茶黄素-3,3’-没食子酸酯修饰的纳米羟基磷灰石/聚已内酯复合多孔支架修复骨缺损

doi:10.12307/2022.274

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (22): 3480-3486.doi: 10.12307/2022.274

• 组织工程骨材料Tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

茶黄素-3,3’-没食子酸酯修饰的纳米羟基磷灰石/聚已内酯复合多孔支架修复骨缺损

刘名，王凯

青海省人民医院骨科一病区，青海省西宁市 810000

收稿日期:2020-12-29 修回日期:2021-01-26 接受日期:2021-06-06 出版日期:2022-08-08 发布日期:2022-01-11
通讯作者: 王凯，主任医师，青海省人民医院骨科一病区，青海省西宁市 810000
作者简介:刘名，1978年生，吉林省吉林市人，汉族，医学硕士，副主任医师，主要从事创伤骨科和脊柱外科的临床与基础研究。

Theaflavin-3-gallate modified nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite porous scaffold in bone defect repair

Liu Ming, Wang Kai

First Department of Orthopedics, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810000, Qinghai Province, China

Received:2020-12-29 Revised:2021-01-26 Accepted:2021-06-06 Online:2022-08-08 Published:2022-01-11
Contact: Wang Kai, Chief physician, First Department of Orthopedics, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810000, Qinghai Province, China
About author:Liu Ming, Master, Associate chief physician, First Department of Orthopedics, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810000, Qinghai Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
茶黄素：是红茶提取物，由多酚类及其衍生物氧化缩合而来，在1957年由ROBERTS等首先报道，约含12种组分，具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化、抗病毒、抗突变及抗心脑血管疾病等多种药理功效，是一类极具开发潜力的天然产物。其中茶黄素-3,3’-没食子酸酯为茶黄素的主要成分之一。
纳米羟基磷灰石/聚已内酯复合多孔支架：聚己内酯具有良好的生物相容性、成本低、易加工与降解速率可控等诸多优势，但是其亲水性较差，单独应用于骨组织工程中存在生物活性不足的缺点。纳米羟基磷灰石具有良好的生物相容性、机械性能、生物活性与骨诱导性能等，可诱导种子细胞的生长、增殖与分化。所以，纳米羟基磷灰石/聚己内酯不仅具有良好的生物活性，同时具有良好机械性能，可作为骨组织工程支架应用。

背景：茶黄素-3,3’-没食子酸酯(theaflavin-3-gallate，TF-3G)可明显抑制骨吸收，在预防骨质疏松方面具有明显的效果，但是将其应用于成骨方面的研究并不多见。
目的：将TF-3G负载于纳米羟基磷灰石/聚己内酯(nano-Hydroxyapatite/Polycaprolactone，nHA/PCL)复合支架中，观察其成骨作用。
方法：配制不同质量浓度的TF-3G溶液，通过CCK-8实验检测其细胞毒性。根据细胞毒性实验结果选择适宜质量浓度(0，0.86，4.30，8.60，17.20，34.4，68.8，86，106 mg/L)的TF-3G溶液干预骨髓间充质干细胞，采用CCK-8法检测其成骨分化过程中的增殖活性。选择一定质量浓度的TF-3G溶液诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，进行碱性磷酸酶活性检测与茜素红染色。利用选择性激光烧结快速成型技术制备nHA/PCL复合多孔支架，采用溶液浸渍与冷冻干燥法将TF-3G负载于nHA/PCL复合多孔支架中。在成年新西兰大白兔桡骨部位制作1.5 cm的骨缺损，空白对照组不植入任何材料，两实验组分别植入nHA/PCL、TF-3G/nHA/PCL复合多孔支架，术后分别进行影像学检查与组织学观察。
结果与结论：①CCK-8检测显示，0.86，4.30，8.60 mg/L的TF-3G可促进骨髓间充质干细胞的增殖，17.20，34.4，68.8，86，106 mg/L的TF-3G抑制骨髓间充质干细胞的增殖，选择0.86，4.30，8.60 mg/L质量浓度进行骨诱导实验。②碱性磷酸酶活性检测与茜素红染色显示，随着TF-3G溶液质量浓度的增加，促成骨效果增强。③术后4，12周的Lane-Sandhu X射线评分显示，两支架组高于空白对照组(P < 0.05)，并且TF-3G/nHA/PCL组高于nHA/PCL组(P < 0.05)。④术后12周，结合苏木精-伊红、Masson染色结果进行Huddleston组织学评分，两支架组高于空白对照组(P < 0.05)，并且TF-3G/nHA/PCL组高于nHA/PCL组(P < 0.05)。⑤结果表明，TF-3G可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，负载TF-3G的nHA/PCL复合多孔支架可促进骨缺损的修复。
缩略语：茶黄素-3,3’-没食子酸酯：theaflavin-3-gallate，TF-3G；纳米羟基磷灰石/聚己内酯：nano-Hydroxyapatite/Polycaprolactone，nHA/PCL

https://orcid.org/0000-0002-7821-1559 (刘名)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 茶黄素, 茶黄素-3,3’-没食子酸酯, 纳米羟基磷灰石, 聚已内酯, 支架, 骨缺损, 骨修复

Abstract: BACKGROUND: Theaflavin-3-gallate (TF-3G) can significantly inhibit bone resorption and has obvious effects on preventing osteoporosis, but its application on osteogenesis is rare.
OBJECTIVE: TF-3G was loaded into nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite scaffold to observe its osteogenic effect.
METHODS: TF-3G solution of different mass concentrations was prepared. The cytotoxicity of TF-3G was detected by CCK-8 assay. According to cytotoxicity test results, bone marrow mesenchymal stem cells were intervened by TF-3G solution of appropriate mass concentration (0, 0.86, 4.30, 8.60, 17.20, 34.4, 68.8, 86, 106 mg/L). CCK-8 assay was used to detect its proliferative activity during osteogenic differentiation. A certain concentration of TF-3G solution was selected to induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate towards osteogenic direction, and alkaline phosphatase activity detection and alizarin red staining were performed. Nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite porous scaffold was prepared using selective laser sintering rapid prototyping technology. TF-3G was loaded into nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite porous scaffold by solution impregnation and freeze-drying. A 1.5 cm bone defect was made in the radius of adult New Zealand white rabbits. The blank control group was not implanted with any material. The two experimental groups were implanted with nano-hydroxyapatite/polycaprolactone, and TF-3G/nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite porous scaffold. The imaging examination and histological observation were performed after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay showed that 0.86, 4.30, 8.60 mg/L TF-3G promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells; 17.20, 34.4, 68.8, 86, 106 mg/L TF-3G inhibited the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells; 0.86, 4.30, 8.60 mg/L mass concentration was chosen for osteoinduction experiment. (2) Alkaline phosphatase activity detection and alizarin red staining showed that with the increased mass concentration of TF-3G solution, the bone formation effect was enhanced. (3) Lane-Sandhu X-ray scores at 4 and 12 weeks after operation in the two experimental groups were higher than those in the blank control group (P < 0.05), and the scores were higher in the TF-3G/nano-hydroxyapatite/polycaprolactone group than those in the nano-hydroxyapatite/polycaprolactone group (P < 0.05). (4) At 12 weeks after operation, combined with the results of hematoxylin-eosin staining and Masson staining, Huddleston histological score of the two experimental groups was higher than that of the blank control group (P < 0.05), and the score in the TF-3G/nano-hydroxyapatite/polycaprolactone group was higher than that of the nano-hydroxyapatite/polycaprolactone group (P < 0.05). (5) Results concluded that TF-3G can promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite porous scaffold loaded with TF-3G can promote the repair of bone defects.

Key words: theaflavin, theaflavin-3-gallate, nano-hydroxyapatite, polycaprolactone, scaffold, bone defect, bone repair

中图分类号:

刘名, 王凯. 茶黄素-3,3’-没食子酸酯修饰的纳米羟基磷灰石/聚已内酯复合多孔支架修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3480-3486.

Liu Ming, Wang Kai. Theaflavin-3-gallate modified nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite porous scaffold in bone defect repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(22): 3480-3486.

图/表（结果） 10

2.1 TF-3G的细胞毒性培养72 h后CCK-8检测结果显示，0.86，4.30，8.60，17.20，34.4，68.8，86，106，126，146 mg/L TF-3G溶液组的相对细胞增殖率分别为95.35%，107.35%，118.09%，125.34%，110.72%，93.27%，88.79%，74.13%，68.13%，59.23%，显示0.86-86 mg/L TF-3G溶液的毒性分级为0级，106 mg/L TF-3G溶液的毒性为1级，而126，146 mg/L TF-3G溶液的细胞毒性为2级；阴性对照组的相对细胞增殖率为98.62%，阳性对照组为11.38%，说明此次实验结果符合细胞毒性反应国家分级标准。
2.2 TF-3G对细胞增殖活性的影响培养第1天时，各组之间细胞增殖活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第3天时，34.4，68.8，86，106 mg/L组的细胞增殖活性低于0 mg/L组(P < 0.05)，其余各浓度组细胞增殖活性与0 mg/L组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第5天时，4.30，8.60 mg/L组的细胞增殖活性高于0 mg/L浓度组(P < 0.05)，17.20，34.4，68.8，86，106 mg/L组的细胞增殖活性低于0 mg/L组(P < 0.05)，0.86 mg/L组的增殖活性与0 mg/L组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，并且8.60 mg/L组细胞增殖活性高于0.86，4.30 mg/L组(P < 0.05)；培养第7天时，0.86，4.30，8.60 mg/L组的细胞增殖活性高于0 mg/L组(P < 0.05)，17.20，34.4，68.8，86，106 mg/L组的细胞增殖活性低于0 mg/L组(P < 0.05)，并且8.60 mg/L组的细胞增殖活性高于0.86，4.30 mg/L组(P < 0.05)，见表3。各组细胞增殖情况见图1。

2.3 TF-3G的促成骨作用根据细胞增殖活性实验结果，选择0，0.86，4.30，8.60 mg/L的TF-3G溶液进行成骨诱导实验。碱性磷酸酶染色显示骨髓间充质干细胞被染成黑色，并且随着培养时间的延长染色逐渐加深，同一时间下随着TF-3G溶液质量浓度的增加而颜色加深，见图2。定量分析结果显示，培养第7，10天时，0.86，4.30，8.60 mg/L组的碱性磷酸酶活性均高于0 mg/L组(P < 0.05)，同时8.60 mg/L组高于0.86，4.30 mg/L组(P < 0.05)。

培养21 d后的茜素红染色显示骨髓间充质干细胞被染成橙红色，随着TF-3G溶液质量浓度的升高颜色加深，见图3。定量分析结果显示，4组间矿物沉积比较差异有显著性意义(P < 0.05)，其中以8.60 mg/L组的矿物沉积最多。

2.4 nHA/PCL复合多孔支架微观形貌大支架观可见nHA/PCL复合多孔支架呈现十字交叉网格结构，见图4A。扫描电镜下观察支架的横切面和纵切面可见，支架内部为多孔的网状结构，孔与孔之间相互连接沟通，见图4B。

2.5 TF-3G修饰支架的缓释性能由图5可见，在最初的12-24 h内TF-3G存在突释现象，3 d之后TF-3G的释放趋于平稳，至28 d时TF-3G的累积释放率在57%左右，说明TF-3G修饰的支架具有一定的缓释性能。

2.6 复合多孔支架体内修复骨缺损实验结果
2.6.1 影像学观察 X射线片检查显示，空白对照组术后4周时可见骨缺损部位低密度影，缺损断端较清晰；术后12周时骨缺损部位仍呈较低密度影，与术后4周时相比无明显变化，断端骨髓腔已闭合。nHA/PCL组术后4周时可见骨缺损部位较低密度影，与周围骨质界限清晰可见；术后12周时骨缺损部位密度较术后4周时升高，与周围骨质界限仍清晰。TF-3G/nHA/PCL组术后4周时骨缺损部位密度高于nHA/PCL组，术后12周时骨缺损部位密度进一步增高，与周围骨质界限模糊。3组术后的X射线片检查图像，见图6。

术后4，12周的Lane-Sandhu X射线评分显示，3组间评分比较差异有显著性意义，两实验组高于空白对照组(P < 0.05)，并且TF-3G/nHA/PCL组的评分高于nHA/PCL组(P < 0.05)，见图6。
2.6.2 组织学观察结合苏木精-伊红染色、Masson染色结果可见，空白对照组骨缺损部位未见明显的骨样组织，可见极少量的血管与结缔组织；nHA/PCL组骨缺损部位可见成熟度较低的骨基质，部分区域可见较多软骨组织；TF-3G/nHA/PCL组骨缺损部位可见成熟度较高的骨基质，见图7。

Huddleston组织学评分结果显示，3组间评分比较差异有显著性意义，两实验组高于空白对照组(P < 0.05)，并且TF-3G/nHA/PCL组高于nHA/PCL组(P < 0.05)，见图8。

2.7 复合多孔支架的生物相容性由动物体内骨缺损修复组织学结果可知，TF-3G/nHA/PCL复合多孔支架具有良好的生物相容性。

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引言

临床骨缺损主要通过骨移植手术进行修复，自体骨移植虽然排异反应小，但是来源有限且术后并发症较多；异体骨移植虽然来源广泛，但是排异反应较大，严重影响了移植手术的成功率[1-3]。近年来飞速发展的骨组织工程为骨缺损修复带来了希望。
骨组织工程包含种子细胞、支架与生长因子三大要素[4-5]，其中的支架在骨组织工程中至关重要，支架不仅可为细胞的生存提供良好的三维空间，还可以支持细胞的增殖、黏附与分化。因此，良好的支架材料必须具备良好的生物相容性、骨诱导与骨传导性能，可控的生物降解速率，足够的力学强度，相互连通的孔隙结构等。聚己内酯具有良好的生物相容性、成本低、易加工与降解速率可控等诸多优势[6-7]，但是其亲水性较差，单独应用于骨组织工程中存在生物活性不足的缺点，多与其他材料复合用于骨组织工程支架中[8-9]。纳米羟基磷灰石具有良好的生物相容性、机械性能、生物活性与骨诱导性能等，可诱导种子细胞的生长、增殖与分化[10-11]。所以，纳米羟基磷灰石/聚己内酯(nano-Hydroxyapatite/Polycaprolactone，nHA/PCL)不仅具有良好的生物活性，同时具有良好机械性能，可作为骨组织工程支架应用。胡超然等[12]的体外研究显示，nHA/PCL复合支架具有良好的孔隙结构、力学性能与细胞相容性，在骨组织工程领域应用前景广阔。NAUDOT等[13]研究证实nHA/PCL复合支架与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性，将二者结合应用于动物体内颅骨缺损修复中可显著提升骨体积与矿化再生，具有较大的临床应用潜力。
茶黄素是红茶提取物，由多酚类及其衍生物氧化缩合而来，在1957年由ROBERTS等[14]首先报道，约含12种组分，具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化、抗病毒、抗突变及抗心脑血管疾病等多种药理功效，是一类极具开发潜力的天然产物。尚希福等[15]通过体外实验观察茶黄素对人骨髓间充质干细胞的成骨诱导作用，钙结节、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素免疫组化染色证实，茶黄素可促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。赵传勇等[16]观察了骨髓间充质干细胞联合茶黄素治疗大鼠激素性股骨头坏死的效果，相比于单纯减压组和细胞移植组，采用骨髓间充质干细胞基础上联合茶黄素可促进新骨生成。其中茶黄素-3，3’-没食子酸酯(theaflavin-3-gallate，TF-3G)为茶黄素的主要成分之一，TF-3G可作用于机体多种细胞，其可清除体内自由基，发挥抗氧化作用；具有免疫调节与潜在的抗炎作用；可抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。OKA等[17]研究显示，TF-3G可通过下调金属蛋白酶的表达来抑制破骨细胞的形成与分化，抑制骨吸收，在预防骨质疏松方面具有明显的效果。尽管研究显示TF-3G可明显抑制骨吸收，但是将其应用于成骨方面的研究并不多见。因此，实验将TF-3G负载于nHA/PCL复合支架中，观察其成骨作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，构建兔骨缺损模型体内实验，组间两两比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年12月至2020年12月在青海省人民医院完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料、试剂与仪器 TF-3G(纯度为95%-99%，相对分子质量为868.709)购自成都普瑞法科技开发有限公司；聚己内酯购自苏州启航生物科技有限公司；纳米羟基磷灰石(纯度为99.999%)购自北京高科新材料科技有限公司；兔骨髓间充质干细胞购自赛业生物科技有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清及成骨诱导培养基购自南京生航生物技术有限公司；细胞培养箱(型号：BJPX-100)购自济南欧莱博科学仪器有限公司；CCK-8试剂购自北京赛文创新生物科技有限公司；病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司；DR拍片机(型号：DR7500)购自日本柯达；脱水机、包埋机购自武汉俊杰电子有限公司。
1.3.2 实验动物成年雄性新西兰大白兔48只，体质量2.4-2.6 kg，购自青海省药品检验检测院，使用许可证号为：SYXK(青)2019-0001。将48只兔随机分成3组，空白对照组、nHA/PCL组、TF-3G/nHA/PCL组，每组16只。动物实验获得青海省人民医院伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 TF-3G的细胞毒性称取适量的TF-3G，加入含有体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基内，使其浓度分别为0.86，4.30，8.60，17.20，34.4，68.8，86，106，126，146 mg/L。将生长状态良好的P3代骨髓间充质干细胞悬液接种于96孔板内，每孔接种细胞浓度为1×107 L-1，随机分组处理，阴性对照组加入RPMI-1640培养基，受试溶液组分别加入0.86，4.30，8.60，17.20，34.4，68.8，86，106，126，146 mg/L的TF-3G溶液，阳性对照组加入5%DMSO溶液，空白组仅加入RPMI-1640培养基(无细胞)，每孔加液100 µL，每组6复孔。置于37 ℃、体积分数5%CO2培养内培养。在设定的时间点取出96孔板，每孔加入10 µL的CCK-8试剂，置于培养箱内继续培养1 h，在450 nm波长处检测各孔吸光度值。
根据吸光度值计算相对细胞增殖率，相对细胞增殖率=实验组吸光度值/空白组吸光度值×100%，若相对细胞增殖率为100%，说明细胞毒性为0级，在75%-99%之间为1级，在50%-74%之间为2级，在25%-49%之间为3级，在1%-24%之间为4级，0%为5级。毒性为0或1级说明材料的细胞毒性低，生物相容性良好。
1.4.2 TF-3G对细胞增殖活性的影响称取适量的TF-3G，加入成骨诱导培养基内，使其质量浓度分别为0，0.86，4.30，8.60，17.20，34.4，68.8，86，106 mg/L。将生长状态良好的P3代骨髓间充质干细胞悬液接种于96孔板内，接种细胞浓度为1×107 L-1，分别加入含0，0.86，4.30，8.60，17.20，34.4，68.8，86，106 mg/L TF-3G的成骨诱导培养基，每孔加液100 µL。空白孔仅加入培养基。置于37 ℃、体积分数5%CO2培养内培养。在设定的时间点取出96孔板，每孔加入10 µL的CCK-8试剂，在450 nm波长处检测各孔吸光度值[18]。
1.4.3 TF-3G的促成骨作用根据细胞增殖实验结果选择较合适的受试溶液浓度进行碱性磷酸酶活性与茜素红染色。将生长状态良好的P3代骨髓间充质干细胞悬液接种于24孔板或培养皿内，接种密度为1×105/cm2，分别加入含0，0.86，4.30，8.60 mg/L TF-3G的成骨诱导培养基，每隔2 d换液一次。培养7，10 d后进行碱性磷酸酶活性检测，培养21 d后进行茜素红染色。
1.4.4 制备复合多孔支架[19]
制备nHA/PCL支架：采用深低温冷冻法制备聚己内酯粉末，该粉末粒径为500-700 µm；使用V型混合器将纳米羟基磷灰石与聚己内酯按20∶80质量比混合，30 r/min下均匀混合1 h，得到纳米羟基磷灰石质量百分比为20%的nHA/PCL材料。在CAD软件中设计支架外观为直径6 mm、高15 mm的圆柱体，支架内部为分布均匀且互通的孔隙结构，孔隙约700 µm。将nHA/PCL复合材料装入粉末材料选择性激光烧结机器的原料箱内，编写相关程序后按层厚为150 µm进行打印。60Co辐照灭菌备用。扫描电镜下观察支架的微观形貌。
制备TF-3G修饰的支架：依据以往相关文献研究结果[20-21]，在骨缺损修复动物模型中，负载于材料中的生长因子的浓度一般是体外实验最佳浓度的10-200倍。体外实验结果显示，8.60 mg/L的TF-3G促成骨效果最好，所以此处TF-3G的质量浓度设为0.86 g/L。将nHA/PCL复合多孔支架浸泡于0.86 g/L TF-3G溶液中1 h，然后置于-80 ℃冰箱冷冻 4 h，最后真空冷冻干燥 24 h 后制备TF-3G/nHA/PCL复合多孔支架。
1.4.5 TF-3G修饰的支架的缓释性能将0.1 g的TF-3G/nHA/PCL复合多孔支架放入24孔板内，加入人工模拟体液1 mL，于6，12，24 h 及 3，7，14，21，28 d 收集人工模拟体液，12 000 r/min离心10 min，经 0.22 μm 滤膜过滤后，利用高效液相色谱仪检测TF-3G浓度，计算药物累积释放率。每个测试点之后重新加入新鲜的PBS。
1.4.6 制备骨损伤模型与实验分组干预
制备骨损伤模型：新西兰大白兔适应性饲养5 d后进行实验。耳缘静脉注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉实验兔，固定于实验台上，双侧上肢备皮、消毒、铺单，沿备皮区域纵行作一3 cm切口，钝性分离各层后暴露桡骨，使用线锯及骨刀在桡骨骨干1/3处截除1.5 cm，生理盐水及庆大霉素盐水反复冲洗后，nHA/PCL组缺损处植入nHA/PCL支架，TF-3G/nHA/PCL组植入TF-3G/nHA/PCL支架，逐层缝合，消毒后包扎。术后注射抗生素预防感染。术后密切观察实验动物进食、排泄及伤口等情况。

影像学观察：术后4，12周时，每组随机处死兔8只，获取桡骨标本，在相向投射条件下(投射距离1 m，电压220 kV，电流30 mA，曝光时间0.1 s)进行X射线片检查，并保存好。采用Lane-Sandhu X射线评分表评价缺损区域骨重建水平[22]，见表1。

组织学观察：术后12周完成影像学检查后，将桡骨标本置于体积分数4%甲醛中固定24 h，流动水冲洗干净后梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理后脱钙处理72 h，石蜡包埋，制作100 µm的石蜡切片，分别进行苏木精-伊红染色、Masson染色，光镜下观察。采用Huddleston评分表评价缺损区域骨生成情况[23]，见表2。

1.5 主要观察指标 TF-3G对骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响，以及TF-3G/nHA/PCL复合多孔支架的体内修复骨缺损效果。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

在骨诱导信号刺激下骨髓间充质干细胞可以分化为大量的成骨细胞，参与骨形成和骨再生的过程，在机体骨损伤修复与骨改建中发挥着重要作用[24-25]，因此，促进骨髓间充质干细胞成骨分化是加速骨损伤修复及促进骨再生的有效方法。因此，实验选择骨髓间充质干细胞考察TF-3G的细胞毒性与成骨诱导性能。CCK-8细胞毒性实验结果显示，0.86-86 mg/L TF-3G溶液的毒性分级为0级，106 mg/L TF-3G溶液的毒性为1级，提示 TF-3G溶液符合国家应用的标准。NISHIKAWA等[26]研究发现TF-3G可通过抑制DNA甲基化来抑制破骨细胞的生成与增殖，减轻骨质疏松。实验进一步观察了TF-3G对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，首先进行了CCK-8细胞增殖活性实验，结果显示：较高浓度(17.20，34.4，68.8，86，106 mg/L)的TF-3G溶液抑制骨髓间充质干细胞的增殖，而较低浓度(0.86，4.30，8.60 mg/L)的TF-3G溶液可促进骨髓间充质干细胞的增殖；所以进一步观察了0.86，4.30，8.60 mg/L的TF-3G溶液处理后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性与矿化沉积情况，结果显示TF-3G溶液呈浓度依懒性增加骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性与矿化沉积，具有明显的骨诱导促进作用。
骨形态发生蛋白是一类具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于转化生长因子β家族成员，其功能广泛，能够促进成骨细胞的增殖及分化，并且在间充质干细胞分化、增殖为成骨细胞的过程中起着中枢性作用，主要通过Smads依赖性(BMP/Smads信号通路)和非Smads依赖性(MAPK信号通路)两条途径其发挥生物学作用[27-30]。其中骨形态发生蛋白2信号通路作为促进骨形成与诱导成骨分化的重要信号通路之一，一方面，骨形态发生蛋白2 可与细胞表面受体 BMPR 结合，使激活的BMPR2Ⅱ使BMPR2Ⅰ的膜内区磷酸化，作用于下游的 Smad1/Smad5/Smad8，激活的 Smad1、Smad5、Smad8与Smad4 结合形成复合体并转位至细胞核内与不同的 DNA 结合蛋白结合，引起下游骨形态发生蛋白相关的基因转录，调控细胞的分化[31-32]；另一方面，骨形态发生蛋白2也可与细胞表面具有高亲和性的BMPR2I 连结合时，BMPR2I 通过衔接蛋白 XIAP、TAB1再与TAK1 间接结合，最终激活 p38 MAPK[33-34]。作者推测TF-3G可能通过激活骨形态发生蛋白2信号通路促进内源性间充质干细胞的成骨分化，这是下一步实验需要研究的课题。
快速成型技术有30多种不同的工艺，常用的成型技术主要有立体光固化成型、三维打印、熔融沉积机造、选择性激光烧结等。与其他快速成型技术相比，选择性激光烧结成型技术具有可材料范围广、成型精度高、过程简单、材料利用率高、不需要额外支撑等优势，在骨组织工程应用中具有良好的应用前景。近年来，许多研究者利用选择性激光烧结技术制备了多孔骨支架用于相关研究，取得了一定的成果，例如：金光辉等[35]采用选择性激光烧结技术制备了nHA/PCL人工骨支架，证明该人工骨支架具有良好的生物力学强度、骨诱导性与生物相容性，随后将其应用于兔桡骨大段骨缺损中获得了良好的骨修复效果[36]；QIN等[37]采用选择性激光烧结技术制备了三维多孔磷酸四钙支架，模拟体液中浸泡实验显示该支架具有良好的生物活性，细胞实验表明该支架具有良好的生物相容性。因此，实验以纳米羟基磷灰石与聚己内酯为原料，利用选择性激光烧结技术制备复合多孔骨支架。
有研究报道在骨缺损修复动物模型中，负载于材料中的生长因子的浓度一般是体外实验最佳浓度的10-200倍[20-21]。此次体外实验结果显示，8.60 mg/L的TF-3G溶液具有良好的促细胞增殖与成骨作用，所以实验选择TF-3G溶液的浓度为0.86 g/L(860 mg/L)。采用溶液浸渍与冷冻干燥法将TF-3G负载于nHA/PCL复合多孔支架中进行兔体内骨修复实验，X射线片检查结果显示：至术后12周时，TF-3G/nHA/PCL组骨缺损部位有明显的骨生成，新生骨组织与周围骨质界限模糊；nHA/PCL组可见一定量的新骨生成，但与周围骨质界限仍较清晰；空白对照组骨缺损部位无明显放的新骨生成，说明实验骨缺损造模成功。进一步的Lane-Sandhu影像学评分结果显示，TF-3G/nHA/PCL组的评分高于nHA/PCL组，说明TF-3G/nHA/PCL复合多孔支架在骨连接、骨形成与骨塑形方面优于nHA/PCL复合多孔支架，可见TF-3G可与nHA/PCL复合多孔支架联合发挥促成骨作用。苏木精-伊红染色、Masson染色是目前衡量骨愈合较常用的方法。苏木精-伊红染色、Masson染色结果显示，空白对照组骨缺损部位无明显的新骨生成，nHA/PCL组、TF-3G/nHA/PCL组可见一定的新骨生成，其中TF-3G/nHA/PCL组的骨形成更多、更成熟，说明TF-3G可与nHA/PCL复合多孔支架协同发挥促成骨作用。
综上所述，实验得出以下结论：TF-3G可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，负载TF-3G的nHA/PCL复合多孔支架可促进骨缺损的修复，但是关于TF-3G溶液的促成骨诱导机制还有待深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

茶黄素-3,3’-没食子酸酯修饰的纳米羟基磷灰石/聚已内酯复合多孔支架修复骨缺损

Theaflavin-3-gallate modified nano-hydroxyapatite/polycaprolactone composite porous scaffold in bone defect repair

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