抑制半乳糖凝集素3促进椎间盘软骨终板细胞凋亡诱导椎间盘退变

doi:10.12307/2021.287

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (35): 5599-5603.doi: 10.12307/2021.287

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抑制半乳糖凝集素3促进椎间盘软骨终板细胞凋亡诱导椎间盘退变

刘岩路，胡炜，艾克拜尔，伊力亚，黄异飞

新疆医科大学附属中医医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2020-11-06 修回日期:2020-11-11 接受日期:2021-01-23 出版日期:2021-12-18 发布日期:2021-08-03
通讯作者: 黄异飞，博士，主任医师，新疆医科大学附属中医医院脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:刘岩路，男，1982年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，新疆医科大学在读博士，主治医师，主要从事脊柱外科方面的研究
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2019D01C164)，项目负责人：胡炜

Inhibition of galectin-3 promotes apoptosis of cartilage endplate cells and induces intervertebral disc degeneration

Liu Yanlu, Hu Wei, Aikebaier, Yiliya, Huang Yifei

Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-11-06 Revised:2020-11-11 Accepted:2021-01-23 Online:2021-12-18 Published:2021-08-03
Contact: Huang Yifei, MD, Chief physician, Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Liu Yanlu, MD candidate, Attending physician, Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2019D01C164 (to HW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
椎间盘软骨终板细胞：椎间盘软骨终板是椎间盘的重要组成部分，其结构组成可以通过椎间盘的生物力学和营养供给保证椎间盘的稳定性和完整性。椎间盘软骨终板退变是导致椎间盘退变的主要因素之一，在应力变化、老龄化、炎性因子浸润等作用下，会影响椎间盘的营养供给及软骨终板细胞的生物功能，参与或加速椎间盘退变。
半乳糖凝集素3：又称为Galectin-3，是β-半乳糖苷结合动物凝集素家族之一，是脊椎动物中唯一的嵌合体型半乳凝素，它包含一个保守的碳水化合物识别结构域，该结构域通过胶原样连接区与非凝集素结构域连接。Galectin-3主要依赖碳水化合物的方式参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞因子分泌等多种生理和病理过程。
背景：椎间盘软骨终板的退变破坏了椎间盘完整性，影响了营养和代谢物交换及细胞外基质代谢平衡，是导致椎间盘退变的主要因素。半乳糖凝集素3(Galectin-3)是半乳糖凝集素家族的一员，参与调控细胞增殖、凋亡、细胞黏附等多种生理和病理过程，但是Galectin-3在椎间盘软骨终板中的调控作用尚不明确。
目的：通过抑制剂GB1107干预Galectin-3，探讨其对大鼠软骨终板细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。
方法：将大鼠软骨终板细胞分为正常对照组和Galectin-3 GB1107抑制剂组，其中GB1107抑制剂组分为6个浓度组，即1，2.5，5，10，25和50 μmol/L组。MTT法检测3个时间点(12，24，48 h)各组椎间盘软骨终板细胞的增殖情况；采用最佳的抑制剂浓度25 μmol/L进行后续流式测定，检测大鼠软骨终板细胞凋亡和细胞周期的差异变化。
结果与结论：①Galectin-3抑制剂GB1107处理的大鼠软骨终板细胞的细胞增殖活性是浓度和作用时间依赖性的，在5-50 μmol/L浓度范围内，3个时间段的细胞增殖活性较正常对照组明显降低(P < 0.05)；在25 μmol/L浓度下，软骨终板细胞凋亡率显著高于正常对照组(P < 0.05)；②在抑制剂GB1107作用下，软骨终板细胞在G1期的数量显著高于正常对照组(P < 0.05)，在G2期和S期，抑制剂GB1107组的细胞数量显著低于正常对照组(P < 0.05)；③提示抑制Galectin-3可能会通过抑制软骨终板细胞DNA的复制，促进软骨终板细胞凋亡，导致椎间盘软骨终板的破坏，从而诱导椎间盘退变的发生和发展。
https://orcid.org/0000-0003-1987-9636 (刘岩路)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 半乳糖凝集素3, Galectin-3, 椎间盘退变, 软骨终板, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract: BACKGROUND: Cartilage endplate degeneration of the intervertebral disc destroys the integrity of the intervertebral disc and impacts the exchange of nutrition and metabolites and the metabolic balance of extracellular matrix, which is the main factor leading to intervertebral disc degeneration. Galectin-3, a member of galectin family, is expressed in various tissues and participates in the regulation of cell proliferation, apoptosis, cell adhesion and other physiological and pathological processes. However, the regulatory role of Galectin-3 in the cartilage endplate of the intervertebral disc is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Galectin-3 on the proliferation, apoptosis and cell cycle of rat cartilage endplate cells through the intervention of GB1107, a Galectin-3 inhibitor.
METHODS: In this study, the rat cartilage endplate cells were divided into normal control group and Galectin-3 gb1107 inhibitor groups (1, 2.5, 5, 10, 25, and 50 μmol/L). MTT was used to detect the proliferation of cartilage endplate cells in each group at three time points (12, 24, 48 hours). The optimal concentration of 25 μmol/L was used for follow-up flow cytometry to detect the difference of cell apoptosis and cell cycle.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation activity of chondrocytes treated with GB1107 was concentration- and time-dependent. In the concentration range of 5-50 μmol/L, the proliferation activity of chondrocytes was significantly lower than that of the normal control group at all three observational time points (P < 0.05). At the concentration of 25 μmol/L, the apoptosis rate of cartilage endplate cells was significantly higher than that of the normal control group (P < 0.05). Under the effect of GB1107, the number of cartilage endplate cells at G1 stage was significantly lower than that in the normal control group (P < 0.05), while the cell number at G2 and S stage was significantly lower than that in the normal control group (P < 0.05). Thererfore, inhibition of Galectin-3 may inhibit the DNA replication of cartilage endplate cells to promote the apoptosis of cartilage endplate cells and lead to the destruction of cartilage endplate, thereby inducing the occurrence and development of intervertebral disc degeneration.

Key words: Galectin-3, intervertebral disc degeneration, cartilage endplate, cell proliferation, cell apoptosis

中图分类号:

刘岩路, 胡炜, 艾克拜尔, 伊力亚, 黄异飞. 抑制半乳糖凝集素3促进椎间盘软骨终板细胞凋亡诱导椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5599-5603.

Liu Yanlu, Hu Wei, Aikebaier, Yiliya, Huang Yifei. Inhibition of galectin-3 promotes apoptosis of cartilage endplate cells and induces intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(35): 5599-5603.

图/表（结果） 3

2.1 MTT检测结果采用MTT检测方法，对不同浓度的Galectin-3抑制剂组(1，2.5，5，10，25，50 μmol/L GB1107)在不同时间段内进行细胞活性检测，实验结果如图1所示。在不同浓度的Galectin-3抑制剂GB1107干预条件下，各组软骨终板细胞在12 h开始，细胞活性开始降低，随着时间的推移，细胞活性也在不断下降。在Galectin-3抑制剂GB1107作用24 h时，抑制细胞活性率可达35%；在48 h时细胞活性持续降低，达到22%。在抑制剂5-50 μmol/L浓度范围内，3个时间段的细胞活性与正常对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)。随着抑制剂浓度的增加及作用时间的延长，细胞活性明显降低，与正常对照组比较差异均有显著性意义 (P < 0.05)。因此，可以证明细胞的增殖能力与Galectin-3抑制剂浓度和时间成负相关依赖性。

2.2 细胞凋亡结果采用AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒定量大鼠软骨终板细胞。图2A-C显示了各个分组细胞群处于凋亡的百分比。结果表明在25 μmol/L 的Galectin-3抑制剂GB1107干预下，大鼠软骨终板细胞的凋亡率显著高于正常对照组(P < 0.05)。

2.3 细胞周期结果为了探讨GB1107诱导的凋亡是否与细胞周期停滞有关，使用流式细胞仪检测了大鼠软骨终板细胞的细胞周期分布，以分析细胞DNA含量，具体结果见图3。在Galectin-3抑制剂组G1期，大鼠软骨终板细胞百分比显著高于正常对照组(P < 0.05)；在G2期，大鼠软骨终板细胞百分比显著低于正常对照组(P < 0.05)；在S期，大鼠软骨终板细胞百分比显著低于正常对照组(P < 0.05)。

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引言

下腰痛是与肌肉骨骼脊柱疾病相关的最常见疾病，主要表现为肋缘和臀下皱襞之间的疼痛、僵硬、肌肉紧张，甚至是影响膝盖以下小腿的神经根小腿疼痛[1]。全球的下腰痛发生率为85%左右，在任何给定时间，所有年龄段的下腰痛发生率为18%[1]，此外，个人一生中经历下腰痛的可能性为80%[2]。目前下腰痛已经是一种全球性的医疗保健问题，已然成为致残主要因素之一[3]，严重影响了患者的心理状态、生活质量和经济负担，随着全球人口老龄化，与下腰痛相关的负担会呈指数级增加[4-5]。在临床上，下腰痛可能是多种疾病的症状，而椎间盘退变是导致下腰痛发生的主要因素[6]。从形态学上表明，椎间盘内无血管行走，营养的供应和代谢物质的排除主要是依靠软骨终板来完成的[7]，椎间盘一旦出现退变现象，会导致软骨终板出现撕裂、骨化，进而延伸出椎管狭窄、椎体变形等临床问题，直接导致椎间盘形态稳定和功能缺失，使得下腰痛发生与恶化[8-10]。
半乳糖凝集素3(Galectin-3)是一种29-35 kDa的蛋白质，属于β-半乳糖苷结合动物凝集素家族，在各种组织中均有表达。近年来对Galectin-3的研究主要集中在各类恶性肿瘤、骨性关节炎、成骨细胞和破骨细胞等领域内，研究也证实了Galectin-3在这些疾病中起到重要作用，参与了多种生物学过程。在骨研究方面，Galectin-3对骨细胞的分化、活性、黏附与调控起到重要作用，但并没有在骨骼生理与病理学上的作用进行深入分析；而在椎间盘退变、软骨终板、软骨细胞等方面并没有过多的此类研究。此项目拟通过对Galectin-3抑制剂进行实验，研究其对椎间盘软骨终板细胞的调节关系，探讨Galectin-3与椎间盘退变的关系，为后期Galectin-3的机制研究提供基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，单因素方差分析结合LDS事后检验。
1.2 时间及地点于2020年5至10月在新疆医科大学实验室完成。
1.3 实验材料大鼠软骨终板细胞和大鼠软骨终板细胞培养基(Procell，中国)；MTT试剂盒(BIOFROX，中国)；Fetal Bovine Serum，Penicillin-Streptomycin，Trypsin-EDTA(0.25%)，phenol red(GIBCO，美国)；细胞凋亡试剂盒(三箭，中国)；Galectin-3抑制剂GB1107(Selleck，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞复苏与传代将大鼠软骨终板细胞从液氮中取出，快速放入37 ℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有5 mL培养基的离心管中，离心收集细胞，
用含体积分数10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37 ℃体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。间隔2 d更换培养液1次。细胞融合至80%左右时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集细胞，按1∶3传代，取第2 代细胞进行实验。

1.4.2 细胞存活率分析取处于对数生长期、生长状态良好的大鼠软骨终板细胞，以5×103个/孔接入96孔板，同时设空白组，37 ℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS)，然后按照如下分组对细胞进行处理：正常对照组和不同浓度的Galectin-3抑制剂GB1107组(1，2.5，5，10，25，50 μmol/L)，处理时间分别为12，24，48 h。在指定时间内，每孔加入10 μL MTT，37 ℃培养4 h；吸出培养基，加入 150 μL DMSO振荡10 min，酶标仪测定各孔吸光值A568 nm。所有实验重复3次。
1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡将细胞以5×105个/孔接入6孔板，37 ℃培养过夜，正常对照组正常培养；Galectin-3抑制剂组加入25 μmol/L GB1107，作用时间为24 h。然后两组均加入10%的7-AAD缓冲液，混匀室温避光反应10 min，再加入 450 μL的 Binding Buffer 和 1 μL Annexin V-APC 混匀，室温避光反应 10 min，将细胞在1 h内用流式细胞仪进行处理，并对凋亡细胞进行定量分析。
1.4.4 PI检测细胞周期将细胞以5×105个/孔接入6孔板，37 ℃培养过夜，正常对照组正常培养、Galectin-3抑制剂组加入25 μmol/L GB1107，作用时间为24 h。然后两组用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，PBS重悬润洗2次；加入100 μL PBS重悬细胞，缓慢加入700 μL预冷的体积分数80%的乙醇，使乙醇终浓度为70%，4 ℃固定4 h以上，1 500 r/min，5 min，预冷PBS润洗2次，加入100 μL RNase(50 mg/L)，37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI(50 mg/L)，4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪检测。
1.5 主要观察指标
1.5.1 MTT法检测细胞增殖活性通过MTT法检测在12，24，48 h 3个时间点中不同浓度(1，2.5，5，10，25，50 μmol/L)Galectin-3抑制剂作用下细胞增殖活性的变化，确定最佳干预时间和浓度。
1.5.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况及细胞周期变化采用25 μmol/L的Galectin-3抑制剂，24 h培育，通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期。
1.6 统计学分析所有数据采用x±s表示，利用SPSS 13.0软件进行数据处理，对计量资料进行单因素方差分析，采用LDS法进行两两比较，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘退变是一类椎间盘自然退化及各种危险因素暴露导致椎间盘发生一系列退行性的生理病理过程。自20世纪开始，通过对椎间盘退变的不断研究，发现其致病因素主要包括应力损伤、炎性反应、衰老、菌类感染、营养障碍、遗传和肿瘤等，这些因素会导致椎间盘退变的发生[11-13]。终板是椎间盘的重要组成部分，在维持椎骨正常形态、保护椎骨承受压力、吸收静态压力等方面起到积极的作用，同时终板是椎体中渗透转运能力的主要承担者，是椎体的主要营养供应通路[14]。研究表明，软骨终板的损伤与软骨终板退变有直接联系，软骨终板损伤程度与软骨终板退变的可能性成正相关[15-16]，而软骨终板退变与椎间盘退变的产生又有着密切的联系，但至今其确切机制仍不十分清楚。
Galectin-3是β-半乳糖苷结合蛋白家族成员之一，在上皮细胞、免疫细胞、巨噬细胞中都有表达，可以有效调节不同组织和器官中细胞黏附、生长、迁移、炎性反应和凋亡等病理过程[17]。目前研究表明，Galectin-3可以通过诱导调节炎性因子分泌，进而参与关节炎的产生与发展[18-20]。REESINK等[21]研究表明，Galectin-3在细胞内抑制关节和肥大软骨细胞的凋亡，促进细胞增殖；但因为细胞类型不同，Galectin-3也能促进细胞凋亡[22-24]。尽管Galectin-3被大量研究[25]，但在终板细胞内对增殖、凋亡和细胞周期的调节作用还尚未被研究。
HAFSIA等[26]通过细胞和动物实验研究发现，Galectin-3敲除小鼠的细胞分解代谢增强，细胞出现高凋亡的表型，相较于野生型小鼠，敲除小鼠对软骨细胞的损伤更为严重。此次研究通过对终板细胞进行Galectin-3的抑制剂干预实验，探讨Galectin-3基因对终板细胞活性调节的病理模式；通过对MTT实验数据结果分析发现，软骨终板细胞活性以Galectin-3抑制剂剂量和时间依赖的方式发生，同时通过细胞凋亡实验也证实了，Galectin-3抑制剂可以显著提高终板细胞的凋亡率，清楚表明了Galectin-3在终板细胞增殖方面的作用。这与ARAD等[27]的研究一致，Galectin-3的缺失会诱导细胞活力降低。但也有研究通过动物实验发现，注射Galectin-3会使得实验动物膝关节的软骨发生退变和破坏，表明了Galectin-3对软骨细胞的调节作用，可抑制细胞活性，促进凋亡[28-29]，与此次实验结果并不一致。这可能由于此次研究的靶细胞不一致导致，也可能是对下游分子或信号通路的影响导致其在凋亡和增殖两方面都起到调控的作用。
细胞周期分为G0/G1 期、S 期、G2/M 期3个时期，细胞周期进程受到多种周期蛋白和信号通路影响，完整的细胞周期构成了细胞的复制分裂过程，为生命活动提供了基础[30]；3个时期包括2个监测点，分别处于G1/S期和G2/M期。为了解其具体细胞凋亡或增殖中的机制作用，进行了细胞周期分析，与正常对照细胞相比，在经过Galectin-3处理的细胞中观察到大比例的G1期细胞群，而S期和G2期细胞群数量显著降低，这表明Galectin-3抑制剂会使DNA受损，导致细胞周期停滞在G1期，无法进入S期和G2期。细胞周期结果阐明了Galectin-3抑制剂可能在G1/S期检查点上发挥作用，使得S期减少，G2期停滞，导致DNA合成降低。因而，此次实验数据表明Galectin-3抑制剂的抑制作用可能与细胞周期的变化有关。
此次研究结果表明Galectin-3的作用位点在G1/S期监测点上，该监测点的细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶主要是细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白依赖性激酶4及细胞周期蛋白依赖性激酶6 [31]，两者结合构成的细胞周期复合体发挥促进细胞周期作用，使细胞由 G1 期进入 S 期，因此Galectin-3可能通过抑制细胞周期蛋白或细胞周期蛋白依赖性激酶活性发挥作用。但由于细胞周期除了由这些周期蛋白与激酶影响外，还可以被大量的相关信号通路所影响，与G1/S期有关的信号通路包括p53信号通路、p21信号通路、p27信号通路、PI3K/Akt信号通路等[32]。YURUBE等[33]研究表明，细胞消失、凋亡与椎间盘细胞中 P53 介导的线粒体信号通路有关。FENG等[34]通过应力实验也发现，在应力作用下，会激活p53信号通路，调节软骨终板细胞的早衰。有大量研究发现软骨终板细胞的凋亡是通过激活p38信号通路及MAPK信号通路、抑制PI3K/Akt信号通路，来抑制软骨终板细胞的活性[35]。这些结果均表明了信号通路在细胞周期中的作用，但Galectin-3在G1/S期监测点上发挥作用的具体机制还有待进一步研究。
综上所述，此次研究表明Galectin-3抑制剂具有抑制软骨终板细胞增殖的作用；此外，Galectin-3抑制剂的作用可能是通过抑制软骨终板细胞增殖、扰乱细胞周期、降低DNA合成等途径介导的，这为诊断椎间盘退变提供了更多新的思路及方向，临床上可基于其表达水平来判断治疗，为预防和治疗椎间盘退变及相关疾病提供新的理论与实验依据，而Galectin-3对终板细胞起到的具体分子机制还有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

抑制半乳糖凝集素3促进椎间盘软骨终板细胞凋亡诱导椎间盘退变

Inhibition of galectin-3 promotes apoptosis of cartilage endplate cells and induces intervertebral disc degeneration

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