2.1   实验动物数量分析   实验选用大鼠45只，分为3组，全部进入结果分析。
2.2   Apelin对脊髓损伤大鼠后肢运动障碍的影响   由BBB评分可知，假手术组大鼠后肢运动功能正常，脊髓损伤后大鼠后肢功能完全丧失，损伤后3 d开始观察到运动恢复，脊髓损伤组各时间点之间差异无显著性意义；损伤7，14 d与脊髓损伤组比较，Apelin-13组增强了大鼠后肢运动功能的修复(P < 0.05，P < 0.01 )，见图1。



2.3   Apelin促进了大鼠损伤脊髓形态学的修复    通过免疫荧光染色βⅢ-tubulin阳性结果显示大鼠脊髓连续性，在假手术组中，βⅢ-tubulin阳性细胞密集且富有规律性，脊髓损伤导致脊髓局部连续性破坏，出现空洞，给予Apelin干预14 d后脊髓形态学修复，空洞减小，βⅢ-tubulin阳性细胞较脊髓损伤组更为规律，见图2。



2.4    Apelin干预减少了局部星形胶质细胞和小胶质细胞激活    免疫组化结果显示，在假手术组仅有少数iba1阳性细胞(小胶质细胞与巨噬细胞)，脊髓损伤导致局部iba1阳性细胞数量显著增加，而给予Apelin干预后大鼠脊髓局部iba1阳性细胞显著减少(P < 0.05)。GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)在损伤后同样显著增加，Apelin干预减少了星形胶质细胞数量(P < 0.05)，见图3。



2.5   Apelin减少了脊髓损伤带来的脱髓鞘    髓鞘染色结果显示，在假手术组中髓鞘排列紧密、清晰且完整；脊髓损伤带来了严重的脱髓鞘，LFB染色阳性面积明显降低；与脊髓损伤组相比，Apelin-13组阳性表达面积升高，空泡明显减少，且排列更加紧密，见图4。



2.6    Apelin促进了生长相关蛋白的表达    免疫荧光和RT-PCR结果显示GAP43在假手术组中表达量较低，RT-PCR结果显示，脊髓损伤组GAP43表达量显著增加(P < 0.001 )，给予Apelin进一步增加了GAP43的表达，见图5。



2.7   Apelin增加了H2O2诱导的PC12细胞损伤的细胞活力   CCK8结果显示，加药干预24 h后，与H2O2诱导的损伤组相比，2 μmol/L和4 μmol/L的Apelin干预组的吸光度值增加，增加了PC12细胞的活力(P < 0.05 )，见图6。

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脊髓损伤是一种严重的神经系统损伤，给患者带来严重的感觉和运动障碍[1]。脊髓损伤通常被划分为原发性和继发性损伤[2]，继发性损伤常伴有小胶质细胞和星形胶质细胞过度激活并分泌促炎因子、神经元死亡、脱髓鞘反应、氧化应激等一系列病理反应[3]，其中炎性反应和神经元死亡是造成不良预后的重要原因。因此，如何减轻炎性反应、减少神经元死亡是当前研究的重点问题。

脊髓损伤常伴随着小胶质细胞的迅速激活，小胶质细胞和巨噬细胞均参与炎性反应[3]，M1巨噬细胞的激活常与炎性反应有关，并促进星形胶质细胞的激活和极化。脊髓损伤常伴随星形胶质细胞迅速激活，被称为星形胶质细胞增多症，过度激活的星形胶质细胞会在损伤局部形成胶质瘢痕，胶质瘢痕的形成阻碍了轴突的生长[4]，从而限制了损伤的修复，因此，抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活是促进脊髓损伤修复的重要途径。

PC12细胞是常见的研究神经损伤的细胞之一[5]，过氧化氢(H2O2) 诱导细胞损伤是目前研究神经损伤常见的细胞模型，通过该模型可以有效的探讨脊髓损伤的治疗手段。

Apelin是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体[6]，在体内具有多种活性形式，如Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36。Apelin的短型，如Apelin-13和Apelin-17，比长型发挥更大的作用[7]。在Apelin对心血管系统疾病和神经退行性疾病的研究中证实了Apelin的抗炎及促血管生成作用[8-9]。在中枢系统中，给予Apelin-13可以松弛脑血管以增加血液供应，从而对具有良好侧支循环的缺血性脑卒中患者具有保护作用[10]，这预示着给予Apelin可以减轻脑缺血再灌注损伤，从而为缺血性脑卒中患者提供保护。然而，Apelin对于脊髓损伤的治疗作用报道较少。

基于上述描述，该实验旨在评价Apelin对脊髓损伤大鼠模型及对体外神经元损伤模型的影响，为脊髓损伤的治疗提供新的靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验。相同处理不同时间点的比较行单因素方差分析，两种处理不同时间点的比较行析因设计的方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年5月至2021年6月在滨州医学院解剖教研室实验室内完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物    SPF级雌性SD大鼠45只，体质量220-250 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK(鲁)2019 0003。动物分笼饲养于滨州医学院神经生物学研究所动物房，在滨州医学院实验动物饲养中心标准条件下饲养，温度为(23±2) ℃，相对湿度为(55±10)%，控制光照光/暗周期=12∶12，提供自由摄取的水和粮食，饲养1周后进行动物实验。所有动物实验方案均获得滨州医学院实验动物伦理委员会批准。
1.3.2   实验用主要试剂和仪器   胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、离子钙接头蛋白分子1(ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1)、生长相关蛋白43(growth associated protein 43，GAP43)抗体(美国Abcam公司)；anti-β-Ⅲ-tubulin(Proteintech)；Luxol Fast Blue 髓鞘染色液(Solarbio公司)；SP9000免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒(20×，中杉金桥，ZLI-9018)，荧光倒置显微镜(美国Echo)。
1.3.3   药品及细胞   Apelin-13(0.2 mg/kg，纯度：99.80%，MCE公司)；肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞[iCell-r025，赛百慷(上海)生物技术股份有限公司]；H2O2(安研科技)。
1.4   实验方法   
1.4.1   分组、造模及给药   将45只大鼠随机分为3个组，假手术组、脊髓损伤组、Apelin-13组。脊髓损伤组和Apelin-13组大鼠采用横断损伤法建立脊髓损伤模型[11]，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg行麻醉，待角膜反射消失后俯卧固定，以T9-T11节段为中心做3 cm切口，切开筋膜并去除棘突上肌肉，蚊式咬骨钳咬除棘突，完全暴露脊髓，7号刀片在T9处将脊髓全横断，离断即刻可见大鼠后肢抽动、甩尾，随后下肢及尾部张力消失，足弓反张。假手术组大鼠不损伤脊髓。将大鼠止血后，逐层缝合肌肉、筋膜及皮肤，保暖至大鼠苏醒，膀胱按摩排尿3次/d直至大鼠可自行排尿。Apelin-13组大鼠在术后30 min以Apelin-13(0.2 mg/kg，纯度：99.80%)进行腹腔注射，脊髓损伤组和假手术组大鼠给予同等剂量的生理盐水，1次/d，连续治疗14 d。

1.4.2   免疫荧光染色   利用免疫荧光化学观察各组大鼠纵切面β-Ⅲ-tubulin和横切面GAP43的表达。大鼠在损伤后第14天麻醉后进行多聚甲醛灌注取材，脊髓组织在40 g/L多聚甲醛中4 ℃过夜，经15%(24 h)、30%(48 h)蔗糖(PBS配置，pH=7.2-7.4)脱水，PBS漂洗2次，滤纸充分吸干组织上的水分，将OCT挤入包埋盒中，置于干冰上，将合适大小的组织块放置于包埋盒中，超低温冰箱保存，冰冻切片机切片12 μm，待切片晾干后置于超低温冰箱保存，并于2周内进行实验。储存于超低温冰箱的切片拿出平衡至室温，PBS浸泡去除OCT，免疫组化笔圈出组织，滴加山羊血清封闭液，室温孵育1-1.5 h，倾去血清封闭液，不洗，直接滴加一抗anti-β-Ⅲ-tubulin(1∶500)，anti-GAP43(1∶300)，避光湿盒中4 ℃孵育过夜，第2天在冰箱中取出湿盒，平衡至室温，防止脱片，PBS洗玻片3次，每次10 min，滴加相应二抗(1∶400)，室温避光孵育2 h，PBS洗去二抗3次，每次10 min，DAPI复染，室温孵育8 min；PBS洗去DAPI，洗3次，每次10 min，滴加抗荧光淬灭封片剂，载玻片角上滴加玻璃胶，盖玻片封固，荧光显微镜拍摄。
1.4.3   免疫组化染色   利用免疫组化染色观察小胶质细胞(iba1)和星形胶质细胞(GFAP)的激活情况。大鼠在损伤第14天进行多聚甲醛灌注取材，脊髓组织梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡后进行石蜡包埋，石蜡切片厚度为4 μm，65 ℃烤片2 h，常温保存。待进行实验时，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，利用柠檬酸进行微波修复抗原，随后冷却至室温，免疫组化染色按照中杉金桥SP-9000通用SP试剂盒说明书执行，将冷却至室温的组织滴加内源性过氧化物酶阻断剂阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次，山羊血清封闭液封闭1 h，倾去血清滴加anti-GFAP(1∶1 000)和anti-iba1(1∶500)，37 ℃孵育1 h，洗去一抗，滴加生物素标记山羊抗兔/小鼠IgG聚合物，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次，DAB显色液进行显色，苏木精染液复染，盐酸乙醇分化，冲洗返蓝，脱水、透明、封固后光镜拍摄。
1.4.4   RT-PCR检测   为了评估神经再生情况，用RT-PCR检测神经GAP43的表达情况。取出的脊髓组织放入RNase-free管中，保存于超低温冰箱，提RNA前取出组织，每个样本组织质量为50-100 mg，所有过程需在冰上进行，防止RNA降解。剪碎后加入Trizol和高压过的磁珠，匀浆机迅速磨碎组织，拿出放在冰上降温，静置10 min，离心12 000 r/min，5 min，吸取上清；加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置10 min后，低温高速离心机12 000 r/min，15 min；取上层清液，加入异丙醇沉淀，静置10 min，离心12 000 r/min，10 min；弃去液体，加入体积分数75%乙醇(100%乙醇与RNase free water配置)，离心7 500 r/min，5 min；弃去液体，晾干，根据沉淀量加入RNase free water，混匀后，紫外分光光度计测量浓度(A260/A280 > 1.7，A260/A230 > 2)；然后使用Transcriptor Fist Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)将纯化的RNA 反转录为 cDNA。最后使用Roche FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)进行上机检测定量PCR，扩增条件为保温阶段95 ℃ 30 s，PCR阶段95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40次循环，以GAPDH作为内参基因。所有引物由湖南爱科瑞生物工程有限公司合成。采用均值法，以2-ΔΔCt(quantity)作为结果进行统计分析。引物序列见表1。

1.4.5   LFB染色   LFB染色评估脊髓损伤后脱髓鞘情况。石蜡切片脱蜡至体积分数95%乙醇，二甲苯透明；将玻片泡在髓鞘染色液中60℃烘箱中过夜进行染色；第2天用体积分数95%乙醇洗去LFB染液，髓鞘染色分化液分化，体积分数75%乙醇脱色，以髓鞘清晰为止；95%乙醇，100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，避光保存，光镜进行拍摄。
1.4.6   运动功能评分   于大鼠脊髓损伤术后第1，3，7，14天采用BBB运动评定量表评定大鼠后肢运动功能[12]，由2名不知晓实验分组的观察者进行，BBB评分为0分(无运动功能)至21分(正常运动功能)，取平均值作为每只大鼠运动功能的最终得分。
1.4.7   PC12细胞培养及H2O2诱导损伤   取出冻存细胞，37 ℃快速融化，移入15 mL离心管中，加入5 mL完全培养液稀释冻存液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入完全培养基(1640培养基+体积分数15%FBS+1%双抗)重悬，1×109 L-1 5 mL种于T25培养瓶中，每天换液。传至第3代时按CCK8说明书种至96孔板中，100 μL/孔，以30 μmol/L剂量的H2O2诱导损伤24 h，分别加入1，2，4 μmol/L的Apelin，24 h后加入CCK8试剂，测量吸光度值，检测细胞活力。
1.5   主要观察指标   ①免疫荧光观察脊髓组织连续性；②免疫组化观察小胶质细胞和星形胶质细胞的激活情况；③免疫荧光和RT-PCR观察神经生长因子表达；④LFB染色观察髓鞘密度；⑤CCK8检测给药H2O2诱导损伤的PC12细胞的活力，观察Apelin对损伤细胞活力的影响。
1.6   统计学分析   所有数据用GraphPad Prism 8.0.1 软件进行统计学分析及作图，以x±s的方式表示。相同处理不同时间点的比较行单因素方差分析，两种处理不同时间点的比较行析因设计的方差分析。P < 0.05 说明差异有显著性意义。文章的统计学方法已经滨州医学院生物统计学专家审核。

脊髓损伤是一种严重的会造成运动和感觉障碍的神经系统损伤[13]，通常被分为原发性损伤和继发性损伤[14]，继发性损伤常伴随有小胶质细胞活化、炎性因子浸润[15]、胶质瘢痕形成[16]、神经元死亡[17]、脱髓鞘等病理改变，现阶段仍没有有效的治疗方式，因此，开发一种新的有效的治疗方式尤为重要。

Apelin是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体，有研究报道，Apelin可通过抑制自噬、减轻细胞凋亡和抗炎来减轻创伤性脑损伤[18-20]，还可以减少活性氧的累积，减少诸如白细胞介素1、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α等炎性因子的分泌，减少Bax/Bcl-2的比值和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记末端阳性细胞的数量。另一个实验表明，经鼻给药Apelin-13促进了缺血性脑卒中小鼠的血管生成，起到了神经保护作用[21]，相似的促血管生成作用在心血管系统和血管内皮系统中也被观察到。Apelin也被用于神经系统疾病的研究中，如阿尔茨海默症、帕金森症和烟雾病等[22-24]。总之，Apelin/APJ在调节细胞增殖、凋亡、抑制炎症反应和血管重建等方面显示出功能。因此，推测Apelin在脊髓损伤中具有类似的功能。

脊髓损伤相关的炎症发生由于小胶质细胞和星形胶质细胞的激活[25]，随后反应性星形胶质细胞增生(星形胶质细胞活化)导致胶质细胞瘢痕形成，造成轴突生长受限[25]，进一步限制了脊髓损伤的修复。小胶质细胞是脊髓损伤后最重要的效应细胞，在脊髓损伤中发挥了双重作用，M1型巨噬细胞与多种促炎因子的产生有关，如白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α，M1表型的激活同时促进了星形胶质细胞的激活和极化，进一步增加了炎性反应[26]。此次实验结果显示，Apelin降低了小胶质细胞活化标记物iba1的阳性面积，这可能是前期研究结果中促炎因子分泌减少的原因。同时，Apelin的干预也降低了GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)的面积，减轻了胶质瘢痕的形成，这可能是免疫荧光结果中βⅢ-tubulin阳性面积和连续性增加的原因。

脱髓鞘是脊髓损伤的重要病理因素之一[27]，因此，损伤脊髓的再髓鞘化是调节功能恢复的一个重要因素。脊髓损伤造成了髓鞘的破坏，轴突脱髓鞘导致信号传导障碍，是运动和感觉损伤的重要原因。LFB染色对髓磷脂敏感，损伤髓鞘呈现不规律的粗空泡化[28]，在此次实验结果中，髓鞘染色结果显示脊髓损伤降低了髓鞘染色的阳性强度和密度，导致髓鞘空泡增多，Apelin治疗促进了损伤轴突的再髓鞘化，增加LFB染色阳性密度和规律性，减轻了由脊髓损伤带来的脱髓鞘，促进了传导功能恢复，为运动功能的恢复奠定了基础。

GAP43被认为是神经系统有效再生反应的关键组成部分，通过稳定肌动蛋白来介导神经元突起生长，在脊髓损伤后表达升高[29]，参与了损伤后神经再生过程[30-31]，在此次实验结果中，免疫荧光和RT-PCR结果显示，在脊髓损伤后14 d，GAP43表达量显著升高，给予Apelin干预后进一步显著增加了GAP43的表达量，提示Apelin促进了损伤脊髓的修复。

脊髓损伤后的不良微环境通常会导致局部神经元死亡[17]，神经元样PC12细胞通常用于研究脊髓损伤引起的神经元损伤[32]，在此次研究中，构建了H2O2诱导的细胞损伤模型来研究Apelin对PC12细胞的神经保护作用，研究结果发现Apelin干预24 h后，剂量为2，4 μmol/L的Apelin促进了H2O2诱导损伤的PC12细胞的细胞活力，起到了神经保护作用，这与YUNJUN ZOU等[33-34]的研究结果相同，这种保护作用是通过抑制氧化应激和自噬发生的。

综上所述，Apelin促进了横断脊髓损伤大鼠的后肢运动功能，减少了炎性细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)的激活，促进了损伤脊髓形态学的修复，促进了再髓鞘化和生长相关蛋白的表达，在PC12细胞构建的模拟神经元损伤模型中，提高了细胞活力，起到了神经保护作用。实验为Apelin治疗脊髓损伤提供了依据，但是，如何应对Apelin的短半衰期[35]，并探索Apelin发挥作用的分子机制，是下一步研究的重点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
Apelin：是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体，在体内具有多种活性形式，如Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36。Apelin/APJ在调节细胞增殖、凋亡、抑制炎症反应和血管重建等方面显示出功能。
生长相关蛋白43(growth associated protein-43，GAP43)：是一种轴突膜蛋白和神经特异性的蛋白，参与神经细胞生长及突触发育形成和神经细胞再生，在神经元发育和再生的过程中或神经损伤后表达升高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

脊髓损伤是一种严重的神经系统损伤，其中炎性反应和神经元损伤是不良预后的主要原因，如何抑制脊髓损伤继发性损伤是当前研究的难点和热点。

有研究报道，Apelin可通过抑制自噬，减轻细胞凋亡和抗炎来减轻创伤性脑损伤，还可以减少活性氧的累计，减少诸如白细胞介素1，白细胞介素10和肿瘤坏死因子α等炎性因子的分泌，减少Bax/Bcl-2的比值和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记末端阳性细胞的数量。另一个实验表明，经鼻给药Apelin-13促进了缺血性脑卒中小鼠的血管生成，起到了神经保护作用，相似的促血管生成作用在心血管系统和血管内皮系统中也被观察到。Apelin也被用于神经系统疾病的研究中，如阿尔茨海默症、帕金森症和烟雾病等。推测Apelin在脊髓损伤中具有类似的功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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