补肾调肝方含药血清对白细胞介素1β诱导软骨细胞凋亡的影响

doi:10.12307/2021.286

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (35): 5594-5598.doi: 10.12307/2021.286

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

补肾调肝方含药血清对白细胞介素1β诱导软骨细胞凋亡的影响

范帅1，林杰彬1，吴春飞1，徐兆辉2

1广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510000；2深圳市罗湖区中医院，广东省深圳市 518000

收稿日期:2020-12-03 修回日期:2020-12-12 接受日期:2021-01-16 出版日期:2021-12-18 发布日期:2021-08-03
通讯作者: 范帅，硕士，主治医师，广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510000
作者简介:范帅，男，1987年生，河北省人，汉族，2017年广州中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事中医药防治骨伤科疾病研究
基金资助:
广东省自然科学基金项目(2018A0303130103)；广东省中医药局科研项目(20201171)，项目负责人：范帅；广州中医药大学第三附属医院创新基金(sy201701)，项目负责人：范帅

Effect of serum containing Bushen Tiaogan prescription on interleukin-1beta-induced chondrocyte apoptosis

Fan Shuai1, Lin Jiebin1, Wu Chunfei1, Xu Zhaohui2

1The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2Shenzhen Luohu District Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Received:2020-12-03 Revised:2020-12-12 Accepted:2021-01-16 Online:2021-12-18 Published:2021-08-03
Contact: Fan Shuai, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
About author:Fan Shuai, Master, Attending physician, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Provincial Natural Science Foundation Project, No. 2018A0303130103; a grant from Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine, No. 20201171 (to FS); Guangzhou University of Chinese Medicine Innovation Fund, No. sy201701 (to FS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
SOX9：是调控软骨分化的主要基因，在所有分化的软骨细胞和软骨前细胞中均有表达，其对于建立软骨生长板及促进正常的软骨内成骨都是必需的，SOX9过表达时能抑制软骨细胞的肥大，负向调节软骨细胞肥大进程。因此，SOX9是参与骨关节炎软骨修复合成的重要介质，也是经典的软骨修复因子，在软骨的修复过程中起到重要的调节作用。
白细胞介素1β：是一种炎性细胞因子，其可通过扰乱软骨代谢平衡、抑制软骨细胞增殖、诱导软骨细胞凋亡、促进软骨基质降解，促进滑膜炎症发展，从而加速骨关节炎进程。
背景：前期研究发现，补肾调肝方能明显改善骨关节炎症状，临床疗效肯定，但缺乏相关的实验依据。
目的：探索补肾调肝方含药血清对白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡的影响及其分子机制。
方法：取传代培养的第3代大鼠软骨细胞，随机分为4组：PBS组(对照组)、10 μg/L 白细胞介素1β组、10 μg/L 白细胞介素1β+5%补肾调肝方含药血清(5%补肾调肝方含药血清组)及10 μg/L 白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清(10%补肾调肝方含药血清组)，分别处理软骨细胞 24 h。采用流式细胞术检测细胞凋亡；蛋白印迹分析SOX9、NF-κB P65和p-NF-κB P65蛋白的表达水平。实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①与对照组相比，白细胞介素1β可诱导软骨细胞的凋亡(P < 0.05)；②与白细胞介素1β组比，5%和10%补肾调肝方含药血清组软骨细胞的凋亡率均下降，且呈剂量依赖性(均P < 0.05)；③与对照组相比，白细胞介素1β组SOX9的表达明显降低(P < 0.05)，p-P65/P65明显升高(P < 0.05)；5%和10%补肾调肝方含药血清组SOX9的表达明显高于白细胞介素1β组(P < 0.05)，10%补肾调肝方含药血清组p-P65/P65显著低于白细胞介素1β组(P < 0.05)；④结果说明，补肾调肝方可能是通过调控SOX9/NF-κB抑制白细胞介素1β的诱导大鼠骨关节软骨细胞凋亡，起到缓解关节软骨退变的作用。
https://orcid.org/0000-0001-9864-6771 (范帅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 补肾调肝方, 关节软骨, SOX9/NF-κB

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have found that Bushen Tiaogan prescription can significantly improve the symptoms of osteoarthritis, with a positive clinical effect, but there is still a lack of relevant experimental evidence.
OBJECTIVE: To explore the effect of serum containing Bushen Tiaogan prescription on interleukin (IL)-1β-induced chondrocyte apoptosis and its molecular mechanism.
METHODS: Passage 3 chondrocytes from rats were randomly divided into four groups: PBS group (control group), 10 μg/L IL-1β group, 10 μg/L IL-1β+5% Bushen Tiaogan prescription group, 10 μg/L IL-1β+10% Bushen Tiaogan prescription group, in which chondrocytes were treated for 24 hours. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis, and western blot was used to analyze the expression levels of SOX9, NF-κB P65 and p-NF-κB P65 proteins. An approval was obtained from the Animal Experimental Ethics Committee of Guangzhou University of Chinese Medicine.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, IL-1β induced chondrocyte apoptosis (P < 0.05). Compared with the IL-1β group, the apoptosis rate of chondrocytes in the 10 μg/L IL-1β+5% Bushen Tiaogan prescription and 10 μg/L IL-1β+10% Bushen Tiaogan prescription groups significantly decreased in a dose-dependent manner (P < 0.05). Compared with the control group, the expression of SOX9 in the IL-1β group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05), and the expression of p-P65/P65 was significantly higher than that of the control group (P < 0.05). The expression of SOX9 in the 10 μg/L IL-1β+5% Bushen Tiaogan prescription and 10 μg/L IL-1β+10% Bushen Tiaogan prescription groups was significantly higher than that in the IL-1β group (P < 0.05), and the expression of p-P65/P65 in the 10 μg/L IL-1β+10% Bushen Tiaogan prescription group was significantly lower than that in the IL-1β group (P < 0.05). To conclude, Bushen Tiaogan prescription may inhibit IL-1β-induced apoptosis of rat osteoarticular chondrocytes by regulating SOX9/NF-κB, and play a role in alleviating articular cartilage degeneration.

Key words: osteoarthritis, Bushen Tiaogan prescription, articular cartilage, SOX9/NF-κB

中图分类号:

范帅, 林杰彬, 吴春飞, 徐兆辉. 补肾调肝方含药血清对白细胞介素1β诱导软骨细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5594-5598.

Fan Shuai, Lin Jiebin, Wu Chunfei, Xu Zhaohui. Effect of serum containing Bushen Tiaogan prescription on interleukin-1beta-induced chondrocyte apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(35): 5594-5598.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计含药血清干预体外细胞学实验，多组间均数比较单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点于2020年6至10月在广州中医药大学广东省中医药科学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠8只，3月龄，体质量220-280 g，由广州中医药大学动物实验中心提供；使用许可证号：SYXK(粤)2013-0001。
1.3.2 实验药品及试剂大鼠白细胞介素1β(PeproTech，400-01B-10，美国)；CCK-8(碧云天，C0038，上海)；DMEM高糖培养基(C11995500BT)、胎牛血清(10099141)、0.25%胰酶(含EDTA，25200072)、0.25%胰酶(不含EDTA，15050065)、青霉素/链霉素双抗(15140-122)(均购于美国Gbico公司)；蛋白一抗SOX9(82630S)、Phospho-NF-κB p65(3033T)、NF-κB p65(8242S)、β-actin(3700S)(均购自于美国CST公司)，Anti-Collagen II antibody(abcam，ab34712，美国)；Ⅱ型胶原蛋白酶DAPI(sigma，C6885，美国)；1%甲苯胺蓝染色(索莱宝，G3663，北京)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD，556547，美国)；补肾调肝方(成分：柴胡12 g、郁金15 g、骨碎补15 g、龟板30 g、怀牛膝15 g、川芎10 g、白芍30 g、玫瑰花12 g、川楝子12 g、白术15 g、菊花15 g、石菖蒲 15 g、甘草10 g)，共206 g生药(由广州中医药大学第三附属医院药剂室提供)。
1.3.3 主要仪器生物安全柜(青岛海尔生物医疗股份有限公司，青岛)；CO2细胞培养箱(Thermo Scientific，美国)；流式细胞仪(ACEA，Novo Quanteon)；倒置荧光显微镜(Nikon，日本)；高灵敏度化学发光成像仪(BIO-RAD，美国)；多功能酶标仪 tecan，瑞士)。
1.4 实验方法
1.4.1 补肾调肝方含药血清制备将2剂补肾调肝方加入 1 000 mL水煎煮1.5 h，过滤，药渣加800 mL水煎煮1.5 h，合并2次提取液约200 mL。根据《药理实验方法学》中介绍的方法，等效剂量人鼠换算得出21.45 g/kg(标准体质量)，根据大鼠质量将药液配成不同浓度相同体积灌胃，并于每天9：00和15：00左右灌胃，每天灌胃2次。共灌胃7 d。于末次灌胃后1 h，水合氯醛麻醉大鼠后，无菌操作，腹主动脉采血，室温静置2 h，用离心机3 000 r/min 离心15 min，吸取上清液，在56 ℃水浴锅中灭活30 min，用0.22 μm无菌滤膜抽滤除菌，分装后放置在-80 ℃保存备用。

1.4.2 大鼠原代软骨细胞提取无菌条件下取SD大鼠正常关节表面软骨组织，采用0.25%胰酶，2%Ⅱ型胶原蛋白酶分别消化后获得软骨细胞，培养于含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，48-72 h后可见细胞贴壁，每3 d换培养液。采用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原的免疫荧光染色法鉴定大鼠原代软骨细胞。

1.4.3 甲苯胺蓝染色取原代培养细胞，用体积分数20%的乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液至0.1%。将软骨细胞涂片后，立即放入体积分数95%的乙醇中固定，取出放在纸巾上。滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。无需干燥，直接镜检。
1.4.4 免疫荧光染色按1×104/孔的细胞数接种于含玻片的24孔板中，细胞培养箱中培养24 h后；40 g/L多聚甲醛室温固定细胞15 min，PBS洗细胞3次，每次5 min；用0.2%的Triton打孔25 min，PBS洗细胞3次，每次5 min，5%脱脂牛奶溶液室温封闭1 h；PBS洗细胞3次，每次5 min；加入一抗后４℃过夜，次日吸取一抗用PBS清洗细胞，加入二抗及DAPI室温孵育1 h，PBS清洗细胞，封固，避光晾干；荧光倒置显微镜下观察Ⅱ型胶原蛋白表达情况，并拍照、保存。
1.4.5 CCK-8法取第3代软骨细胞，96孔板中每孔接种 2 000个细胞，以不同浓度的含药血清(0.625%，1.25%，2.5%，5%，10%)分别进行处理24，48，72 h，到特定的时间后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，将培养板在细胞培养箱内孵育2 h，酶标仪测450 nm处的吸光度(测量过程全程避光)。
1.4.6 流式细胞术-细胞凋亡检测取第3代软骨细胞，6孔板中每孔接种1.8 mL含2×105个细胞的细胞悬液，贴壁48 h后，①对照组：加入 PBS 200 μL；②白细胞介素1β组：加入PBS 200 μL+10 μg/L白细胞介素1β 2 μL；③5%补肾调肝方含药血清组：加入PBS 100 μL+10 μg/L白细胞介素1β 2 μL+含药血清100 μL；④10%补肾调肝方含药血清组：加入10 μg/L白细胞介素1β 2 μL+含药血清200 μL。在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中处理软骨细胞24 h，收集培养基上清，离心后弃上清；预冷的PBS洗1遍，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞后加入预冷的PBS吹打，收集细胞，用3 000 r/min的转速离心5 min，弃上清；使用100 μL 1×buffering重悬细胞，每管分别加入5 μL FITC和5 μL PI染料，轻轻混匀，常温下孵育
15 min(避光)。孵育结束后加入400 μL 1×buffering重悬细胞，转移至流式管，上机流式机检测。
1.4.7 Western blot 检测SOX9、p-P65、P65蛋白表达取第3代软骨细胞，6孔板中每孔接种1.8 mL含2×105个细胞的细胞悬液，贴壁48 h后，①对照组：加入 PBS 200 μL；②白细胞介素1β组：加入PBS 200 μL+10 μg/L白细胞介素1β 2 μL；③5%补肾调肝方含药血清组：加入PBS 100 μL+10 μg/L白细胞介素1β 2 μL+含药血清100 μL；④10%补肾调肝方含药血清组：加入10 μg/L白细胞介素1β 2 μL+含药血清200 μL。在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中处理软骨细胞24 h，收集细胞，离心后加入细胞裂解液，提取蛋白质，离心取上清液，蛋白定量后取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE 电泳，随后将其转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗，同时以β-actin为内参，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤PVDF膜，加入二抗，室温孵育1 h，ECL显色，并放入显影仪中显影，拍照保存。
1.5 主要观察指标 ①原代软骨细胞形态与鉴定结果；②软骨细胞活力；③补肾调肝中药含药血清对白细胞介素1β诱导软骨细胞凋亡的影响；④补肾调肝中药含药血清对SOX9/NF-κB表达的影响。
1.6 统计学分析用SPSS 19.0软件对数据进行统计。多组间均数比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD- t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

对于骨关节炎的治疗，口服非类固醇抗炎药可快速缓解早期的症状，但这类药物不能明显延缓骨关节炎的发展进程，且长期服用可能会引起消化道、心血管及肾脏和肝脏损伤等多种不良反应[10]。因此，寻找更加可靠的药物替代方案一直是骨关节炎治疗的研究方向[11]。
祖国医学认为，骨关节炎属于“骨痹”“痹症”等范畴。《素问•肾气通天论》曰：“肾气乃伤，高骨乃坏”；《素问•上古天真论》曰：“丈夫……七八肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极”，由此可见，骨关节炎患者因人体的衰老，肝肾亏虚，骨得不到肝肾滋养，筋骨失养而发病。补肾调肝方中骨碎补、怀牛膝为君药，以补肝肾、强筋骨；白芍、柴胡、郁金、玫瑰花、川楝子、川芎、龟板等药物调肝气、养肝阴、补肝血；白术健脾益气，石菖蒲豁痰、理气活血；菊花散风清热、平肝阳；甘草调和诸药，使肾虚得以补，肝郁得以疏，切中病机、直达病处。
骨关节炎是一种常见的关节慢性退行性病变，其主要特征是关节软骨的破坏和丢失。骨关节炎的病理变化主要表现为软骨细胞数量的减少、关节软骨变薄及表型的改变，这些变化与软骨细胞的凋亡息息相关。而软骨细胞凋亡的增加，能促进软骨基质降解，减少基质合成，从而促进骨关节炎的进展[12]。SOX9主要在软骨细胞中表达，能调节软骨细胞的发育、成熟，是维持软骨细胞表型和软骨稳态的关键转录因子之一，在软骨细胞成熟分化过程中发挥重要的作用。SOX9是调控软骨分化的主要基因，在所有分化的软骨细胞和软骨前细胞中均有表达，其对于建立软骨生长板及促进正常的软骨内成骨都是必需的，SOX9过表达时能抑制软骨细胞的肥大，负向调节软骨细胞肥大进程[13-15]。因此，SOX9是参与骨关节炎软骨修复合成的重要递质，也是经典的软骨修复因子，在软骨的修复过程中起到重要的调节作用。
白细胞介素1β是一种炎性细胞因子，其可通过扰乱软骨代谢平衡、抑制软骨细胞增殖、诱导软骨细胞凋亡、促进软骨基质降解，促进滑膜炎症发展，从而加速骨关节炎进程[16-20]。有研究表明，白细胞介素1β可显著下调软骨细胞中SOX9的表达[21]。而NF-κB是SOX9的靶基因，NF-κB通路在各种细胞进程中起着重要作用，研究证实NF-κB通过抑制软骨基质胶原蛋白和蛋白多糖合成分泌、调节关节软骨损伤等作用广泛参与骨关节炎的病理生理过程，并在衰老和炎症过程中在骨关节炎软骨细胞中被激活[22-23]。NF-κB通路是调控炎症反应的经典通路，能被白细胞介素1β等炎症因子所激活，从而激活炎症级联反应，诱导细胞凋亡[24-25]。大量文献报道多种植物提取物可降低白细胞介素1β诱导的人软骨细胞NF-κB P65由细胞质向细胞核的转运，抑制NF-κB通路的活化及NF-κB P65磷酸化水平的升高[26-29]。鲁宏等[30]研究发现香叶木素可通过抑制NF-κB通路活化缓解白细胞介素1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡。
此次研究中，流式细胞术-细胞凋亡检测显示，与对照组相比，白细胞介素1β可诱导软细胞的凋亡，与白细胞介素1β组比，5%和10%补肾调肝方含药血清组软骨细胞的凋亡率均下降，且呈剂量依赖性，说明补肾调肝中药含药血清可抑制白细胞介素1β诱导软骨细胞凋亡。Western blot结果显示，白细胞介素1β可显著降低SOX9的表达，提高p-P65的表达。5%和10%补肾调肝方含药血清组SOX9的表达均明显高于白细胞介素1β组，10%补肾调肝方含药血清组p-P65/P65显著低于白细胞介素1β组，结果说明补肾调肝中药含药血清可上调白细胞介素1β诱导的软骨细胞SOX9表达，抑制NF-κB P65磷酸化水平的升高，即补肾调肝中药含药血清通过SOX9抑制NF-κB通路的活化，从而减少软骨细胞的凋亡。
综上所述，补肾调肝方能明显减少白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡，它可能通过上调参与关节软骨结构和功能的SOX9及其靶基因的正向调控，抑制软骨细胞凋亡。但是，补肾调肝方对骨关节炎患者SOX9信号通路的调控还有待于进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补肾调肝方含药血清对白细胞介素1β诱导软骨细胞凋亡的影响

Effect of serum containing Bushen Tiaogan prescription on interleukin-1beta-induced chondrocyte apoptosis

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