哇巴因体外诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2022.556

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3796-3801.doi: 10.12307/2022.556

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

哇巴因体外诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化

崔寅鹏1，郭艾2，马立峰2，刘振江1

1首都儿科研究所附属儿童医院骨科，北京市 100020；2首都医科大学附属北京友谊医院骨科，北京市 100050

收稿日期:2020-12-14 接受日期:2021-01-30 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-22
通讯作者: 刘振江，博士，主任医师，首都儿科研究所附属儿童医院骨科，北京市 100020 马立峰，博士，副主任医师，首都医科大学附属北京友谊医院骨科，北京市 100050
作者简介:崔寅鹏，女，1991年生，北京市人，汉族，2017年首都医科大学毕业，硕士，医师，主要从事干细胞培养、骨组织修复及骨病治疗研究。

Ouabain induces in vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts

Cui Yinpeng1, Guo Ai2, Ma Lifeng2, Liu Zhenjiang1

1Department of Orthopedics, Children’s Hospital, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China; 2Department of Orthopedics, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China

Received:2020-12-14 Accepted:2021-01-30 Online:2022-08-28 Published:2022-01-22
Contact: Liu Zhenjiang, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Children’s Hospital, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China Ma Lifeng, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China
About author:Cui Yinpeng, Master, Physician, Department of Orthopedics, Children’s Hospital, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
哇巴因：是一种强心甾类固醇类激素，最初从生长于非洲及南美洲的植物中提取，属于洋地黄类化合物，可通过与Na+/K+-ATPase上的特异性受体结合，在不影响其离子转运功能情况下，激活下游的蛋白级联反应，参与调节细胞的生长、增殖、代谢、凋亡等生理变化。
成骨分化：多能干细胞向单能成骨细胞转变，并最终向骨组织发展的一系列生理过程称为成骨分化，对于调节骨形成和骨再生有重要意义。

背景：哇巴因作为Na+/K+-ATPase的配体可与其结合调节细胞的增殖代谢，研究哇巴因对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，可为骨缺损、骨病的治疗提供思路。
目的：探讨不同浓度Na+/K+-ATPase配体哇巴因对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：以人工髋关节置换手术中废弃的新鲜骨髓为实验材料，采用全骨髓直接贴壁培养法分离纯化获得人骨髓间充质干细胞，作为诱导成骨分化的实验细胞；成骨诱导前以不同浓度哇巴因(10，100，1 000 nmol/L)处理人骨髓间充质干细胞24 h，未经药物处理的人骨髓间充质干细胞直接进行诱导作为对照组，然后成骨诱导21 d后进行茜素红染色，使用Image Pro Plus软件测量染色面积比例，比较各组产生钙化结节量的差异。
结果与结论：与对照组比较，低浓度(10 nmol/L)哇巴因刺激人骨髓间充质干细胞后，茜素红染色钙化结节数量增多，染色面积高于对照组(P < 0.05)；高浓度(100，1 000 nmol/L)哇巴因刺激后钙化结节数量减少，染色面积低于对照组(P < 0.05)，且浓度越高钙化结节数量越少。结果表明，人工髋关节置换术中废弃的新鲜骨髓可作为分离纯化得到人骨髓间充质干细胞的实验材料，低浓度哇巴因可促进人骨髓间充质干细胞成骨分化，高浓度哇巴因抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。

https://orcid.org/0000-0002-2070-6057 (崔寅鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓, 人骨髓间充质干细胞, 哇巴因, Na+/K+-ATPase, 成骨分化, 人工髋关节置换

Abstract:

BACKGROUND: As a ligand of Na+/K+-ATPase, ouabain can be combined with it to regulate cell proliferation and metabolism. Studying the effect of ouabain on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells can provide ideas for the treatment of bone defects and bone diseases.
OBJECTIVE: To explore the effects of different concentrations of Na+/K+-ATPase ligand ouabain on the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from fresh bone marrow samples from patients that experienced hip replacement, using the whole bone marrow direct adherence method, as experimental cells for inducing osteogenic differentiation. Before osteoinduction, human bone marrow mesenchymal stem cells were treated in different concentrations of ouabain (10, 100, and 1 000 nmol/L) for 24 hours. The untreated human bone marrow mesenchymal stem cells were used as the control group to induce directly. At 21 days after osteoinduction, alizarin red staining was performed. The proportion area was measured using Image Pro Plus software to compare the differences in the amount of calcified nodules produced in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, as human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro treated with ouabain in low concentration (10 nmol/L), the number of calcified nodules increased after alizarin red staining and the staining areas were higher than that in the control group (P < 0.05). The number of calcified nodules observed after treatment in the high concentration group (100, 1 000 nmol/L) was reduced, and the measured stained area was smaller than that in the control group (P < 0.05). The higher the concentration, the fewer the calcifiednodules were. It is concluded that the fresh bone marrow form hip arthroplasty can be used as a test material for isolating human bone marrow mesenchymal stem cells. Low concentrations of ouabain promote differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts, while a high concentration of ouabain showed an inhibitory effect.

Key words: stem cells, bone marrow, human bone marrow mesenchymal stem cells, ouabain, Na+/K+-ATPase, osteogenic differentiation, artificial hip replacement

中图分类号:

崔寅鹏, 郭艾, 马立峰, 刘振江. 哇巴因体外诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3796-3801.

Cui Yinpeng, Guo Ai, Ma Lifeng, Liu Zhenjiang. Ouabain induces in vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3796-3801.

图/表（结果） 8

2.1 人骨髓间充质干细胞分离培养及成骨诱导鉴定结果光学显微镜下观察，细胞接种后首次换液将悬浮的大量红细胞及未贴壁细胞去除，贴壁细胞呈梭形或多角形，分布不均，约1周可布满培养瓶。传代培养至第3代，细胞生长迅速，逐渐形成较为均一的长梭形，其他形态少见。细胞聚集，成鱼群样、漩涡样排列，有方向性，高倍镜(×400)下观察细胞形态均一，呈长梭形，贴壁生长，见图1。

取第3代人骨髓间充质干细胞加入成骨诱导培养基培养1周，光学显微镜下观察(×200)可见细胞生长稳定，形态较不规则，由长梭形向多角形和不规则形转化，逐渐聚集成团形生长；未进行成骨诱导的第3代细胞仍呈长梭形，鱼群样排列，聚集性生长，排列规则。茜素红属一种蒽醌类衍生物，能与碳酸钙或磷酸钙结合成橘红色的复合物，人骨髓间充质干细胞经21 d成骨诱导后，茜素红染色可见有橘红色钙化结节形成，结节分布散在，形态大小各异，见图2及图3。

2.2 哇巴因对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响
2.2.1 不同浓度哇巴因对人骨髓间充质干细胞增殖的影响用不同浓度哇巴因(10，100，1 000 nmol/L)处理人骨髓间充质干细胞24，48，72 h后，MTT法检测细胞存活情况，并与对照组比较。处理24 h后，各组细胞存活率之间差异无显著性意义(P > 0.05)；处理48 h后，高浓度组(100，1 000 nmol/L)与低浓度组(10 nmol/L)和对照组比较，细胞存活率差异有显著性意义，且浓度越高，差异越明显；处理72 h后，对照组与不同浓度哇巴因组之间细胞存活率差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1，图4。

2.2.2 不同浓度哇巴因对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响不同浓度哇巴因作用人骨髓间充质干细胞24 h后进行成骨诱导，成骨诱导21 d后进行茜素红染色，大体观察6孔培养板中低浓度组(10 nmol/L)橘红色化合物相对增多，高浓度组(100，1 000 nmol/L)可染色出的化合物明显减少，提示低浓度组(10 nmol/L)经诱导后出现较多的钙化结节，高浓度组(100，1 000 nmol/L)经诱导后出现的钙化结节数量明显减少，见图5A-D。光学显微镜下(×200)观察低浓度组(10 nmol/L)同一视野范围内钙化结节紧密成团状，连接成片，高浓度组(100，1 000 nmol/L)钙化结节孤立，散在分布，相互无关联，见图6A-D。

使用Image Pro Plus 6.0软件对染色区面积进行测量，可计算得到染色面积占比，进行统计学分析，各哇巴因组与对照组间差异有显著性意义(F=77.624，P < 0.001)，见表2。

参考文献

[1] MEPPELINK AM, WANG XH, BRADICA G, et al. Rapid isolation of bone marrow mesenchymal stromal cells using integrated centrifuge-based technology. Cytotherapy. 2016;18(6):729-739.
[2] JOHNSTONE BH, MILLER HM, BECK MR, et al. Identification and characterization of a large source of primary mesenchymal stem cells tightly adhered to bone surfaces of human vertebral body marrow cavities. Cytotherapy. 2020;22(11):617-628.
[3] MAHBOUDI H, KAZEMI B, SOLEIMANI M, et al. Enhanced chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal Stem Cell (BMSC) on nanofiber-based polyethersulfone (PES) scaffold. Gene. 2018;643:98-106.
[4] RATH SN, NOOEAID P, ARKUDAS A, et al. Adipose- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells display different osteogenic differentiation patterns in 3D bioactive glass-based scaffolds. J Tissue Eng Regen Med. 2016;10(10):E497-E509.
[5] HUANG GT, GRONTHOS S, SHI S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res. 2009;88(9):792-806.
[6] CENTENO CJ, BUSSE D, KISIDAY J, et al. Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells. Pain Physician. 2008;11(3):343-353.
[7] SHAO X, GOH JC, HUTMACHER DW, et al. Repair of large articular osteochondral defects using hybrid scaffolds and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a rabbit model. Tissue Eng. 2006;12(6):1539-1551.
[8] MORENO C, YANO S, BEZANILLA F, et al. Transient Electrical Currents Mediated by the Na+/K+-ATPase: A Tour from Basic Biophysics to Human Diseases. Biophys J. 2020;119(2):236-242.
[9] LI Z, CAI T, TIAN J, et al. NaKtide, a Na/K-ATPase-derived peptide Src inhibitor, antagonizes ouabain-activated signal transduction in cultured cells. J Biol Chem. 2009;284(31):21066-21076.
[10] GABLE ME, ABDALLAH SL, NAJJAR SM, et al. Digitalis-induced cell signaling by the sodium pump: on the relation of Src to Na(+)/K(+)-ATPase. Biochem Biophys Res Commun. 2014;446(4):1151-1154.
[11] HAMLYN JM, BLAUSTEIN MP, BOVA S, et al. Identification and characterization of a ouabain-like compound from human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(14):6259-6263.
[12] OTSU K, KURUMA A, YANAGIDA E, et al. Na+/K+ ATPase and its functional coupling with Na+/Ca2+ exchanger in mouse embryonic stem cells during differentiation into cardiomyocytes. Cell Calcium. 2005;37(2):137-151.
[13] LEE YK, NG KM, LAI WH, et al. Ouabain facilitates cardiac differentiation of mouse embryonic stem cells through ERK1/2 pathway. Acta Pharmacol Sin. 2011;32(1):52-61.
[14] SAYED M, DRUMMOND CA, EVANS KL, et al. Effects of Na/K-ATPase and its ligands on bone marrow stromal cell differentiation. Stem Cell Res. 2014;13(1):12-23.
[15] TIAN J, LI X, LIANG M, et al. Changes in sodium pump expression dictate the effects of ouabain on cell growth. J Biol Chem. 2009;284(22): 14921-14929.
[16] MAKIHIRA S, NIKAWA H, KAJIYA M, et al. Blocking of sodium and potassium ion-dependent adenosine triphosphatase-α1 with ouabain and vanadate suppresses cell-cell fusion during RANKL-mediated osteoclastogenesis. Eur J Pharmacol. 2011;670(2-3):409-418.
[17] 潘欣宇,崔颖,马林祥,等.骨髓间充质干细胞的研究进展及临床应用前景[J].中国医学工程,2011,19(5):173-174.
[18] ZHOU Y, WU C, CHANG J. Bioceramics to regulate stem cells and their microenvironment for tissue regeneration. Materials Today. 2019;24: 41-56.
[19] LAM ATL, REUVENY S, OH SK. Human mesenchymal stem cell therapy for cartilage repair: Review on isolation, expansion, and constructs. Stem Cell Res. 2020;44:101738.
[20] 王承云,石磊,夏春,等.人骨髓间充质干细胞分离培养方法的改进[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(32):5896-5900.
[21] DOMINICI M, LE BLANC K, MUELLER I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.
[22] 石志红,袁祖贻,张慧峰,等.不同浓度哇巴因对A549细胞增殖及死亡的影响[J].现代肿瘤医学,2011,19(8):1515-1518.
[23] OLIVEIRA TN, POSSIDONIO AC, SOARES CP, et al. The role of Na+/K+-ATPase during chick skeletal myogenesis. PLoS One. 2015;10(3): e0120940.
[24] HUANG T, YU Z, YU Q, et al. Inhibition of osteogenic and adipogenic potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells under osteoporosis. Biochem Biophys Res Commun. 2020;525(4):902-908.
[25] LIU L, IVANOV AV, GABLE ME, et al. Comparative properties of caveolar and noncaveolar preparations of kidney Na+/K+-ATPase. Biochemistry. 2011;50(40):8664-8673.
[26] KUANG Z, BAI J, NI L, et al. Withanolide B promotes osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells via ERK1/2 and Wnt/β-catenin signaling pathways. Int Immunopharmacol. 2020;88:106960.

引言

人骨髓间充质干细胞是具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞等多种细胞分化潜能的多能干细胞[1]，因其强大的自我更新能力及增殖能力，在体外培养中可经不同的诱导环境刺激向多种细胞系转换，是临床疾病治疗、损伤修复、组织工程学理想的种子细胞。人骨髓间充质干细胞主要来源于骨髓，可经体外分离培养、扩增技术得到数量充足、活性高、生物性能均一的实验细胞[2]。近年来已有不少学者将人骨髓间充质干细胞作为种子细胞与多种生物材料结合，用于研究治疗骨与软骨缺损、脊神经损伤、股骨头坏死等多种骨科相关疾病[3-5]。CENTENO等[6]经皮注射人骨髓间充质干细胞治疗膝关节退行性病变及周围损伤，患者疼痛评分减低、关节活动度增加，MRI显示半月板和软骨明显生长，其认为人骨髓间充质干细胞治疗对膝骨关节炎和半月板损伤具有重要的意义。SHAO等[7]将人骨髓间充质干细胞与三维多孔聚己酸内酯支架复合后植入巨大骨软骨缺损区，发现缺损区修复良好，新生长的骨组织与宿主可牢固融合。上述研究提示，人骨髓间充质干细胞在骨科疾病治疗中具有重要的研究价值。
Na+/K+-ATPase属于P型ATP酶家族，是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的重要膜离子转运蛋白，Na+/K+-ATPase的功能主要表现在2个方面：即离子转运功能和信号传导功能[8]。内源性强心甾类固醇通过与Na+/K+-ATPase上的特异性受体结合，在不影响其离子转运功能情况下，激活下游的蛋白级联反应，参与调节细胞的生长、增殖、代谢、凋亡等生理变化[9-10]。哇巴因(ouabain)就是一种强心甾类固醇类激素，最初从生长于非洲及南美洲的植物中提取，属于洋地黄类化合物。HAMLYN等[11]最早从血浆内提取并纯化哇巴因，逐渐作为内源性强心甾类固醇用于实验研究。Na+/K+-ATPase在未分化的胚胎干细胞以及胚胎干细胞衍生的心肌细胞中表达[12]，哇巴因等强心甾类固醇通过细胞外调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)信号通路促进胚胎干细胞向心肌细胞分化[13]。SAYED等[14]发现尿毒症及慢性肾脏疾病诱发的强心甾类固醇波动及内环境变化可引起骨髓间充质干细胞的功能缺陷，另一种特异的Na+/K+-ATPase配体Marinobufagenin(MBG)增强了罗格列酮诱导的3T3-L1细胞和小鼠骨髓间充质干细胞的成脂分化，发现MBG激活了小鼠骨髓间充质干细胞的ERK传导通路，并增加了CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)的表达。以上研究提示Na+/K+-ATPase及其信号传导功能参与骨髓间充质干细胞分化的调控。
哇巴因作为Na+/K+-ATPase的配体，可能影响干细胞的分化。在SAYED等[14]研究中发现哇巴因同样增加了小鼠骨髓间充质干细胞中C/EBPα的表达。TIAN等[15]用10 nmol/L和50 nmol/L哇巴因刺激猪肾小管上皮细胞LLC-PKl细胞系24 h，发现强心甾类固醇促进了LLC-PKl细胞系的增殖；MAKIHIRA等[16]使用250 μmol/L哇巴因作用于大鼠前破骨细胞，其在必要的诱导条件下仍不能融合为破骨细胞。因此，该研究拟探讨哇巴因剂量与诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的关系。作者假设：低浓度哇巴因通过与人骨髓间充质干细胞上Na+/K+-ATPase的特异性受体结合，可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化；而高浓度哇巴因则抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外原代细胞模型，完全随机设计，细胞功能数据采用单因素方差分析和独立样本t检验比较。
1.2 时间及地点实验于2015年5月至2016年6月在首都医科大学附属北京友谊医院外科实验室完成。
1.3 材料人工髋关节置换术中废弃的骨髓血。纳入标准：年龄小于70岁；无心血管系统疾病、无肾脏系统疾病、无传染病等代谢性疾病。排除标准：患有高血压、冠心病、慢性肾脏病等需长期口服洋地黄类药物的患者。实验标本均为术中废液，常规按医疗垃圾处理，所有患者签署知情同意书，并经首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会批准(批件号：2015-P2-121-01)。
哇巴因、MTT、二甲基亚砜购自Sigma公司；成人骨髓间质干细胞完全培养基、成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化基础培养基、成人骨髓间质干细胞专用胎牛血清、茜素红染料均购自Cyagen公司；PBS(1×)购自Solarbio公司。实验溶液配制及计量严格按照操作说明书进行。
1.4 实验方法
1.4.1 人骨髓间充质干细胞的分离培养无菌条件下取人工髋关节置换手术中股骨开髓阶段溢出的骨髓血5 mL，保存于含有肝素的无菌标本管中，4 h内带入细胞培养室。将骨髓血标本置于50 mL无酶离心管中；加入PBS，1 500 r/min离心3 min，洗涤2次，保留沉淀物；将沉淀物与人骨髓间充质干细胞完全培养基按1∶5的体积混合均匀；取5 mL混合液接种于25 cm2细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养；24 h换液，PBS洗涤去除未贴壁细胞；此后每两三天换液，原代细胞培养至铺满整个瓶底，即可按1∶3比例进行传代培养(为第1代)。经传代培养的细胞形态逐渐规则，生长迅速，传代时间缩短。

1.4.2 人骨髓间充质干细胞的成骨诱导鉴定取第3代人骨髓间充质干细胞，加入新鲜人骨髓间充质干细胞完全培养基，以3×104/cm2的细胞密度接种于25 cm2细胞培养瓶中，24 h后吸除人骨髓间充质干细胞完全培养基，加入人骨髓间充质干细胞成骨分化培养基4 mL，每三四天换液1次，持续诱导21 d，对诱导后细胞进行茜素红染色，观察橘红色钙化结节产生情况。

1.4.3 哇巴因溶液的配制准确称取哇巴因7.2 mg置于EP离心管中，加入二甲基亚砜溶液1 mL使之完全溶解，所得溶液为10 mmol/L哇巴因原液。取100 μL 10 mmol/L哇巴因溶于1 mL二甲基亚砜中，稀释后浓度为1 mmol/L，继续用人骨髓间充质干细胞完全培养基稀释，得到含哇巴因终浓度为1 000，100，10 nmol/L的人骨髓间充质干细胞完全培养基，4 ℃避光保存备用。
1.4.4 MTT法检测不同浓度哇巴因对人骨髓间充质干细胞增殖的影响取第3代人骨髓间充质干细胞加入新鲜人骨髓间充质干细胞完全培养基，以1×104/cm2的细胞密度接种于96孔板中，体系为200 μL，于培养箱中培养24 h后换液，加入含有不同浓度哇巴因的人骨髓间充质干细胞完全培养基继续培养，分别于24，48，72 h后用MTT法检测细胞增殖率。
1.4.5 不同浓度哇巴因刺激后人骨髓间充质干细胞的成骨诱导情况取第3代人骨髓间充质干细胞加入新鲜人骨髓间充质干细胞完全培养基，以1.5×104/cm2的细胞密度接种于6孔板内，3 d后1孔常规换液，另外3孔分别加入含有1 000，100，10 nmol/L哇巴因的人骨髓间充质干细胞完全培养基作用24 h后，每孔细胞均换成人骨髓间充质干细胞成骨分化培养基继续培养，每三四天换液1次，持续培养21 d。诱导完成后，1×PBS清洗，加入40 g/L多聚甲醛溶液2 mL固定30 min，1×PBS冲洗2遍，1 mL茜素红溶液染色3-5 min，1×PBS再次冲洗两三次，光学显微镜下观察。
1.5 主要观察指标成骨诱导完成后观察培养皿中茜素红染色钙化结节数量及显微镜下相同条件视野内染色钙化结节面积占比。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，多组均数比较用单因素方差分析(ANOVA)，两两组间比较用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于骨代谢性疾病、创伤及骨组织修复所导致的骨量丢失及骨缺损是临床常见问题，随着再生医学、移植医学及生物相容性材料的发展，细胞替代治疗、基因治疗、组织修复及器官再造移植具有重要的临床应用价值[17]。骨髓间充质干细胞因具有来源广泛、高分化潜能、易于体外培养、低免疫原性等优点，被认为是组织工程学理想的种子细胞。目前以细胞治疗为目的而开展的骨髓间充质干细胞体外基础研究已得到迅速发展，而临床上已应用骨髓间充质干细胞治疗节段性骨缺损[18]、软骨病变[19]、血液系统疾病。
目前实验来源的骨髓间充质干细胞根据取材对象不同主要分为3种[20]：①新生动物或胚胎动物的骨髓，因种属的差异多用于实验室研究；②引产或流产胎儿的骨髓，该方法获取的人类骨髓间充质干细胞具有生物活性强等优点，但存在明显的伦理学问题，以及胎儿发育期间分化变异不稳定等原因，其使用多受到限制；③临床骨髓移植供者的骨髓，该方法主要通过穿刺扁骨取得红骨髓，进行处理后培养获得间充质干细胞，多因来源少、应用治疗弥足珍贵而实验使用受限。
体外分离提纯骨髓间充质干细胞主要有4种方法：全骨髓贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠法，前2种方法简单便捷，提取细胞纯度较高，损耗较小，实用性强，是较为理想的分离纯化方法[17]。目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物。国际细胞治疗协会提出了鉴定骨髓间充质干细胞的最低标准：①细胞应表现为黏附性生长；②具有特定的某些细胞表面标志物，例如：分化抗原簇CD73、CD90、CD105、CD44，而不表达或少表达CD14、CD34、CD45及人类白细胞抗原(HLA-DR)；③具有体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力[21]。因此，细胞形态学及诱导分化结果可作为骨髓间充质干细胞鉴定的习惯方法，也得到广大学者们的认可。
该实验采用关节置换术中假体置入前、长管状骨开髓阶段溢出的骨髓血为实验原料，采用全骨髓直接贴壁培养法进行人骨髓间充质干细胞的分离扩增，并采用诱导分化进行鉴定，成功得到形态均一的长梭形贴壁细胞，传代后细胞聚集、排列规整，诱导后可向成骨细胞分化。该方法所需骨髓血仅5 mL，未造成额外损伤。依靠全骨髓直接贴壁培养法，通过细胞培养基的自筛选作用纯化人骨髓间充质干细胞；随着洗涤及传代，未贴壁细胞及在培养基内不适宜生长的细胞自行移除或退化，逐渐保留形态规则、生长良好的贴壁细胞；传代后细胞增殖速度逐渐加快，细胞形态逐渐变为纺锤状，呈漩涡状、螺旋状紧密排列，达到筛选及纯化的目的[20]。传代后稳定的第3代细胞加入成骨诱导培养基诱导21 d后进行茜素红染色，可观察到明显的钙化结节形成，证实了经诱导后的实验细胞可分化为成骨细胞。综上，在关节置换手术中对骨髓血进行收集，经过贴壁培养及扩增传代，能够筛选获得有效的人骨髓间充质干细胞。
实验发现，用不同浓度的强心甾类固醇类激素哇巴因干预人骨髓间充质干细胞后，随着药物作用时间的延长，细胞的增殖能力发生变化。与对照组比较，哇巴因作用时间在24 h以内，细胞增殖未产生明显变化；作用时间为48 h时，各哇巴因组与对照组比较，细胞增殖能力出现差异，且浓度越高，差异越显著；作用时间为72 h时，各哇巴因组与对照组比较细胞增殖差异更为明显(P < 0.01)。有研究指出，高浓度的哇巴因(100-5 000 nmol/L) 可抑制细胞增殖，且呈现时间依赖性，随着作用时间的延长，哇巴因对细胞增殖的抑制率增加，并指出这可能与高浓度哇巴因诱发细胞的线粒体凋亡途径相关[22]，与该实验的结论一致。用微摩尔以下浓度的哇巴因处理人骨髓间充质干细胞24 h对细胞活性及增殖能力未产生明显影响，故后续实验以哇巴因作用细胞24 h为基础，继续研究药物刺激对细胞成骨分化的影响。
经过21 d的成骨诱导培养，低浓度组(10 nmol/L)茜素红染色产生钙化结节的数量高于对照组；高浓度组(100，1 000 nmol/L)细胞在成骨分化后相同视野下观察到的钙化结节数量明显减少，背景干净，结节孤立松散分布。因此得出结论：低浓度(10 nmol/L)哇巴因促进了人骨髓间充质干细胞的成骨分化，高浓度(100，1 000 nmol/L)哇巴因表现为抑制作用。哇巴因作为与Na+/K+-ATPase特异结合的配体，能够特异性地调节细胞的生长，特异性地调节细胞Na+/K+-ATPase的表达。减少细胞Na+/K+-ATPase可以减慢细胞增殖，也可以转化哇巴因对细胞生长的促进作用变为抑制作用[15]。该实验发现，哇巴因与人骨髓间充质干细胞的Na+/K+-ATPase相关受体结合后，参与了细胞的代谢活动。
研究不足之处：①对分离提取的人骨髓间充质干细胞只进行了诱导分化鉴定，未进行细胞表面抗原鉴定，得到的细胞均一性及纯度不及成体系的细胞系；仅验证了通过外科手术废弃材料提取的细胞具有一定生物活性并可在实验中应用的可行性，对后续实验的精确性可能存在影响；②该实验为探索性研究，通过易于获取的实验材料及简单易行的方法探索发现一种现象，观察到不同浓度哇巴因对人骨髓间充质干细胞成骨分化存在影响，仍处于实验探索阶段。OLIVEIRA等[23]用0.01-10 μmol/L哇巴因处理鸡肌原细胞，发现0.01，0.1，1 μmol/L哇巴因对细胞活性没有影响，而10 μmol/L哇巴因处理后细胞活力下降45%，进一步研究发现，10 μmol/L哇巴因影响了细胞Na+/K+-ATPase的活性进而影响了细胞活力。哇巴因是如何调节人骨髓间充质干细胞的成骨分化，是否通过刺激诱发PI3K/Akt/mTOR信号通路增加Na+/K+-ATPase的表达，加快细胞生长、激活，影响人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的Wnt、Notch、ERK1/2和Wnt/β蛋白等信号通路，刺激其向成细胞分化[24-26]，这些具体分子机制仍有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

哇巴因体外诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化

Ouabain induces in vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[4]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[5]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[6]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[7]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[8]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[9]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[10]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[11]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.
[12]	崔兴, 孙小琪, 郑伟, 马德欣. 黄芩汤调控自噬干预小鼠肠道急性移植物抗宿主病的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1057-1062.
[13]	熊挺淋, 应梦慧, 张丽莎, 张晓刚, 杨燕. 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1063-1067.
[14]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.
[15]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.