法舒地尔通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤

doi:10.12307/2021.144

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 5012-5017.doi: 10.12307/2021.144

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

法舒地尔通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤

郭敏芳1，张慧宇1，章培军1，白振军1，于婧文1，王玉银1，2，魏文悦1，3，宋丽娟2，3，柴智2，尉杰忠1，4，
马存根1，2

1山西大同大学脑科学研究所/神经炎症及变性疾病基础与应用研究山西省重点实验室，山西省大同市 037009；2国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室/神经生物学研究中心，山西中医药大学，山西省晋中市 030619；3山西医科大学第一临床医学院神经科，山西省太原市 030000；4大同市第五人民医院神经科，山西省大同市 037009

收稿日期:2020-07-24 修回日期:2020-07-25 接受日期:2020-08-19 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 马存根，博士，教授，博士生导师，山西大同大学脑科学研究所/神经炎症及变性疾病基础与应用研究山西省重点实验室，山西省大同市 037009；国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室/神经生物学研究中心，山西中医药大学，山西省晋中市 030619
作者简介:郭敏芳，女，山西省大同市人，硕士，副教授，主要从事神经变性疾病的基础和应用研究。
基金资助:
山西省平台基地专项(201805D111009)，项目负责人：马存根；山西省平台基地专项(201805D131005)，项目负责人：尉杰忠；山西省高等学校科技创新项目(2020L0484)，项目负责人：郭敏芳；神经炎症及变性疾病基础与应用研究山西省重点实验室开放课题(KF2019007)，项目负责人：郭敏芳

Fasudil inhibits lipopolysaccharide-induced astrocytic injury by regulating Nrf2/HO-1 signaling pathway

Guo Minfang1, Zhang Huiyu1, Zhang Peijun1, Bai Zhenjun1, Yu Jingwen1, Wang Yuyin1, 2, Wei Wenyue1, 3, Song Lijuan2, 3, Chai Zhi2, Yu Jiezhong1, 4, Ma Cungen1, 2

Received:2020-07-24 Revised:2020-07-25 Accepted:2020-08-19 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Ma Cungen, MD, Professor, Doctoral supervisor, Institute of Brain Science, Shanxi Datong University/Key Laboratory of Shanxi Province for Basic and Applied Research on Neuroinflammation and Degenerative Diseases, Datong 037009, Shanxi Province, China; Key Laboratory of Multiple Sclerosis, Nourishing Qi and Activating Blood, National Administration of Traditional Chinese Medicine/Neurobiology Research Center, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
About author:Guo Minfang, Master, Associate professor, Institute of Brain Science, Shanxi Datong University/Key Laboratory of Shanxi Province for Basic and Applied Research on Neuroinflammation and Degenerative Diseases, Datong 037009, Shanxi Province, China
Supported by:
the Shanxi Province Platform Base Special Project, No. 201805D111009 (to MCG), No. 201805D131005 (to YJZ); the Science and Technology Innovation Project of Shanxi Colleges and Universities, No. 2020L0484 (to GMF); the Opening Project of Key Laboratory of Shanxi Province for Basic and Applied Research on Neuroinflammation and Degenerative Diseases, No. KF2019007 (to GMF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

法舒地尔：也称为HA-1077，是一种新型的异喹啉磺酰胺衍生物和唯一临床上可使用的Rho激酶抑制剂，临床上主要用于缺血性脑血管疾病。有研究表明法舒地尔在中枢神经系统中具有多种功能，包括激活内源性神经干细胞，促进神经营养因子的释放，抑制细胞内钙离子的释放，抑制神经炎症反应，保护神经细胞，改善神经功能并促进轴突再生等。
核因子E2相关因子2(Nrf2)：是一种亮氨酸拉链转录激活因子，调节多种抗氧化途径。在生理条件下，Nrf2锚定在细胞质中，在氧化应激条件下，Nrf2从细胞质转移到细胞核，进而激活其下游多种分子并驱动多种功能，包括抗氧化应激、抗凋亡和抗炎作用。
背景：越来越多的证据表明，ROCK信号通路参与了炎症过程和氧化应激。法舒地尔是一种有效的Rho激酶抑制剂，课题组前期的系列研究证明法舒地尔具有神经保护作用。然而，法舒地尔是否对星形胶质细胞的氧化损伤具有保护作用及其可能的机制尚不明确。
目的：探讨法舒地尔对脂多糖诱导的星形胶质细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。
方法：将培养的C57BL/6小鼠星形胶质细胞分为PBS对照组、脂多糖模型组(1 mg/L)、脂多糖(1 mg/L)+法舒地尔(15 mg/L)干预组。药物作用24 h后，MTT法检测星形胶质细胞的活性，试剂盒测定星形胶质细胞中丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性以评估细胞的氧化应激水平，免疫荧光染色法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的表达，免疫荧光染色法检测星形胶质细胞中核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)的核内转移及血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的表达，Western blot 法检测总Nrf2、核内Nrf2和HO-1的蛋白水平。
结果与结论：①与PBS对照组比较，脂多糖组星形胶质细胞活性降低，法舒地尔改善脂多糖诱导的细胞损伤；②与PBS对照组比较，脂多糖导致星形胶质细胞中超氧化物歧化酶活性明显降低，丙二醛水平明显升高(P < 0.01)；法舒地尔能够显著提高超氧化物歧化酶活性(P < 0.01)，减少丙二醛水平(P < 0.01)；③与PBS对照组比较，脂多糖组细胞cleaved-caspase-3表达明显增加；与脂多糖组比较，法舒地尔干预组cleaved-caspase-3表达降低；④法舒地尔可以促进Nrf2A的核内转位，明显增强脂多糖损伤后总Nrf2、核内Nrf2和HO-1的表达；⑤结果表明，法舒地尔能够通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤。

https://orcid.org/0000-0003-2637-6367(郭敏芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 星形胶质细胞, 脂多糖, 法舒地尔, 核因子E2相关因子2, 氧化应激, 凋亡, 实验

Abstract: BACKGROUND: More and more evidences show that ROCK signaling pathway is involved in inflammation and oxidative stress. Fasudil is an effective Rho kinase inhibitor. Our previous series of studies have proved that fasudil has neuroprotective effects. However, it is still unclear that whether fasudil has protective effect on oxidative damage to astrocytes and its possible mechanisms.
OBJECTIVE: To explore the protective effect and mechanism of fasudil on lipopolysaccharide-induced oxidative injury in astrocytes.
METHODS: Primary C57BL/6 mouse astrocytes were cultured and divided into PBS control group, lipopolysaccharide stimulation group (1 mg/L), lipopolysaccharide (1 mg/L) combined with fasudil (15 mg/L) treatment group. After 24 hours of treatment, MTT assay was used to detect the viability of astrocytes. The content of malondialdehyde and the activity of superoxide dismutase in astrocytes were measured using the kit to evaluate the level of oxidative stress. Immunofluorescence staining was used to detect the expression of cleaved-caspase-3, the nuclear translocation of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and the expression of heme oxygenase-1 (HO-1) in astrocytes. Western blot assay was used to detect the total Nrf2, nuclear Nrf2 and HO-1 protein levels.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the PBS control group, the astrocyte viability in the lipopolysaccharide stimulation group was reduced, and fasudil treatment improved the cell damage induced by lipopolysaccharide. (2) Compared with the PBS control group, lipopolysaccharide resulted in a significant decrease in the activity of superoxide dismutase and a significant increase in the level of malondialdehyde in astrocytes (P < 0.01). Fasudil significantly increased the activity of superoxide dismutase (P < 0.01) and reduced the level of malondialdehyde (P < 0.01). (3) Compared with the PBS control group, the expression of cleaved-caspase-3 was significantly increased in the lipopolysaccharide stimulation group. Compared with the lipopolysaccharide stimulation group, the expression of cleaved-caspase-3 was decreased in the lipopolysaccharide combined with fasudil treatment group. (4) Fasudil could promote the nuclear translocation of Nrf2 and significantly increase the expression of total Nrf2, nucleus Nrf2 and HO-1 after lipopolysaccharide stimulation. (5) The results indicate that fasudil can inhibit lipopolysaccharide-induced astrocytic injury by regulating the Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Key words: astrocyte, lipopolysaccharide, fasudil, nuclear factor erythroid 2-related factor 2, oxidative stress, apoptosis, experiment

中图分类号:

郭敏芳, 张慧宇, 章培军, 白振军, 于婧文, 王玉银, 魏文悦, 宋丽娟, 柴智, 尉杰忠, 马存根. 法舒地尔通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 5012-5017.

Guo Minfang, Zhang Huiyu, Zhang Peijun, Bai Zhenjun, Yu Jingwen, Wang Yuyin, Wei Wenyue, Song Lijuan, Chai Zhi, Yu Jiezhong, Ma Cungen. Fasudil inhibits lipopolysaccharide-induced astrocytic injury by regulating Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 5012-5017.

图/表（结果） 6

2.1 GFAP免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞将接种于细胞爬片的第2代星形胶质细胞在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养2 d，然后进行GFAP免疫荧光染色，结果显示星形胶质细胞的纯度可以达到95%以上，见图1。

2.2 法舒地尔对脂多糖刺激星形胶质细胞损伤的保护作用 MTT结果显示，与PBS对照组相比，脂多糖损伤星形胶质细胞24 h后，细胞活力明显下降(P < 0.01)，而法舒地尔能够逆转脂多糖对星形胶质细胞造成的损伤作用，显著提高细胞的存活率(P < 0.05)，见图2。

2.3 法舒地尔对脂多糖刺激的星形胶质细胞表达cleaved-caspase-3的影响采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件监测cleaved-caspase-3的荧光强度值。与PBS对照组相比，脂多糖处理后星形胶质细胞cleaved-caspase-3的表达明显升高(P < 0.01)；与脂多糖模型组相比，脂多糖+法舒地尔干预组cleaved-caspase-3的表达显著降低(P < 0.01)，见图3。

2.4 法舒地尔对脂多糖刺激的星形胶质细胞产生超氧化物歧化酶和丙二醛的影响与PBS对照组比较，脂多糖导致星形胶质细胞中超氧化物歧化酶活性明显降低，丙二醛水平明显升高(P < 0.01)；法舒地尔能够显著提高超氧化物歧化酶活性(P < 0.01)，减少丙二醛水平(P < 0.01)，抑制脂多糖诱导的氧化应激损伤，见图4。

2.5 法舒地尔对脂多糖刺激星形胶质细胞表达Nrf2的调节作用该研究进一步分析了Nrf2的表达及其核转移的情况以探讨法舒地尔改善脂多糖对星形胶质细胞氧化损伤作用的机制。免疫荧光结果显示，PBS对照组Nrf2主要分布在细胞质中，细胞核中的含量较少；脂多糖模型组细胞质和细胞核内Nrf2含量均减少，而法舒地尔作用24 h后，细胞核中的Nrf2含量明显增加，说明法舒地尔可以促进Nrf2向核内转移。Western blot蛋白定量结果发现，与PBS对照组比较，脂多糖模型组总Nrf2和细胞核内Nrf2表达均降低(P < 0.01)，而法舒地尔作用24 h后，总Nrf2和细胞核内Nrf2表达均明显增加(P < 0.01)，见图5，进一步说明法舒地尔可以使Nrf2激活并促进其向核内转移。

2.6 法舒地尔对脂多糖刺激的星形胶质细胞抗氧化蛋白HO-1表达的影响利用免疫荧光染色检测3组细胞HO-1的表达，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析HO-1的荧光强度值。结果显示，与PBS对照组相比，脂多糖模型组星形胶质细胞HO-1的表达显著降低(P < 0.01)；与脂多糖组相比，脂多糖+法舒地尔干预组HO-1表达明显增加(P < 0.01)，见图6，这表明法舒地尔的抗氧化作用与提高抗氧化蛋白HO-1的表达有关。

参考文献

[1] LIGUORI I, RUSSO G, CURCIO F, et al. Oxidative stress, aging, and diseases. Clin Interv Aging. 2018;13:757-772.
[2] TOBORE TO. On the central role of mitochondria dysfunction and oxidative stress in Alzheimer’s disease. Neurol Sci. 2019;40(8):1527-1540.
[3] POHANKA M. Oxidative stress in Alzheimer disease as a target for therapy. Bratisl Lek Listy. 2018;119(9):535-543.
[4] MATSCHKE V, THEISS C, MATSCHKE J. Oxidative stress: the lowest common denominator of multiple diseases. Neural Regen Res. 2019;14(2):238-241.
[5] FRAUNBERGER EA, SCOLA G, LALIBERTÉ VL, et al. Redox Modulations, Antioxidants, and Neuropsychiatric Disorders. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016:4729192.
[6] MCBEAN GJ. Cysteine, Glutathione, and Thiol Redox Balance in Astrocytes. Antioxidants (Basel). 2017;6(3):62.
[7] CABEZAS R, BAEZ-JURADO E, HIDALGO-LANUSSA O, et al. Growth Factors and Neuroglobin in Astrocyte Protection Against Neurodegeneration and Oxidative Stress. Mol Neurobiol. 2019;56(4):2339-2351.
[8] JOE EH, CHOI DJ, AN J, et al. Astrocytes, Microglia, and Parkinson’s Disease. Exp Neurobiol. 2018;27(2):77-87.
[9] GONZÁLEZ-REYES RE, NAVA-MESA MO, VARGAS-SÁNCHEZ K, et al. Involvement of Astrocytes in Alzheimer’s Disease from a Neuroinflammatory and Oxidative Stress Perspective. Front Mol Neurosci. 2017;10:427.
[10] RIZOR A, PAJARILLO E, JOHNSON J, et al. Astrocytic Oxidative/Nitrosative Stress Contributes to Parkinson’s Disease Pathogenesis: The Dual Role of Reactive Astrocytes. Antioxidants (Basel). 2019;8(8):265.
[11] MOLINARI C, MORSANUTO V, GHIRLANDA S, et al. Role of Combined Lipoic Acid and Vitamin D3 on Astrocytes as a Way to Prevent Brain Ageing by Induced Oxidative Stress and Iron Accumulation. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:2843121.
[12] SHEFA U, JEONG NY, SONG IO, et al. Mitophagy links oxidative stress conditions and neurodegenerative diseases. Neural Regen Res. 2019;14(5):749-756.
[13] HAMDI Y, KADDOUR H, VAUDRY D, et al. The octadecaneuropeptide ODN protects astrocytes against hydrogen peroxide-induced apoptosis via a PKA/MAPK-dependent mechanism. PLoS One. 2012;7(8):e42498.
[14] SANDBERG M, PATIL J, D’ANGELO B, et al. NRF2-regulation in brain health and disease: implication of cerebral inflammation. Neuropharmacology. 2014;79:298-306.
[15] CAO S, CHAO D, ZHOU H, et al. A novel mechanism for cytoprotection against hypoxic injury: δ-opioid receptor-mediated increase in Nrf2 translocation. Br J Pharmacol. 2015;172(7):1869-1881.
[16] NITURE SK, KASPAR JW, SHEN J, et al. Nrf2 signaling and cell survival. Toxicol Appl Pharmacol. 2010;244(1):37-42.
[17] SHU L, WANG C, WANG J, et al. The neuroprotection of hypoxic preconditioning on rat brain against traumatic brain injury by up-regulated transcription factor Nrf2 and HO-1 expression. Neurosci Lett. 2016;611:74-80.
[18] FU PC, TANG RH, YU ZY, et al. The Rho-associated kinase inhibitors Y27632 and fasudil promote microglial migration in the spinal cord via the ERK signaling pathway. Neural Regen Res. 2018;13(4):677-683.
[19] YAN Y, YU J, GAO Y, et al. Therapeutic potentials of the Rho kinase inhibitor Fasudil in experimental autoimmune encephalomyelitis and the related mechanisms. Metab Brain Dis. 2019;34(2):377-384.
[20] WANG J, SUI RX, MIAO Q, et al. Retraction: Effect of Fasudil on remyelination following cuprizone-induced demyelination. CNS Neurosci Ther. 2020;26(7):778.
[21] 张慧宇,郭敏芳,于婧文,等.法舒地尔(Fasudil)抑制脂多糖诱导的小鼠星形胶质细胞活化和炎性反应及其机制[J].细胞与分子免疫学杂志, 2018,34(6):505-510.
[22] WANG Y, ZHAO CS. Sigma-1 receptor activation ameliorates LPS-induced NO production and ROS formation through the Nrf2/HO-1 signaling pathway in cultured astrocytes. Neurosci Lett. 2019;711:134387.
[23] POURHANIFEH MH, SHAFABAKHSH R, REITER RJ, et al. The Effect of Resveratrol on Neurodegenerative Disorders: Possible Protective Actions Against Autophagy, Apoptosis, Inflammation and Oxidative Stress. Curr Pharm Des. 2019;25(19):2178-2191.
[24] CHERBUIN N, WALSH E, BAUNE BT, et al. Oxidative stress, inflammation and risk of neurodegeneration in a population sample. Eur J Neurol. 2019; 26(11):1347-1354.
[25] SOFRONIEW MV, VINTERS HV. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 2010;119(1):7-35.
[26] PACHECO SM, AZAMBUJA JH, DE CARVALHO TR, et al. Glioprotective Effects of Lingonberry Extract Against Altered Cellular Viability, Acetylcholinesterase Activity, and Oxidative Stress in Lipopolysaccharide-Treated Astrocytes. Cell Mol Neurobiol. 2018;38(5):1107-1121.
[27] SHARMA A, PATRO N, PATRO IK. Lipopolysaccharide-Induced Apoptosis of Astrocytes: Therapeutic Intervention by Minocycline. Cell Mol Neurobiol. 2016;36(4):577-592.
[28] PORTER AG, JÄNICKE RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 1999;6(2):99-104.
[29] SHU Q, FAN H, LI SJ, et al. Protective effects of Progranulin against focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by suppressing endoplasmic reticulum stress and NF-κB activation in reactive astrocytes. J Cell Biochem. 2018;119(8):6584-6597.
[30] OTTERBEIN LE, FORESTI R, MOTTERLINI R. Heme Oxygenase-1 and Carbon Monoxide in the Heart: The Balancing Act Between Danger Signaling and Pro-Survival. Circ Res. 2016;118(12):1940-1959.
[31] LOBODA A, DAMULEWICZ M, PYZA E, et al. Role of Nrf2/HO-1 system in development, oxidative stress response and diseases: an evolutionarily conserved mechanism. Cell Mol Life Sci. 2016;73(17):3221-3247.
[32] ALI T, KIM T, REHMAN SU, et al. Natural Dietary Supplementation of Anthocyanins via PI3K/Akt/Nrf2/HO-1 Pathways Mitigate Oxidative Stress, Neurodegeneration, and Memory Impairment in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease. Mol Neurobiol. 2018;55(7):6076-6093.
[33] JO MG, IKRAM M, JO MH, et al. Gintonin Mitigates MPTP-Induced Loss of Nigrostriatal Dopaminergic Neurons and Accumulation of α-Synuclein via the Nrf2/HO-1 Pathway. Mol Neurobiol. 2019;56(1):39-55.
[34] HUNG SY, LIOU HC, FU WM. The mechanism of heme oxygenase-1 action involved in the enhancement of neurotrophic factor expression. Neuropharmacology. 2010;58(2):321-329.

引言

氧化应激损伤在多种神经退行性疾病如阿尔茨海默病等的病理过程中发挥着重要作用[1-4]。中枢神经系统中葡萄糖和氧气的大量消耗需要持续的代谢活动来满足能量需求，新陈代谢的还原-氧化反应会产生大量天然副产物活性氧和活性氮[5]。星形胶质细胞是中枢神经系统的胶质细胞，围绕神经元并与神经元突触紧密相关，在抗氧化剂的产生、反应性物质的解毒和维持大脑中的氧化还原平衡等方面起重要作用[6-7]。
在正常情况下，星形胶质细胞为神经元提供必要的代谢和功能支持[6]。然而，在中枢神经系统损伤或疾病状态下，活性氧/活性氮的过量产生或排毒功能缺陷可导致反应性星形胶质细胞激活增生[8-9]。反应性星形胶质细胞对急性细胞应激有反应，并能限制中枢神经系统的损害，但持续的星形胶质细胞激活增生可导致活性氧/活性氮的持续产生和促炎分子的释放，从而产生神经毒性，促进神经元损伤，其作用参与包括阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症在内的多种神经系统疾病的发生和发展[10-12]。氧化应激损伤也可诱导星形胶质细胞自身凋亡，从而加重神经损伤[13]。因此，研究星形胶质细胞在神经炎症及氧化应激中的损伤和保护作用，可为发现针对星形胶质细胞的有效抗炎/抗氧化疗法提供依据。
核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是一种亮氨酸拉链转录激活因子，调节多种抗氧化途径[14]。在生理条件下，Nrf2锚定在细胞质中，在氧化应激过程中，Nrf2从细胞质转移到细胞核，导致其在细胞核中积累，从而调节遗传活性并诱导细胞保护作用[15-16]。Nrf2激活通过多种分子和途径来驱动多种功能，包括抗氧化应激、抗凋亡和抗炎作用[17]。
越来越多的证据表明，ROCK信号通路参与了炎症过程和氧化应激。法舒地尔是一种有效的Rho激酶抑制剂[18]，课题组前期的系列研究证明法舒地尔可以有效抑制帕金森病和阿尔茨海默病小鼠动物模型的炎性反应，促进神经再生，发挥神经保护作用[19-20]。法舒地尔还可以有效抑制脂多糖刺激的星形胶质细胞导致的炎性反应[21]。最近研究显示，体外用脂多糖刺激培养的星形胶质细胞可以发生氧化反应损伤[22]。然而，法舒地尔是否对星形胶质细胞的氧化损伤具有保护作用及其可能的机制尚不明确。该实验以体外培养的星形胶质细胞为研究对象，观察法舒地尔对脂多糖诱导的星形胶质细胞氧化损伤及Nrf2/血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)信号通路的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年12月在山西大同大学脑科学研究所/神经炎症及变性疾病基础与应用研究山西省重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8-10周龄C57BL/6小鼠，体质量16-18 g，健康清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006，饲养于山西大同大学脑科学研究所无菌动物中心，雌雄交配生产1 d或2 d的乳鼠用于实验。
1.3.2 实验药物及试剂法舒地尔购自天津红日药业公司(批号：090116)；脂多糖(批号：L43910)、牛血清白蛋白(批号：B2064)、左旋多聚赖氨酸(批号：P4832)均购自美国Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清(批号：16140063)、青霉素-链霉素混合液(批号：15140163)和高糖DMEM培养基(批号：21013024)均购自美国Gibco公司；小鼠抗GFAP一抗(批号：ab10062)、兔抗Nrf2一抗(批号：ab62352)、兔抗HO-1一抗(批号：ab13243)、兔抗cleaved-caspase-3一抗(批号：ab2302)、Alex Flour ®488标记的山羊抗兔IgG (批号：ab150077)、Alex Flour ®594标记的山羊抗兔IgG(批号：ab150080)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG二抗(批号：ab205718)均购自美国Abcam公司；RIPA 裂解液(批号：P0013B)、细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒(批号：P0027)、MTT检测试剂盒(批号：ST316)、超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(批号：S0103)和丙二醛检测试剂盒(批号：S0131M)均购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.4 实验方法

1.4.1 原代星形胶质细胞的培养出生1 d或2 d的C57BL/6小鼠断头，取出大脑皮质，巴斯德吸管吹打10-15次，胰蛋白酶消化10 min，尼龙网过滤离心；将沉淀细胞重悬于含有体积分数为10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM培养液中，然后接种于75 cm2预涂左旋多聚赖氨酸的细胞培养瓶，置于CO2培养箱进行培养，24 h后轻轻摇晃培养瓶，收集培养液并离心去除非贴壁细胞，之后每三四天换液1次，14 d左右细胞铺满瓶底，于恒温摇床在37 ℃条件下以180 r/min的速度振荡5 h，去除小胶质细胞和少突胶质细胞，然后传代、GFAP免疫荧光染色鉴定，细胞纯度达95%以上[20]，并用于后续实验。

1.4.2 实验分组将第2代星形胶质细胞分别接种于96孔板(细胞浓度为2×107 L-1，细胞量为2×103/孔)、24孔板(细胞浓度为5×107 L-1，细胞量为5×104/孔)和6孔板中(细胞浓度为5×109 L-1，细胞量为1×107/孔)，培养24 h细胞贴壁后分为3组：PBS对照组、脂多糖模型组(1 mg/L)、脂多糖(1 mg/L)+法舒地尔(15 mg/L)干预组，24 h后收集上清液并离心，-80 ℃冰箱冻存备用。
1.4.3 MTT实验检测细胞活性 96孔板细胞药物处理24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，在37 ℃条件下孵育4 h，离心后吸除MTT溶液，然后每孔加入150 μL二甲基亚砜，摇床振荡5 min使结晶充分溶解，用酶标仪测定490 nm波长处各孔的吸光度值，最后计算各组细胞的存活率。
1.4.4 细胞上清液中氧化应激标志物丙二醛和超氧化物歧化酶水平取出6孔板中冻存备用的细胞上清液，分别使用试剂盒检测丙二醛和超氧化物歧化酶水平，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。
1.4.5 免疫荧光染色检测星形胶质细胞中Nrf2、HO-1和cleaved-caspase-3的表达为检测法舒地尔干预星形胶质细胞是否可以使Nrf2表达增加并转移到核内，采用免疫荧光双标检测星形胶质细胞中Nrf2表达的变化。将24孔板中细胞上清液吸出，PBS洗5 min×3次，40 g/L多聚甲醛固定1 h；PBS洗5 min×3次，用含有0.3% Triton X-100和1% BSA的PBS室温下封闭1 h，分别加兔抗小鼠Nrf2抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠HO-1 抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠cleaved-caspase-3抗体(1∶1 000)，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS洗5 min×3次；加594标记的山羊抗小鼠IgG或488标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下孵育2 h，PBS洗5 min×3次；用含有DAPI的抗荧光淬灭封固液封固，荧光显微镜下观察Nrf2的核内转移，同时观察HO-1和cleaved-caspase-3的表达情况。
1.4.6 Western blot法检测总Nrf2、细胞核内Nrf2和HO-1蛋白水平 6孔板中细胞药物作用24 h后，吸出细胞上清液，PBS洗5 min×3次，然后用 RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)或者是细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。采用10% SDS-PAGE分离蛋白，并转移至0.2 μm硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1.0-2.0 h；加入兔抗Nrf2抗体(1∶500)和抗HO-1抗体(1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜，次日TBST洗涤，加入HRP的山羊抗兔 IgG(1∶5 000)，室温下孵育2 h；TBST洗涤，ECL发光试剂盒进行显影，随后用Bio-Rad 凝胶成像系统分析。
1.5 主要观察指标 ①MTT实验检测细胞增殖活性；②细胞上清液中氧化应激标志物丙二醛和超氧化物歧化酶水平；③免疫荧光染色检测Nrf2、HO-1和cleaved-caspase-3的表达；④Western blot法检测总Nrf2、细胞核内Nrf2和HO-1蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用统计学软件SPSS 15.0进行分析处理，结果均以x±s表示，组间实验数据比较采用单因素方差分析。

讨论

在神经系统退行性疾病的病理过程中，神经炎症和氧化应激与其密切相关，大量的活性氧及促炎症性细胞因子的释放，导致神经损伤[23-24]，其中星形胶质细胞常表现为过度活化、增生。反应性星形胶质细胞可刺激细胞外谷氨酸使之积累，这种兴奋性的氨基酸可刺激产生大量炎性因子加剧神经炎症，并且产生过量的活性氧和一氧化氮，从而促进神经元死亡和中枢神经系统损伤[25]。脂多糖被广泛应用于体内外激活星形胶质细胞。课题组前期研究表明脂多糖可以刺激星形胶质细胞活化，释放促炎性细胞因子[21]。最新有研究证明脂多糖可诱导星形胶质细胞释放活性氧等氧化应激活性物质，诱导氧化应激损伤[22，26]，与海马中的其他细胞类型相比，脂多糖诱导的炎症导致明显的星形胶质细胞凋亡[27]。该实验结果显示，1 mg/L脂多糖刺激星形胶质细胞可以使其细胞活性较PBS对照组减弱，而法舒地尔处理组较脂多糖组细胞活性增强，表明法舒地尔对脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤具有保护作用。Caspase家族在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3是细胞凋亡的近端介质[28]。实验结果表明，脂多糖损伤的星形胶质细胞中cleaved-caspase-3表达显著增加，而法舒地尔处理可明显抑制cleaved-caspase-3的表达，这一结果进一步说明了法舒地尔可以抵抗脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤。
活性氧/活性氮可以攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，并引发脂质过氧化作用，从而产生丙二醛、羰基、酮和羟基等脂质过氧化物。超氧化物歧化酶作为机体内抗氧化系统的一员，能够特异性地清除自由基，保护机体免受氧化应激损伤，因此丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性是反映氧化应激的2个重要指标[29]。实验结果表明，脂多糖可使星形胶质细胞超氧化物歧化酶活性明显降低，丙二醛水平显著升高。法舒地尔处理组星形胶质细胞超氧化物歧化酶活性显著升高，丙二醛水平降低，显示法舒地尔可通过增加超氧化物歧化酶活性来抵抗脂多糖所造成的细胞毒性损伤，表明其具有良好的抗氧化应激作用。
Nrf2是一个转录因子，负责调节哺乳动物细胞的氧化还原平衡和对抗氧化损伤，Nrf2由6个功能性Neh结构域(Neh1-Neh6)组成，其中氨基末端Neh2结构域结合kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)，Keap1负责将Nrf2隔离在胞质中，Nrf2通过从细胞质转移到细胞核被激活，与Maf蛋白形成二聚体，结合抗氧化反应原件，转录激活调控下游的HO-1、NADPH醌氧化还原酶(NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1，NQO1)等抗氧化基因的表达，HO-1是血红素向胆绿素过渡过程中的限速酶，具有逆转氧化损伤和应激的能力[30-31]。越来越多的证据表明，Nrf2/HO-1信号通路参与了神经退行性疾病的氧化应激过程[32]。研究表明，Nrf2/HO-1信号通路的激活可以上调神经营养因子的表达，防止α-突触核蛋白聚集加剧，发挥神经保护作用[33-34]。还有研究显示，脂多糖诱导后星形胶质细胞中Nrf2及其下游分子HO-1的表达降低[22]。该研究采用免疫荧光和Western blot检测了Nrf2的核转移情况。免疫荧光结果表明，PBS对照组Nrf2主要分布在细胞质中，而细胞核中的含量较少；脂多糖使细胞质和细胞核内Nrf2含量均减少，而法舒地尔干预能够激活Nrf2，并明显增强脂多糖损伤后Nrf2的核转位。Western blot蛋白定量结果表明，脂多糖诱导后星形胶质细胞中总Nrf2和核内Nrf2均较PBS对照组减少，法舒地尔处理能够明显增加脂多糖损伤后总Nrf2和核内Nrf2的表达，同时促进HO-1的表达，提示法舒地尔可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥抗氧化应激损伤作用。
综上所述，法舒地尔能够调节Nrf2/HO-1信号通路，减少丙二醛的产生，增加超氧化物歧化酶的活性，提高星形胶质细胞的抗氧化水平，降低脂多糖诱导的神经毒性。然而，要想确切了解法舒地尔在神经系统退行性疾病中抗氧化应激的作用及其机制，有必要使用相关疾病的动物模型充分验证法舒地尔在抗氧化应激以及相关神经保护信号通路中的确切作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

法舒地尔通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞损伤

Fasudil inhibits lipopolysaccharide-induced astrocytic injury by regulating Nrf2/HO-1 signaling pathway

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨毅峰, 叶楠, 王琳, 郭帅成, 黄健. 右美托咪定抗缺血再灌注损伤的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1464-1469.
[2]	程杰, 王继宏, 张沛. 第三趾趾深屈肌腱Ⅱ区损伤模型肌腱粘连的功能锻炼[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1161-1167.
[3]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[4]	娄国, 张艳, 付常喜. 内皮型一氧化氮合酶在运动预适应改善心肌缺血-再灌注损伤中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1283-1288.
[5]	刘可心, 宋丽娟, 吴艺舸, 韩光远, 苗珠月, 魏汝恒, 肖保国, 马存根, 黄建军. 羟基红花黄色素A干预脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞脂质运载蛋白2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1063-1069.
[6]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.
[7]	穆秉桃, 于婧文, 刘春云, 郭敏芳, 孟涛, 杨鹏伟, 魏文悦, 宋丽娟, 尉杰忠, 马存根. 黄芪甲苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞免疫调节的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1057-1062.
[8]	胡广志, 卢红艳. 支气管肺发育不良模型小鼠肺周细胞变化及对肺血管内皮细胞成管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 522-527.
[9]	陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.
[10]	刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.
[11]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[12]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 负载丹酚酸B甲基丙烯酰化明胶水凝胶对椎间盘退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 380-386.
[13]	杨启航, 蒲锐, 陈子扬, 冷思逸, 宋永晶, 刘辉, 杜光友. 肠道菌群代谢物在肥胖调控中的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 308-314.
[14]	孙园, 王庆博, 皮亦华, 陆春敏, 徐传仪, 张艳. 早期和晚期有氧运动对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠右心衰竭的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 177-185.
[15]	冉磊, 韩海慧, 徐博, 王建业, 沈军, 肖涟波, 施杞. 补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析：动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 208-215.