不同孔径梯度纳米羟基磷灰石三维支架制备及对MC3T3-E1生物学性能的影响

doi:10.12307/2022.641

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (21): 3338-3344.doi: 10.12307/2022.641

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

不同孔径梯度纳米羟基磷灰石三维支架制备及对MC3T3-E1生物学性能的影响

杨姣姣1，胡明1，李岩2，夏德林1

1西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000；2泰州职业技术学院药学院，泰州市骨组织工程技术研究中心，江苏省泰州市 225300

收稿日期:2021-08-23 接受日期:2021-10-11 出版日期:2022-07-28 发布日期:2022-01-28
通讯作者: 夏德林，博士，主任医师，教授，西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000
作者简介:杨姣姣，女，1995年生，河南省周口市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事口腔颌面外科临床与基础研究。
基金资助:
泸州市科技局项目[2013-S-48(8/30)]，项目参与者：夏德林；四川省科技厅应用基础研究资助项目(2008JY0014)，项目负责人：夏德林

Effect of hydroxyapatite three-dimensional scaffolds with different apertures on the biological properties of MC3T3-E1 cells

Yang Jiaojiao1, Hu Ming1, Li Yan2, Xia Delin1

1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Affiliated Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Taizhou Polytechnic College, Bone Tissue Engineering Research Center of Taizhou, Taizhou 225300, Jiangsu Province, China

Received:2021-08-23 Accepted:2021-10-11 Online:2022-07-28 Published:2022-01-28
Contact: Xia Delin, MD, Chief physician, Professor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Affiliated Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Yang Jiaojiao, Master candidate, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Affiliated Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Luzhou Science and Technology Bureau Project, No. 2013-S-48(8/30) (to XDL); the Applied Basic Research Grant Project of Sichuan Science and Technology Department, No. 2008JY0014 (to XDL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
孔径梯度羟基磷灰石三维支架：以特定直径的蜡球为造孔剂，与羟基磷灰石混合，采用改良型粒子浸出法构建一种外大内小的孔径梯度三维支架。其中，蜡球可通过挤压变形，利用改良型粒子浸出法制作出的支架孔径尺寸可控，形态均一且相互贯通。
MC3T3-E1细胞：为小鼠胚胎成骨细胞，在MC3T3-E1细胞发育的不同阶段，骨相关基因表达变化与体内观察到的相似。基于以上，MC3T3-E1细胞提供了一个很好的模型来研究成骨细胞分泌和骨形成作用，近年来被广泛应用于成骨相关研究。

背景：骨组织工程支架孔径是评估其物理性能的重要因素，寻求孔径及力学性能二者的最佳结合点一直是骨组织工程亟待解决的问题。
目的：制备不同孔径梯度的三维支架，并研究其对MC3T3-E1细胞生物学行为的影响。
方法：将直径300，500，800 μm的蜡球造孔剂分别与羟基磷灰石混合，采用改良型粒子浸出法制备孔径均一的纳米羟基磷灰石三维支架，分别记为D300、D500、D800组支架；将3种直径的蜡球从小到大依次堆积，采用改良型粒子浸出法制备孔径梯度纳米羟基磷灰石三维支架，记为D-Gradient组支架，检测4组支架的孔隙率。将MC3T3-E1细胞分别接种于4组支架上，以细胞单独培养的为空白对照组，检测细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性、细胞黏附及细胞骨架重排与成骨分化标志性因子转录水平。
结果与结论：①4组支架的孔隙率为60%-80%；②接种24 h后，各组支架均可促进MC3T3-E1细胞的增殖，增殖指数大小为：D-Gradient组>D500组>D800组>D300组>空白对照组；D300组、D500组、D-Gradient组支架均可促进MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶的分泌，碱性磷酸酶分泌量多少为：D300组>D500组>D-Gradient组>D800组≈空白对照组；D300组、D500组、D-Gradient组支架均可促进MC3T3-E1细胞骨桥蛋白与骨钙素mRNA的表达，两种基因表达量由高到低为：D300组>D500组D-Gradient组>D800组≈空白对照组；③接种48 h后的免疫荧光染色显示，与空白对照组相比，4支架上的MC3T3-E1细胞均呈现出较好的黏附及运动活性，黏着斑肌动蛋白荧光强度由高到低为：D-Gradient组>D500组> D800C组>D300组>空白对照组；④结果表明，孔径梯度纳米羟基磷灰石三维支架可促进MC3T3-E1细胞的生长、增殖、黏附及成骨分化。

https://orcid.org/0000-0002-5175-4713 (杨姣姣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 羟基磷灰石, 梯度支架, 孔径, 孔隙率, 成骨分化, 增殖指数, 黏着斑, 骨桥蛋白, 骨钙素

Abstract: BACKGROUND: The aperture of bone tissue engineering scaffold is one of the important indexes to evaluate its biological performance, and seeking the best combination of aperture and mechanical properties has always been an urgent problem to be solved in bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To prepare three-dimensional scaffolds with different aperture gradients and to study their effects on the biological behavior of MC3T3-E1 cells.
METHODS: The three-dimensional nano-hydroxyapatite scaffolds with uniform pore size were prepared by mixing wax spheres of specific diameter (300, 500, 800 μm) with hydroxyapatite as pore-forming agent using the modified particle leaching method, which were recorded as the D300, D500, and D800 scaffolds, respectively. The wax spheres of three diameters were piled up in order from small to large. The pore gradient nano-hydroxyapatite three-dimensional scaffold was prepared by the modified particle leaching method, which was recorded as the D-Gradient scaffold. The porosity of scaffolds of the four groups was measured. MC3T3-E1 cells were inoculated on scaffolds of the four groups. The cells cultured separately were used as the blank control group. Cell proliferation activity, alkaline phosphatase activity, cell adhesion, cytoskeleton rearrangement and the transcription level of osteogenic differentiation marker factors were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The porosity of scaffolds of the four groups was 60%-80%. (2) After 24 hours of inoculation, the scaffolds in each group could promote the proliferation of MC3T3-E1 cells. The proliferation index was: D-Gradient group > D500 group > D800 group > D300 group > blank control group. The scaffolds in the D300 group, D500 group, and D-Gradient group promoted the secretion of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 cells. The amount of alkaline phosphatase secretion was: D300 group > D500 group > D-Gradient group > D800 group ≈ blank control group. The scaffolds in the D300 group, D500 group, and D-Gradient group promoted the expression of osteopontin and osteocalcin mRNA in MC3T3-E1 cells. The expression levels of the two genes from high to low were: D300 group > D500 group > D-Gradient group > D800 group ≈ blank control group. (3) Immunofluorescence staining after 48 hours of inoculation showed that compared with the blank control group, MC3T3-E1 cells on the four scaffolds showed better adhesion and locomotor activity. The fluorescence intensity of focal adhesion actin from high to low was: D-Gradient group > D500 group > D800C group > D300 group > blank control group. (4) It is concluded that the aperture gradient scaffolds promote the growth, proliferation, adhesion, and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.

Key words: hydroxyapatite, gradient scaffold, aperture, porosity, osteogenesis, proliferation index, focal adhesion, osteopontin, osteocalcin

中图分类号:

杨姣姣, 胡明, 李岩, 夏德林. 不同孔径梯度纳米羟基磷灰石三维支架制备及对MC3T3-E1生物学性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3338-3344.

Yang Jiaojiao, Hu Ming, Li Yan, Xia Delin. Effect of hydroxyapatite three-dimensional scaffolds with different apertures on the biological properties of MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(21): 3338-3344.

图/表（结果） 10

2.1 制作转速对蜡球的影响如表2所示，转速对蜡球成型有影响，实验详细记录了20-640 r/min转速对于蜡球成型直径大小的影响。当转速<384 r/min时，旋转产生的剪切力难以破坏蜡液表面张力，蜡液难以分散，致使形成蜡球较少且直径过大，形状不规则，实用性差；当转速>544 r/min时，蜡液极易分散，但冷却后约80%的蜡球直径<0.71 mm，蜡球太细，实用性也不理想。综上，适合制作实验所需蜡球的转速在384-544 r/min。

如图1所示，最适合0.28-0.35 mm的蜡球成型转速约在544 r/min；最适合0.45-0.60 mm蜡球成型转速为480 r/min，一次性蜡球成型量较多；最适合0.71-0.90 mm蜡球成型转速为400 r/min，一次性制作的目标蜡球量较少。

2.2 不同孔径支架的表征结果 X射线衍射结果显示，除特征峰外无其他杂质峰，说明烧结过程中未引入除羟基磷灰石以外的物质；1 200 ℃烧结后，峰高可见明显变大、尖锐，其相应的晶相更纯，晶度得到了提高，见图2。

扫描电子显微镜下可见，各组支架表面具有贯通的空隙，随支架孔径的增大贯通径随之增大。D-Gradient组支架孔径由外向内逐渐缩小，其余3组支架孔径大小均匀，见图3。证实了蜡球作为造孔剂这一实验方法的可行性，可得到目标孔径大小的支架。

经过Nano Measurer 1.2软件分析可得到相应支架的孔径，随蜡球直径的增大支架孔径也变大。梯度支架由3种蜡球依次组合形成，孔径外大内小，平均孔径为(362±117) μm，与D500组近似，见表3。

4组支架孔隙率在60%-80%，孔径越大支架孔隙率越高。有研究表明，促进骨组织修复再生的孔隙度应至少在50%以上[3]。实验中各孔径组支架的孔隙率均符合这一要求。
2.3 不同孔径支架对MC3T3-E1细胞生物学性能的影响
2.3.1 MC3T3-E1细胞增殖指数测定结果见图4。各组支架均对MC3T3-E1细胞增殖均具有促进作用，孔径梯度支架对成骨细胞增殖的促进作用最为明显(P < 0.01)，D500组次之次(P < 0.05)。各组支架上细胞增殖指数大小为：D-Gradient组>D500组组>D800组>D300组>空白对照组。

2.3.2 MC3T3-E1细胞分泌碱性磷酸酶测定结果见图5。碱性磷酸酶是早期成骨分化的标志，在细胞增殖后期可见其分泌增加[11]。与空白对照组相比，D-Gradient组(P < 0.05)、D300组(P < 0.01)和D500组(P < 0.05)的碱性磷酸酶活性明显增强，表明这3种孔径的支架材料有利于促进成骨细胞的分化；D800组相比于空白对照组碱性磷酸酶分泌活性无明显增加，各组支架中细胞碱性磷酸酶活性高低为：D300组>D500组> D-Gradient组>D800组≈空白对照组。

2.3.3 MC3T3-E1细胞骨架形态和黏着斑检测结果见图6。与空白对照相比，各组支架上的细胞均呈现出较好的黏附及运动活性，其中D-Gradient组细胞发展最好、黏着最多，肌动蛋白纤维更加清晰可见。黏着斑与肌动蛋白荧光强度高低为：D-Gradient组>D500组>D800组>D300组>空白对照组。
2.3.4 MC3T3-E1细胞骨钙素与骨桥蛋白基因表达检测结果见图7。与空白对照相比，D300组的骨桥蛋白和骨钙素基因表达活性明显增强(P < 0.01)，更有利于促进成骨分化；D500组和D-Gradient组骨桥蛋白和骨钙素基因表达活性增强(P < 0.05)，且两者的促进作用相近。骨桥蛋白与骨钙素基因表达量的高低为：D300组> D500组>D-Gradient组>D800组≈空白对照组。

2.4 羟基磷灰石支架的细胞相容性通过细胞增殖指数、碱性磷酸酶活性与骨桥蛋白和骨钙素基因表达两检测结果可知，孔径梯度羟基磷灰石支架剧具有良好的细胞相容性。

参考文献

[1] LEE JW, AHN G, KIM JY, et al. Evaluating cell proliferation based on internal pore size and 3D scaffold architecture fabricated using solid freeform fabrication technology. J Mater Sci Mater Med. 2010;21(12): 3195-3205.
[2] AMINI AR, NUKAVARAPU SP. Oxygen-tension controlled matrices for enhanced osteogenic cell survival and performance. Ann Biomed Eng. 2014;42(6):1261-1270.
[3] PEREZ RA, MESTRES G. Role of pore size and morphology in musculo-skeletal tissue regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016;61: 922-939.
[4] BAINO F, FIORILLI S, VITALE-BROVARONE C. Bioactive glass-based materials with hierarchical porosity for medical applications: Review of recent advances. Acta Biomater. 2016;42:18-32.
[5] ZHANG Q, LU H, KAWAZOE N, et al. Preparation of collagen porous scaffolds with a gradient pore size structure using ice particulates. Mater Lett. 2013;107:280-283.
[6] SHI D, SHEN J, ZHANG Z, et al. Preparation and properties of dopamine-modified alginate/chitosan-hydroxyapatite scaffolds with gradient structure for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2019; 107(8):1615-1627.
[7] MA H, XUE L, NIE T. Fabrication of PLLA scaffold with gradient macro/micro/nano structure by electrophoretic deposition of carbon nanotube. Mater Lett. 2015;159:185-188.
[8] WILLIAMS JM, ADEWUNMI A, SCHEK RM, et al. Bone tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via selective laser sintering. Biomaterials. 2005;26(23):4817-4827.
[9] DI LUCA A, OSTROWSKA B, LORENZO-MOLDERO I, et al. Gradients in pore size enhance the osteogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells in three-dimensional scaffolds. Sci Rep. 2016;6:22898.
[10] LEE SJ, LEE IW, LEE YM, et al. Macroporous biodegradable natural/synthetic hybrid scaffolds as small intestine submucosa impregnated poly(D,L-lactide-co-glycolide) for tissue-engineered bone. J Biomater Sci Polym Ed. 2004;15(8):1003-1017.
[11] SOBRAL JM, CARIDADE SG, SOUSA RA, et al. Three-dimensional plotted scaffolds with controlled pore size gradients: Effect of scaffold geometry on mechanical performance and cell seeding efficiency. Acta Biomater. 2011;7(3):1009-1018.
[12] LIU B, CUI L, LIU GP, et al. [Tissue-engineering bone with ADSCs and coral scaffold for repairing of cranial bone defect in canine]. Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi. 2009;25(3):204-208.
[13] FU R, LIU C, YAN Y, et al. Bone defect reconstruction via endochondral ossification: A developmental engineering strategy. J Tissue Eng. 2021; 12:20417314211004211.
[14] GAO C, SOW WT, WANG Y, et al. Hydrogel composite scaffolds with an attenuated immunogenicity component for bone tissue engineering applications. J Mater Chem B. 2021;9(8):2033-2041.
[15] WANG C, YUE H, HUANG W, et al. Cryogenic 3D printing of heterogeneous scaffolds with gradient mechanical strengths and spatial delivery of osteogenic peptide/TGF-β1 for osteochondral tissue regeneration. Biofabrication. 2020;12(2):025030.
[16] SU X, WANG T, GUO S. Applications of 3D printed bone tissue engineering scaffolds in the stem cell field. Regen Ther. 2021;16:63-72.
[17] CHANG BS, LEE CK, HONG KS, et al. Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations. Biomaterials. 2000; 21(12):1291-1298.
[18] BOBYN JD, PILLIAR RM, CAMERON HU, et al. The optimum pore size for the fixation of porous-surfaced metal implants by the ingrowth of bone.Clin Orthop Relat Res. 1980;(150):263-270.
[19] BAI F, WANG Z, LU J, et al. The correlation between the internal structure and vascularization of controllable porous bioceramic materials in vivo: a quantitative study. Tissue Eng Part A. 2010;16(12): 3791-3803.
[20] XIAO X, WANG W, LIU D, et al. The promotion of angiogenesis induced by three-dimensional porous beta-tricalcium phosphate scaffold with different interconnection sizes via activation of PI3K/Akt pathways. Sci Rep. 2015;5:9409.
[21] ITÄLÄ AI, YLÄNEN HO, EKHOLM C, et al. Pore diameter of more than 100 microm is not requisite for bone ingrowth in rabbits. J Biomed Mater Res. 2001;58(6):679-683.
[22] KUBOKI Y, JIN Q, TAKITA H. Geometry of carriers controlling phenotypic expression in BMP-induced osteogenesis and chondrogenesis. J Bone Joint Surg Am. 2001;83-A Suppl 1(Pt 2):S105-115.
[23] 郑威,董学明,何阳,等.生物活性聚合物及其复合材料在骨组织工程中的应用进展[J].哈尔滨工业大学学报,2021,53(8):1-16.
[24] YEUNG M, ABDULMAJEED A, CARRICO CK, et al. Accuracy and precision of 3D-printed implant surgical guides with different implant systems: An in vitro study. J Prosthet Dent. 2020;123(6):821-828.
[25] GOH YQ, OOI CP. Fabrication and characterization of porous poly(L-lactide) scaffolds using solid-liquid phase separation. J Mater Sci Mater Med. 2008;19(6):2445-2452.
[26] 廖欣宇,王福科,王国梁.骨组织工程支架的进展与挑战[J].中国组织工程研究,2021,25(28):4553-4560.
[27] 王启帆,马志勇,钟林娜,等.PCL/ZrO2骨组织工程支架3D打印制备方法及其性能研究[J].北京生物医学工程,2020,39(4):418-424.
[28] LO DICO G, NUÑEZ ÁP, CARCELÉN V, et al. Machine-learning-accelerated multimodal characterization and multiobjective design optimization of natural porous materials. Chem Sci. 2021;12(27):9309-9317.
[29] WU Z, LUO J, ZHANG J, et al. Silver-Releasing Micro-/Nanoporous Coating on Additively Manufactured Macroporous Ti-Ta-Nb-Zr Scaffolds with High Osseointegration and Antibacterial Properties. Coatings. 2021;11(6):716.
[30] CABALLERO-FLORES H, NABESHIMA CK, SARRA G, et al. Development and characterization of a new chitosan-based scaffold associated with gelatin, microparticulate dentin and genipin for endodontic regeneration. Dent Mater. 2021;37(7):e414-e425.
[31] XUE G, ZHANG Y, XIE T, et al. Cell Adhesion-Mediated Piezoelectric Self-Stimulation on Polydopamine-Modified Poly(vinylidene fluoride) Membranes. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13(15):17361-17371.
[32] BLAINE J, DYLEWSKI J. Regulation of the Actin Cytoskeleton in Podocytes. Cells. 2020;9(7):1700.
[33] SUN Y, LIU X, TAN J, et al. Strontium ranelate incorporated 3D porous sulfonated PEEK simulating MC3T3-E1 cell differentiation. Regen Biomater. 2020;8(1):rbaa043.
[34] WANG X, CHEN T, DENG Z, et al. Melatonin promotes bone marrow mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and prevents osteoporosis development through modulating circ_0003865 that sponges miR-3653-3p. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):150.
[35] LI Q, LU F, CHEN T, et al. VPS4B mutation impairs the osteogenic differentiation of dental follicle cells derived from a patient with dentin dysplasia type I. Int J Oral Sci. 2020;12(1):22.
[36] CHEN Y, HU Y, YANG L, et al. Effects of Different Concentrations of Glucose on the Osteogenic Differentiation of Orofacial Bone Mesenchymal Stem Cells. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2016; 47(5):679-684.
[37] JAFARY F, HANACHI P, GORJIPOUR K. Osteoblast Differentiation on Collagen Scaffold with Immobilized Alkaline Phosphatasec Int J Organ Transplant Med. 2017;8(4):195-202.
[38] VARMA SR, SHARATH KUMAR LM, VIDYASHANKAR S, et al. Water Soluble Components of ‘Osteocare’ Promote Cell Proliferation, Differentiation, and Matrix Mineralization in Human Osteoblast-Like SaOS-2 Cells. Sci Pharm. 2014;82(2):375-391.
[39] HUH JE, YANG HR, PARK DS, et al. Puerariae radix promotes differentiation and mineralization in human osteoblast-like SaOS-2 cells. J Ethnopharmacol. 2006;104(3):345-350.
[40] CHIEN HH, LIN WL, CHO MI. Expression of TGF-beta isoforms and their receptors during mineralized nodule formation by rat periodontal ligament cells in vitro. J Periodontal Res. 1999;34(6):301-309.
[41] YE G, LI C, XIANG X, et al. Bone morphogenetic protein-9 induces PDLSCs osteogenic differentiation through the ERK and p38 signal pathways. Int J Med Sci. 2014;11(10):1065-1072.

引言

骨组织工程三要素中，支架材料既可以作为种子细胞的生长载体，为细胞提供营养和代谢的化学环境和物理支撑；同时也可作为生长因子的附着体，促进生长因子对细胞生命活动的调控，因此，理想的骨组织工程支架对组织再生及功能重建有着重要的影响。支架的内部结构决定其物理性质和机械性能，主要包括支架材料类型、孔径及孔隙率等，其中孔径是评估支架材料物理性能的重要因素。大多数支架孔径均一，具有较高的孔隙率，但在细胞培养过程中细胞不易存留于支架上，降低了支架上的活细胞密度[1]。因此，美国康涅狄克大学的研究人员提出构建一种底部致密、表面为疏松网格状结构的支架，减少细胞流失[2]。
孔径大小与细胞在支架内进行营养输送及代谢物排出的效率息息相关，进一步影响细胞的增殖、黏附等一系列生命活动。研究表明，支架孔径范围为100-200 μm适合于软骨修复；大于300 μm，促进血管内皮细胞长入，利于供给营养物质及骨细胞生长、增殖、分化等一系列的生命活动。有报道显示，孔径范围为300-400 μm时适合于成骨修复，但随孔径增大支架的力学性能有所下降，因此在孔径与机械性能之间寻求一个最佳平衡点，成为组织工程支架研究的关键[3]。另有研究表明，当细胞密度和氧消耗较大时支架仅将营养物质及氧气供给支架表层，致使表层细胞密度增大、空间减少，营养物质供不应求，代谢产物堆积，从而影响细胞生命活动[4]。因此，保证支架内营养物质输送及代谢产物排出仍是困扰已久的难题。
天然骨本身内部结构不均匀，外层为致密的骨皮质，内部为疏松多孔的骨松质，即梯度结构。骨组织的这种梯度结构对于保证生物组织行使正常功能至关重要，因此充分模拟天然骨组织结构，对骨组织工程支架材料的开发具有重要意义。ZHANG等[5]采用热诱导相分离法制备了具有梯度结构的聚乳酸支架，实验证明梯度支架有利于控制细胞间环境和细胞-基质的相互作用。SHI等[6]研制一种经多巴胺改性的海藻酸盐，复合以季铵化壳聚糖为模板的羟基磷灰石，并与钙离子交联制备的多孔梯度支架，该梯度支架具有良好的成骨活性，能有效促进骨组织再生，加速体内骨缺损的修复，人类软骨细胞和成纤维细胞在该支架上可以很好地黏附和生长。研究表明，梯度支架从外到内的氧张力较均匀支架明显降低，为梯度支架促进细胞生命活动提供了有利的支撑[2]。因此，充分模拟天然骨组织的梯度结构对开发骨修复支架具有重要意义[7]。
经相关学者研究证实，蜡球可通过挤压变形，再利用改良型粒子浸出法可控制支架的孔径大小、形态，且具有较好的贯通性，这些优势均为骨组织工程奠定了良好的基础[8]。为寻求孔径及力学性能二者的最佳结合点，按照之前的探索，此次实验采用蜡球为造孔剂的改良型粒子浸出法构建一种外大内小的梯度支架，将其内层孔径设置为约100 μm，外层约400 μm，与均匀支架进行对比，探讨孔径、孔隙率间的差异，各支架分别与SD大鼠颅骨MC3T3-E1细胞共培养，探讨其对MC3T3-E1细胞生物学性能的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性细胞实验，组间比较单因素方差分析法。
1.2 时间及地点实验于2020年9月至2021年3月在西南医科大学口腔医学院口颌面修复重建与再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 MC3T3-E1细胞，购于南京科佰生物科技有限公司。
1.3.2 实验试剂甲壳素、聚乙烯醇(国家集团化学试剂有限公司，中国)；无水乙醇(上海麦克林生化科技有限公司，中国)；纳米羟基磷灰石(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)；普通石蜡(实验室购买)；无水氯化锂(上海巨枫化学科技有限公司，中国)；α-MEM培养基、胰蛋白酶粉(HyClone公司，美国)；1 mol/L Tris-HCl(江苏康为世纪生物科技有限公司，中国)；多聚甲醛、EDTA(国药集团有限公司，中国)；青霉素-链霉素、胎牛血清、PBS缓冲液干粉(GIBCO公司，美国)；碱性磷酸酶染色试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；茜素红(Sigma公司，美国)。
1.3.3 实验主要设备超净工作台(苏州净化设备公司，中国)；高清数码相机、倒置荧光显微镜(Nikon公司，日本)；JSM-7500F扫描电子显微镜(陕西奥普森检测科技有限公司，中国)；pH计(梅特勒公司，瑞士)；恒温水浴锅(江苏精仪有限公司，中国)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(秋佐科技，中国)；JJ-1精密定时电动搅拌器(上海泽生科技开发有限公司，中国)；XY1000-2S电子天平(Sartorius公司，德国)；细胞培养瓶(康宁公司，美国)；CO2培养箱(Thermo公司，德国)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(成都瑞派斯科技有限公司，中国)；XL-3马弗炉(上海均珂仪器科技有限公司，中国)；流式细胞仪(BD FACS Vantage SE，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 以蜡球为造孔剂制作不同孔径的目标支架
蜡球制备：溶解2%聚乙烯醇，加入蒸馏水匀速搅拌，60 ℃水浴，制得聚乙烯醇溶液。另外，溶解一定量的蜡烛液体，将其加入聚乙烯醇溶液中，记录搅拌速度，搅拌溶液直至蜡烛液体完全分散开。通过把烧杯置于冰水之中冷却，蜡烛液体随即凝固。去离子水冲洗过滤，干燥过夜。由于蜡球的直径不同，过筛，依据蜡球直径进行分组，分别为300，500，800 μm。
羟基磷灰石溶胶制备：溶解无水氯化锂，加二甲基乙酰胺，密封后搅拌，制得溶液质量浓度为50 g/L。溶液中加入甲壳素，浓度1%，密封后搅拌24 h，制得半透明溶胶，流动性减小。向溶胶中加入15 g/L的羟基磷灰石[9]，密封后电动搅拌24-48 h，直至溶胶中的粉末均匀分散，然后静置。
纳米羟基磷灰石支架的压制：将不同直径的蜡球注入特制的模具中，依据添加蜡球直径不同[300 μm、500 μm、800 μm、Gradient(梯度)]进行分组。D300、D500、D800组中分别为对应孔径的均一蜡球，D-Gradient组则以300，500，800 μm的蜡球依次堆积，使中央孔径为300 μm、外层孔径为800 μm孔径，对4组模具施加相同压力使蜡球间形成面面接触，置于电热恒温鼓风干燥箱内25-30 ℃过夜。
选择适量的羟基磷灰石溶胶注入管内，加入制备好的蜡球模型，倒置模具后施加一定的压力，使羟基磷灰石溶胶进入蜡球间的空隙中。将模具底面置于无水乙醇30 min。把模具中样品浸入无水乙醇，12 h后凝固成型再取出。将样品浸于正己烷溶液中65 ℃水浴，去除内部石蜡，每隔1 h换液，6次后晾干。再浸于去离子水中，65-100 ℃，隔30-40 min换液一次，直至氯化锂完全去除。使用硝酸银溶液滴定，有沉淀生成则说明溶液中仍有氯化锂。反复浸入去离子水中，直至溶液无沉淀。取出样品后100 ℃干燥，然后烧结样品制得不同孔径的目标支架，升温条件为：5 ℃/min升温，100 ℃2 h，300 ℃2 h，1 200 ℃2 h。
1.4.2 各组支架材料的性能表征通过多次测定不同转速，观察其与蜡球成型间的关系。通过X射线衍射仪检测物相成分，扫描电子显微镜观测支架内部结构，支架内孔径大小及分布情况通过Nano Measurer 1.2进行检测。采用乙醇替代法测不同孔径支架的孔隙率[10]，每组至少选取5个支架，重复测量至少3次，以减少误差。
乙醇替代法：称量相同体积的圆柱形支架，记为m干，再把支架置于无水乙醇中，施加负压直至无气泡时停止，去除表面多余乙醇，称量质量，记为m湿。把支架置于25 mL量筒中，移液枪加入无水乙醇至15 mL刻度线处，乙醇的量记为V乙醇。孔隙率计算公式：

其中，ρe为乙醇密度，乙醇密度为0.79 g/mL。

1.4.3 细胞培养及实验分组在37 ℃、湿润空气(体积分数5%CO2)条件下，将MC3T3-E1细胞培养于含体积分数10%热灭活胎牛血清的α-MEM培养液中。当细胞融合占比达80%时开始传代培养。取第4-6代的MC3T3-E1细胞，分别接种于4组支架上，细胞数量为2×105，设置单独培养的细胞为空白对照组，置于培养液中培养。
1.4.4 各组支架上MC3T3-E1细胞增殖指数测定细胞接种于支架24 h后，以PBS洗涤，之后在4 ℃体积分数70%乙醇溶液中保存。转移至离心机中，2 000 r/min离心10 min，收集细胞。PBS漂洗后再加入1 mL PBS。加入RNAse(10 g/L)20 μL，37 ℃培养30 min，加入50 μL吡啶碘化物，避光条件下继续进行细胞培养。30 min后通过流式细胞仪，结合Cell Quest软件(Becton Dickinson)检测分析细胞周期阶段。细胞增殖指数(PI)计算公式为：PI%=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]%，其中S、G2/M和G0/G1分别代表在G0、G1期、S期、G2期和M期的细胞数[9]。
1.4.5 各组支架上MC3T3-E1细胞分泌碱性磷酸酶的测定细胞接种于支架24 h后，加入冰点裂解缓冲液，提取上清，放入离心机，14 000 r/min离心10 min。随后，通过碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，多功能酶标仪(Bio-Rad)测定吸光度值，碱性磷酸酶活性和蛋白浓度测定(波长分别在490，570 nm)。
1.4.6 各组支架上MC3T3-E1细胞骨架形态和黏着斑检测细胞接种于支架48 h后，将MC3T3-E1细胞-支架复合物置于含有40 g/L多聚甲醛的PBS中培养30 min，在含有体积分数0.25%Triton X-100的PBS中渗透10 min。向其中加入1%牛血清白蛋白，与MC3T3-E1细胞持续孵化1 h。孵化抗黏着斑蛋白抗体60 min，观察并染色黏着斑；FITC结合的抗鼠免疫球蛋白二级抗体孵育60 min；Rhodamine-Phalloidin染色F-肌动蛋白60 min；孵育染色细胞核10 min。清洗后置于甘油上，立即在倒置荧光显微镜下观察，每次测定保持所用的激发光强度一致，以便后续分析荧光强度。

1.4.7 qRT-PCR法检测各组支架上MC3T3-E1细胞的成骨相关基因表达细胞接种于支架24 h后，利用RNA总提取试剂盒分离提取细胞总RNA，参照Revertaid第一链cDNA合成试剂盒的使用说明，取适量总RNA反转录合成cDNA。按照说明书，采用ABI 7500 系统(Scandrop，JENA，德国)，参照SYBR PCR 组合试剂盒进行RT-PCR反应，反应条件：45 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃5 min，1个循环；95 ℃10 s，40个循环；58 ℃45 s，40个循环；熔解曲线条件：95 ℃15 s，60 ℃1 min。主引物设计，见表1。采用标记基因GAPDH逐个标准化mRNA表达水平，基于循环阈值(CT)进行量化。

1.5 主要观察指标各组支架孔径、孔隙率差异，各组支架上MC3T3-E1细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、黏着斑及细胞骨架形态、成骨分化标志性因子转录水平。
1.6 统计学分析实验数据用x±s(所有实验中n≥6)来表示。采用Image-Pro Plus 6.0处理图像数据，OriginPro 8.0软件作图。应用软件SPSS 17.0对实验中的数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，置信区间设置为0.05。

讨论

组织工程骨是目前治疗骨缺损的前沿手段，促进种子细胞的正常生命活动，主要得益于骨组织工程支架良好的物理特性，其中支架内部结构的优化是改善其物理性能的重要手段，进而对组织工程骨的生物力学行为产生重要影响[12-15]。因此，支架材料的物理结构成为研究的热点及重点，其中孔径的大小、孔隙率及贯通率对骨组织工程支架具有重要意义[16]。多年来关于支架最佳孔径的报道一直存在争议，ROMAN等[3]提出适合骨再生最优孔径支架为100-400 μm，大于300 μm利于骨组织中的血管化，300-400 μm骨传导率最佳[17-22]；有学者报道孔隙率40%-70%均有利于体外成骨。但是对于常规均一结构支架，由于细胞间争夺营养，使支架外围细胞密度较高，营养物质供不应求，代谢产物堆积，不利于细胞的生物学行为。为解决这一问题，AMINI等[2]提出构建梯度结构氧张力控制支架，实验结果表明从外到内的氧气张力及pH值梯度较均匀支架明显降低。天然骨骼同样具有由外向内径向梯度结构[17]，骨骼外部结构致密，内部疏松[23-24]，依靠中央血管提供营养，体外培养则相反，营养物质及氧气主要来自于外周，为组织工程支架设计成孔径外大内小这一论点提供有利支持。GOH等[25]应用蜡球溶出技术制备特定直径的蜡球，溶解后形成多孔聚合物支架，孔径均匀，相互联通，孔隙度达90%。KUBOKI等[22]开发了一种构建高度互连多孔羟基磷灰石支架的方法，不同尺寸蜡球制备支架孔隙率几乎相同，约为86%，而抗压强度随孔径增大而减小[26]，通过该方法有效调整孔隙率与孔径的平衡点。
因此，此次实验采用蜡球溶出技术制作梯度孔径目标支架，梯度支架孔径外大内小，外层约400 μm，适合骨形成及血管长入，平均孔径300-400 μm，向内逐渐减小至100 μm左右，孔隙率>70%，达到实验预期。实验结果表明，适合MC3T3-E1增殖的孔径大小为350-400 μm，合适的孔径大小，一方面可以促进细胞与支架充分接触产生目标效应，另一方面又可以为氧气等营养物质运输及代谢废物排出提供通道，同时可为细胞增殖提供空间。D-Gradient组支架外大内小的孔径结构使MC3T3-E1细胞增殖指数最高，细胞增殖活跃。同时，随着支架孔径的增大贯通孔也随之增大，细胞通过贯通孔到达支架深层。D-Gradient组孔径外大内小，一方面有助于细胞在深层诱导成骨矿化，另一方面加速代谢废物的排出，防止细胞竞争有限的空间，促进MC3T3-E1细胞的生长、增殖、分化等，促进骨修复。
合适的多孔结构利于细胞的黏附[27]。有研究表明蛋白质吸附与细胞黏附呈正相关，而支架材料表面的微孔为100 nm-10 μm时蛋白质的吸附力增强[28-30]。此次实验的各支架材料表面结构无明显差异，实验结果表明大孔径组MC3T3-E1细胞黏附略高于小孔径组，原因可能在于：大孔径支架吸附基质的蛋白质较小孔径多；支架材料-细胞之间黏附和铺展的能力与细胞黏着斑和肌动蛋白息息相关[31-32]，D-Gradient组有最多量的黏着及更清晰的肌动蛋白纤维。MC3T3-E1细胞的分化以分泌碱性磷酸酶为早期表现，在细胞增殖后期碱性磷酸酶的分泌逐渐增加[33-36]，支架孔径越小细胞生长易相互接触，促进细胞分化。因此，此次实验结果示D300组的碱性磷酸酶活性明显高于其他组，表明小孔径的支架利于MC3T3-E1细胞的分化和碱性磷酸酶的分泌[37]。实验中D-Gradient组支架内部孔径逐渐减小，进而促进MC3T3-E1细胞分化的能力增强。碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白的产生在成骨作用中发挥重要作用[37-41]，此次实验证实，较小孔径的支架对MC3T3-E1细胞分化的促进作用更为理想，其中D-Gradient和D500组促进成骨细胞分化的能力相近，而D800组相比于空白对照组并没有明显的变化。
综上所述，此次实验制备的孔径梯度羟基磷灰石支架对MC3T3-E1细胞的黏附和铺展、增殖及成骨分化等生物学行为有积极影响，具有良好的体外促进MC3T3-E1细胞成骨效果，为研发促进骨组织修复再生的支架材料开辟了新篇章。日后可通过扩大观察对象范围、延长观察时间使研究更具说服力，同时结合体内实验评估孔径梯度支架对骨修复更深远的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

不同孔径梯度纳米羟基磷灰石三维支架制备及对MC3T3-E1生物学性能的影响

Effect of hydroxyapatite three-dimensional scaffolds with different apertures on the biological properties of MC3T3-E1 cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 10

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[2]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[3]	黄涛, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 方丽萍, 翟文静, 翟莎菲, 周永新. LncRNA-HOTAIR可调节脂肪间充质干细胞向成骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3951-3955.
[4]	陈迟迟, 张雨, 何家辰, 施勤. 肥胖小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3846-3851.
[5]	尤武林, 黄桂成, 王建伟. 微囊化转基因骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养后的成骨分化潜能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3852-3857.
[6]	崔寅鹏, 郭艾, 马立峰, 刘振江. 哇巴因体外诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3796-3801.
[7]	金珂, 吴晓玲, 罗小玲, 胥鹏飞, 徐晓梅. 雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化及通路间的交叉串扰[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3886-3891.
[8]	余春波, 李大玉, 范芳, 李长福. 脂肪干细胞成骨分化的转录因子-miRNA-mRNA网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3908-3913.
[9]	刘名, 王凯. 茶黄素-3,3’-没食子酸酯修饰的纳米羟基磷灰石/聚已内酯复合多孔支架修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3480-3486.
[10]	孟露露, 刘浩, 刘涵, 张军, 李瑞欣, 高丽兰. 基于低温3D打印丝素蛋白/Ⅰ型胶原/羟基磷灰石支架的力学性能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3550-3555.
[11]	孟增东, 朱斌 , 张亚楠, 罗丽琳 , 张玉勤 . 不同孔隙率多孔ZnO/羟基磷灰石复合材料的力学性能与生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3498-3504.
[12]	郭晓鹏, 刘莹松, 尚晖. 丝素蛋白/纳米羟基磷灰石/淫羊藿苷可促进移植骨髓间充质干细胞增殖分化为髓核样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3528-3534.
[13]	刘龙珠, 龙远铸, 杨成雪, 仲欣琪, 汪一芳, 刘建国. 氨基改性人造颌骨纳米羟基磷灰石/聚乳酸复合材料的制备与表征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3319-3326.
[14]	王金斯, 王胜法, 吴柱国, 何晓玲, 王馨钰, 罗小钰, 招轶, 张静莹. 基于三周期极小曲面β-磷酸三钙仿生骨支架设计和生物活性的检测[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3291-3297.
[15]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.