(P=0.78)，其余9个枢纽基因(CD27、IL2RG、CD247、CD8A、CD79A、CD3D、CD52、LCK、NKG7)在类风湿关节炎组的表达量均显著高于对照组(P < 0.01)，见图10。




2.7   受试者工作特征曲线评估枢纽基因对类风湿关节炎的诊断价值   做受试者工作特征曲线，计算曲线下面积。曲线下面积> 0.85的5个基因(CD27、IL2RG、CD8A、LCK、NKG7)特异性和敏感性较高，对类风湿关节炎患者具有较高的诊断价值，见图11。

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类风湿关节炎是一种慢性、进行性的全身自身免疫性炎症疾病，主要影响周围关节，早期累及关节滑膜组织[1]。类风湿关节炎发病机制复杂，可能是某些感染因素在遗传易感个体触发的自身免疫反应，是遗传和环境之间相互作用的结果[2]。类风湿关节炎的治疗通常只在早期有效，随着病情进展，许多患者对抗类风湿药物的反应降低而影响疗效[3]，因此，早期诊断类风湿关节炎是预防不可逆关节破坏的关键。

传统的血清生物标志物，如类风湿因子、抗瓜氨酸蛋白抗体、抗环瓜氨酸肽抗体、C-反应蛋白、血沉虽能识别部分早期典型的类风湿关节炎患者，但仍有30%患者为阴性[4]。近年发现的血清标志物，如微小核糖核酸[5]、钙蛋白和抗氨甲酰化蛋白抗体，因其诊断的敏感性和特异性较低，不利于临床推广[6]，很多类风湿关节炎患者因得不到及时诊断而影响治疗及预后。因此，寻找敏感性、特异性强的诊断标志物成为当前的迫切需求。随着高通量检测技术的推广，从滑膜组织寻找枢纽基因成为探索类风湿关节炎早期生物标志物的可靠途径。

2011年有学者开始结合网络拓扑特性和支持向量机回归，挖掘类风湿关节炎的易感基因模块和风险基因[7]。但到目前为止，关于类风湿关节炎枢纽基因的研究尚存在一些不足，如仅对差异基因进行富集分析[8]、样本异质性高、技术平台单一等[9]。此次研究通过有效整合高通量数据，特别是基因表达和符合生物学特点的无尺度网络模型的构建进行生物信息学分析并加以验证，以期为类风湿关节炎的早期诊断提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   分子生物信息学实验，外部数据集交叉验证，利用R软件的pROC程序包评估枢纽基因的诊断价值。
1.2   时间及地点   实验于2022年1-3月在沧州医学高等专科学校杨栋梁统计大师工作室完成。
1.3   数据下载和整理   以“rheumatoid arthritis”为关键词从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载人群滑膜转录水平表达谱数据集。测试数据集2个：GSE1919(平台GPL91，[HG_U95A] Affymetrix Human Genome U95A Array)和GSE55235(平台GPL96，[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array)。GSE1919数据集包含5个健康对照的滑膜组织样本(GSM34379、GSM34383、GSM34385、GSM34388、GSM34391)和5个类风湿关节炎患者的滑膜组织样本(GSM34398-GSM34402)。GSE55235数据集包含10个健康对照(GSM1332201-GSM1332210)和10个类风湿关节炎患者(GSM1332221-GSM1332230)。此外，选取GSE55457数据集(GPL96)，包含10个健康对照(GSM1337304-GSM1337313)和13个类风湿关节炎患者(GSM1337314-GSM1337326)滑膜组织，见表1。为使数据集内芯片之间具有可比性，数据分析前对3个GEO数据集的芯片进行归一化处理。

1.4   差异表达基因的筛选   基于稳健多芯片平均算法标准化处理数据得到基因表达矩阵数据。在比较类风湿关节炎与对照组基因表达值的基础上，利用R(版本R4.0.3)的limma包，以校正P < 0.05 并且|logFC|≥0.5为初筛条件对差异表达基因进行分析。继而将差异表达基因的表达水平通过R语言“ggplot2”“pheatmap”包以火山图和热图的形式展示。
1.5   筛选类风湿关节炎相关基因模块   加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)是一种检测基因相关性的算法，有助于基于网络的遗传筛选[10]，避免了微阵列数据分析固有的多重测试问题[11]，并有助于发现潜在的、差异不显著的生物标志物[12]。构建WGCNA并加载GSE1919和GSE55235基因矩阵，排除样本聚类中可能出现的异常样本[13]。通过 R 软件“WGCNA”包和“limma”包对样本进行聚类，在选择合适的软阈值后，建立拓扑重叠矩阵，构建无尺度网络，然后通过动态树切割和簇树图计算、识别不同的模块。根据基因共表达网络的显著性，获得基因显著性和模块隶属度，分别筛选2个数据集中与类风湿关节炎相关性最强的模块。
1.6   蛋白质互作网络和Cytoscape筛选枢纽基因   蛋白质互作网络有助于识别致病基因和理解基因之间的关系[14]。将通过 “limma” 包初筛得到的差异表达基因，标记为“GSE1919差异基因”和“GSE55235差异基因”文件。使用 WGCNA 方法分析不同模块的基因显著性、模块隶属度值(参数|模块隶属度|> 0.8 和|基因显著性|> 0.5)将筛选出的2个数据集的类风湿关节炎相关模块，标记为“GSE1919模块基因”和“GSE55235模块基因”。使用R软件“venn”包，对上述4个标记文件的基因取交集。为探究不同基因编码蛋白之间的相互关系，将得到的数据导入STRING (https://string-db.org/，版本11.5)进一步分析(最低交互得分> 0.4，去除网络中孤立的节点)。以往相关研究大多采用Cytoscape的MCODE插件，筛选1个或数个重要的子网络进行分析。如REN等[15]使用MCODE插件确定了5个子网络，取得分最高的子网络基因作为枢纽基因。此次研究为寻找有助于类风湿关节炎早期诊断的生物标志物，选择cytoHubba插件的MCC算法，筛选10个最重要的枢纽基因。
1.7   枢纽基因的基因本体论分析   准备表达数据集、表型数据、功能基因集，采用 “clusterProfiler” 包对10个枢纽基因进行分析。基因本体论分析分为生物过程、细胞组分和分子功能，以P < 0.05为差异有显著性意义，分别取前5种功能。
1.8   基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)   GSEA是由UC San Diego和Broad Institute共同开发的[16]，此次研究用于评估预定义的基因集在2种生物表型(如对照组和类风湿关节炎组)之间是否具有统计学差异，从全体基因的表达矩阵中找出重要的通路[17]。由于其不需要每组分别富集，而是直接对整体进行分析，所以对定量数据有明显优势[18]。此次研究在初筛差异表达基因基础上进一步挖掘与类风湿关节炎密切相关的通路，选择的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)基因集(c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt)从分子签名数据库(MSigDB)下载，以校正后P < 0.05、FDR < 0.05为筛选条件。加载R“limma”“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”包，分析KEGG通路。
1.9   外部数据集验证   GSE55457芯片数据集共包含健康对照样本10例、类风湿关节炎样本13例滑膜组织。使用“limma”包验证、比较10个枢纽基因在两组的表达情况，采用“ggpubr”包绘制箱式图，将结果可视化。
1.10   评估枢纽基因的诊断价值   采用数据集GSE55457，使用“pROC”包对10个枢纽基因做受试者工作特征曲线，观察曲线下面积，评估枢纽基因对类风湿关节炎的诊断价值。
1.11   主要观察指标   基因本体论及KEGG通路、GSEA基因集KEGG通路、外部数据集验证枢纽基因，及其对类风湿关节炎的诊断价值。
1.12   统计学分析   利用R软件的pROC程序包绘制受试者工作特征曲线，并计算受试者工作特征曲线下面积，在受试者工作特征曲线下面积大于0.5的情况下，面积越接近于1，说明诊断的准确性越高，认为该诊断指标具有一定的诊断价值。

类风湿关节炎是一种以炎症细胞浸润为特征的慢性系统性自身免疫疾病[20-21]，持续性滑膜炎对关节造成不同程度的损伤[22-23]，已成为最常见的致残原因之一[24]。类风湿关节炎表现为关节周围骨质疏松、关节间隙狭窄、骨囊变性[25]。据统计，类风湿关节炎患病率为0.5%-1.0%，每年每1 000人新增病例0.5-5例，女性的发病率是男性的3倍[26]。类风湿关节炎发病机制主要是自身抗体和免疫复合物的形成[27]，涉及T细胞介导的抗原特异性反应、T细胞独立的细胞因子网络和类风湿滑膜的侵袭性类肿瘤行为等[28]，其中免疫相关的基因成为近年来的研究热点[29]。

此次研究筛选得到10个枢纽基因，根据其在类风湿关节炎发病机制中的作用分为4组：①参与T细胞受体复合物形成和T淋巴细胞分化的基因：CD247、CD3D、CD4、LCK；②参与辅助性T细胞分化和免疫防御的基因IL2RG、CD52、CD8A；③促进炎症的基因：CD27、NKG7；④参与B淋巴细胞信号转导的基因：CD79A。

基因CD247、CD3D、CD4、LCK参与T细胞受体的形成和信号通路。淋巴细胞表面分子T细胞受体-CD3复合体的主要功能为识别结合主要组织相容性复合体分子的抗原，活化的CD4+T细胞和主要组织相容性复合体Ⅱ型阳性的抗原提呈细胞浸润关节滑膜[30-31]。T细胞受体T3 zeta链，也被称为CD247，是T细胞受体-CD3复合体组装、表面表达和信号级联所必需的，该通路异常可导致T细胞功能障碍和自身免疫性疾病的发生[32]。CD3D即细胞表面糖蛋白CD3链，也是T细胞受体-CD3复合体的一部分，在适应性免疫反应中起重要作用。LU等[19]鉴定了76个类风湿关节炎特征基因，通过3个外部数据集验证了基因在类风湿关节炎患者滑膜中的表达，发现CD3D、GZMK和KLRB1是类风湿关节炎早期诊断的潜在标志物，特别适用于抗环瓜氨酸肽抗体阴性的患者。人类CD4基因定位于染色体12p13的基因密集区域，其表达主要在转录水平进行调控。CD4增强子和启动子是T细胞中CD4转录的主要调控区域，CD4增强子基因多态性与类风湿关节炎易感性相关[33]。LCK为酪氨酸受体激酶，在T细胞受体连接的信号转导通路中结合蛋白酪氨酸复合体，促进CD4与主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子相互作用，并调节T 细胞激活信号的传导过程。此次研究基因本体论富集结果显示：CD3D、CD4、LCK富集于淋巴细胞分化、T细胞分化，CD4、CD8A、CD79A、LCK 富集于T细胞受体复合物，CD、CD247富集于酪氨酸激酶结合蛋白；KEGG通路富集显示CD247、CD3D、CD4、LCK富集于T细胞受体信号通路，提示该组基因通过T细胞受体、酪氨酸激酶影响T细胞分化。

基因IL2RG、CD52、CD8A参与辅助性T细胞分化和免疫防御。IL2RG为白细胞介素2受体γ链，是多种重要免疫因子的共同受体亚基，发挥重要免疫作用。有研究通过整合全基因组基因表达谱分析滑膜组织类风湿关节炎基因发现，IL2RG与原发性免疫缺陷通路存在直接或间接的相互作用，提示这些上调的基因可能激活原发性免疫缺陷通路，增加类风湿关节炎发生的风险[34-35]。CD52基因与免疫应答和炎症信号转导密切相关，如体液免疫应答、趋化因子信号转导途径、抗原受体介导的信号转导途径、Th17细胞分化、白细胞介素17信号转导途径[15]。CD8A编码二聚体CD8蛋白的CD8A链，主要参与细胞介导的免疫防御和T细胞发育。ZHOU等[3]在探讨类风湿关节炎的免疫分子机制的研究中报道，CD8A在类风湿关节炎患者中明显过表达，尤其是在早期阶段，回归分析进一步证明CD8A对早期类风湿关节炎的诊断具有良好的特异性和敏感性。CD52又称EDDM5，是一种低分子量糖蛋白，在B细胞和T细胞中表达丰富[36]。此次研究枢纽基因KEGG通路富集也显示包括IL2RG在内的6个基因富集于原发性免疫缺陷通路，提示该组基因为干预原发性免疫缺陷的潜在靶点。

促进炎症的基因有CD27、NKG7。ABREU等[37]用流式细胞术检测类风湿关节炎患者和健康供者外周血的自然杀伤细胞，观察细胞表面CD27的表达，发现CD27自然杀伤细胞亚群在类风湿关节炎中发挥重要作用，生成大量的促炎细胞因子导致机体处于慢性炎症状态。NKG7是淋巴细胞颗粒胞吐作用和下游炎症的调节因子，有研究结果提示CD27、NKG7在类风湿关节炎滑膜炎症性病变中发挥作用。

CD79A为参与B淋巴细胞信号转导的基因，CD79A与B细胞受体结合，并在识别抗原后产生信号。B淋巴细胞属于专职性抗原提呈细胞，B细胞受体识别、吞入抗原，水解产物与主要组织相容性复合体-Ⅱ形成复合物，提呈给CD4+T细胞。此次研究基因本体论分析结果显示CD79A等4个基因富集于T细胞受体复合物，为类风湿关节炎发病机制的研究提供了线索。

通过对比枢纽基因KEGG通路与GSEA基因集分析得到的KEGG通路，发现枢纽基因的KEGG通路有5条：T细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、肿瘤程序性死亡-配体1表达和程序性死亡受体1检查点通路及原发性免疫缺陷。GSEA基因集分析得到的KEGG通路有16条：自身免疫性甲状腺疾病、系统性红斑狼疮、1型糖尿病、哮喘、细胞黏附分子、核糖体等，比枢纽基因KEGG富集分析结果更加全面而准确。2种类型KEGG通路富集分析发现一条共同通路——原发性免疫缺陷，有助于类风湿关节炎发病机制的探索。

此次研究采用GSE55457数据集对枢纽基因进行了外部验证，结果显示9个基因在类风湿关节炎组表达明显高于对照组；受试者工作特征曲线评估枢纽基因对类风湿关节炎的诊断价值，显示CD27、IL2RG、CD8A、LCK、NKG7基因对诊断类风湿关节炎具有良好的特异性和敏感性。值得注意的是，CD4(曲线下面积=0.52)虽然对类风湿关节炎诊断敏感性、特异性不高，但在10个枢纽基因中得分最高，提示CD4有可能是多能的协调员。CD4是T细胞表面糖蛋白，在免疫反应中发挥重要作用，并在对抗外部和内部攻击的反应中发挥多种功能。在T细胞中，CD4的主要功能是作为主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子的肽复合体，同时与T细胞受体和抗原呈递细胞呈递的主要组织相容性复合体-Ⅱ类相互作用。BURSKA等[38]使用qPCR方法测量白细胞介素17和CD4基因关键位置甲基化程度的研究也证实，CD4+T淋巴细胞Th17是类风湿关节炎发生的前兆，尤其是在抗环瓜氨酸肽抗体阴性患者中。因此，CD4很可能是潜在的生物标志物。

此次研究存在一些局限性：首先，分析主要基于转录信息而没有关注翻译后的调节；其次，由于基因的种族特异性，结果可能不适合其他种族人群；第三，小样本量影响基因网络模型的稳定性。以上不足均需在今后研究中进一步完善。

综上所述，WGCNA和GSEA方法有助于挖掘对疾病发生发展具有协同作用的重要基因。此次研究发现5个枢纽基因(CD27、IL2RG、CD8A、LCK、NKG)对类风湿关节炎诊断具有较高价值，3条通路(哮喘、自身免疫性甲状腺疾病和细胞黏附分子通路)在类风湿关节炎组表达上调，为类风湿关节炎的早期诊断、治疗靶点及药物研发提供了新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
类风湿关节炎：是一种慢性、进行性的全身自身免疫性炎症疾病，主要影响周围关节，早期累及关节滑膜组织。
基因集富集分析：是由UC San Diego和Broad Institute共同开发的软件，用于评估预定义的基因集在2种生物表型之间是否具有统计学上的显著差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

传统的血清生物标志物，如类风湿因子、抗瓜氨酸蛋白抗体、抗环瓜氨酸肽抗体、C-反应蛋白、血沉虽能识别部分早期典型的类风湿关节炎患者，但仍有30%患者为阴性。近年发现的血清标志物，如微小核糖核酸、钙蛋白和抗氨甲酰化蛋白抗体，因其诊断的敏感性和特异性较低，不利于临床推广，很多类风湿关节炎患者因得不到及时诊断而影响治疗及预后。因此，寻找敏感性、特异性强的诊断标志物成为当前的迫切需求。随着高通量检测技术的推广，从滑膜组织寻找枢纽基因成为探索类风湿关节炎早期生物标志物的可靠途径。目前已有关于类风湿关节炎枢纽基因的研究，但仍存在仅对差异基因进行富集分析、样本异质性高等不足。此次研究通过构建无尺度网络深入分析类风湿关节炎患者滑膜组织特征基因，结合差异表达分析和加权基因共表达网络，筛选出150个候选枢纽基因；再通过蛋白互作网络和Cytoscape软件筛选10个枢纽基因，对其进行功能富集和通路富集；并与基因集富集分析相结合探讨作用通路。创新之处在于兼顾差异基因和基因集分析，挖掘有协同作用的基因组合，包括差异不明显但有协同能力的基因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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