减体积肝移植模型大鼠肝脏组织miRNAs表达谱变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.018

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (5): 712-717.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.018

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减体积肝移植模型大鼠肝脏组织miRNAs表达谱变化

高红强，李志强，王海富，薛国友，刘静，陈刚，李立

昆明医科大学附属甘美医院、昆明市第一人民医院肝胆胰外科，云南省昆明市 650011

收稿日期:2015-11-09 出版日期:2016-01-29 发布日期:2016-01-29
通讯作者: 李立，主任医师，教授，博士生导师，昆明医科大学附属甘美医院、昆明市第一人民医院肝胆胰外科，云南省昆明市 650011
作者简介:高红强，男，1981年生，汉族，云南省曲靖市人，2012年昆明医科大学毕业，昆明医科大学在读博士，医师，主要从事肝胆胰外科及器官移植方面的研究。
基金资助:
云南省应用基础研究计划-昆明医科大学联合专项重点项目(2012FB010)

Changes in miRNAs expression profiling in the liver of a rat model after reduced-size liver transplantation

Gao Hong-qiang, Li Zhi-qiang, Wang Hai-fu, Xue Guo-you, Liu Jing, Chen Gang, Li Li

Department of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery, the First People’s Hospital of Kunming and the Ganmei Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650011, Yunnan Province, China

Received:2015-11-09 Online:2016-01-29 Published:2016-01-29
Contact: Li Li, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery, the First People’s Hospital of Kunming and the Ganmei Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650011, Yunnan Province, China
About author:Gao Hong-qiang, Studying for doctorate, Physician, Department of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery, the First People’s Hospital of Kunming and the Ganmei Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650011, Yunnan Province, China
Supported by:
the Joint Special Key Project of Application Basic Research Project of Yunnan Province-Kunming Medical University, No. 2012FB010

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

基因表达谱芯片的作用：基因表达谱芯片是采用cDNA或寡核苷酸片段作探针，固化在芯片上；将实验样品与对照样品的mRNA以两种不同的荧光分子进行标记，同时与芯片进行杂交，分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。

背景：活体肝移植后肝脏再生是影响肝移植预后的关键因素，目前尚未见调控活体肝移植术后肝脏再生的特异性微小RNA(miRNA)的报道。

目的：分析miRNAs在大鼠减体积肝移植后各时间点表达谱的变化，挑选并验证目的miRNAs，为大鼠减体积肝移植后肝脏再生干预策略提供靶标miRNAs，为临床活体肝移植后肝脏再生研究提供理论依据。

方法：分别建立大鼠减体积肝移植模型和假手术模型，利用miRNAs基因芯片技术检测miRNAs表达谱的差异。在差异表达的miRNAs中挑选出目的miRNAs进行实时定量PCR检测，验证芯片结果的可信性。

结果与结论：与假手术组大鼠肝组织相比，大鼠减体积肝移植肝脏组织中表达上调的miRNAs有11个，分别为let-7b-5p，let-7c-5p，miR-101a-3p，miR-103-3p，miR-130a-3p，miR-142-5p，miR-186-5p，miR-199a-3p，miR-21-5p，221-3p，miR-34a-5p；表达下调的miRNAs有4个miR-26b-5p，miR-150-5p，miR-19a-3p，rno-miR-146-5p。将挑选出的目的miRNAs进行PCR验证发现，miR-221-3p，miR-199a-3p在24 h，48 h，1周表达量与所对应的芯片结果近似，各自变化趋势与芯片结果一致，说明miRNA芯片结果可信。结果证实，大鼠减体积肝移植后伴有miRNAs表达谱的变化，实验挑选并验证了目的miRNAs。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0001-5205-0833(李立)

关键词: 实验动物, 移植动物模型, 大鼠减体积肝移植, 消化系统损伤模型, 肝脏, 微小RNA, miRNAs , microarray, PCR, 反转录, miRNAs表达谱, miRNAs芯片数据分析

Abstract:

BACKGROUND: Liver regeneration is the key factor influencing the prognosis of living donor liver transplantation. There has not been the research on special miRNA of liver regeneration after living donor liver transplantation.
OBJECTIVE: To analyze the variation of miRNAs expression profile after rat reduced-size liver transplantation at certain time point, select and verify target miRNA which can provide targeting intervention strategies in liver regeneration after rat reduced-size liver transplantation and provide theoretical evidence for liver regeneration after living donor liver transplantation.
METHODS: The reduced-size liver transplantation models were established. miRNAs microarray was used to detect miRNA expression. In differentially expressed microRNAs, real-time quantitative PCR was utilized to detect target miRNAs. The credibility of miRNAs microarray results was verified.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with rat liver tissue in the sham operation group, 11 miRNAs up-regulated in reduced-size liver transplantation, including let-7b-5p, let-7c-5p, miR-101a-3p, miR-103-3p, miR-130a-3p, miR-142-5p, miR-186-5p, miR-199a-3p, miR-21-5p, 221-3p and miR-34a-5p. Four miRNAs were down-regulated, including miR-26b-5p, miR-150-5p, miR-19a-3p and rno-miR-146-5p. PCR test further verified that miR-221-3p and miR-199a-3p expression changes approximated the chip results at 24, 48 hours and 1 week, indicating that results of miRNA microarray were believable. These results verified that it exists variation of miRNAs expression profile after rat reduced-size liver transplantation, which picked out and verified the target miRNAs.

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高红强，李志强，王海富，薛国友，刘静，陈刚，李立. 减体积肝移植模型大鼠肝脏组织miRNAs表达谱变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(5): 712-717.

Gao Hong-qiang, Li Zhi-qiang, Wang Hai-fu, Xue Guo-you, Liu Jing, Chen Gang, Li Li. Changes in miRNAs expression profiling in the liver of a rat model after reduced-size liver transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(5): 712-717.

图/表（结果） 1

2.1 造模成功动物数量及过程纳入大鼠116只，空白对照组手术成功率100%，实验组大鼠减体积肝移植手术成功率92%，术中死亡1只，术后24 h内死亡3只，均死于腹腔内出血。在手术成功的46只大鼠中，死亡8只，其中5只死于腹腔出血，2只死于小肝综合征，1只死于腹腔感染。采取标本时发现腹腔积液2只、肝脏肿大淤血1只，腹腔感染2只。对照组16只全部进入结果分析，实验组有33只进入结果分析，脱失17只，由于模型制作时已经考虑到死亡脱失的情况，并根据前期的手术成功率预测了脱失比例，最终计入结果分析的数量已经能满足实验要求，故无需追加补充。

2.2 模型创新性/材料、方法的改进实验在构建40%大鼠减体积肝移植模型中，选取体质量较小的大鼠作为供体，供体灌注后体内切除供体肝左叶、尾状叶、三角叶、盘状叶等相对较为游离的肝叶，避免了大块结扎肝组织导致流出道狭窄，保留肝中叶及肝右叶，所得供体为原肝脏质量的50%，再选取大于供体体质量40-50 g的大鼠作为受体，这样肝移植术后供体质量与受体原肝脏质量之比即约40%，体质量悬殊约50 g的大鼠之间血管及胆管管径无明显差异，不影响吻合效果。

2.3 模型更接近人类或临床实践/模型稳定性临床活体肝移植中理论上可以使用体积占受体原肝脏30%-40%的供体，但是越接近30%，受体发生小肝综合征的风险就越大^[7]，因此实践中都是尽可能取接近40%的供体，因此实验采用40%减体积肝移植作为模型研究，而且与30%大鼠减体积肝移植模型相比，手术成功率更高，稳定性更好。

2.4 总RNA质量检测结果通过紫外分光光度计检测结果表明，两组大鼠肝脏组织标本总RNA的A_{260 nm/280n m}值分别为1.87±0.04、1.90±0.06，差异无显著性意义(P > 0.05)，两组RNA的纯度均达到标准；凝胶电泳结果提示各样本的5 S，18 S和28 S条带均较清晰，且亮度之比约为1∶2(图1A)，将反转录后的DNA行凝胶电泳(图1B)，可见DNA大小约100 bp，条带清楚，结果表明两组大鼠肝脏组织标本的总RNA均有较好的质量，完全可以满足后续的microRNA芯片检测和实时定量PCR 的实验要求。

2.5 microRNA芯片检测结果分析将miRNAs芯片检测结果输入QIAGEN公司为产品提供的在线分析表(www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php)，所得结果见图2，3。与假手术组大鼠肝组织相比，大鼠减体积肝移植肝脏组织中表达上调超过2倍的miRNAs有11个，分别为rno-let-7b-5p，rno-let-7c-5p，rno-miR-101a-3p，rno-miR-103-3p，rno-miR-130a-3p，rno-miR-142-5p，rno-miR-186-5p，rno-miR-199a-3p，rno-miR-21-5p，rno-miR-221-3p，rno-miR-34a-5p；表达下调超过2倍的miRNA有4个rno-miR-26b-5p，rno-miR-146-5p，rno-miR- 150-5p，rno-miR-19a-3p。说明大鼠减体积肝移植后伴有miRNA表达谱的变化，可以从这些有明显变化的miRNAs中挑选出有需要的miRNAs进行PCR验证及后续实验。

2.6 目的miRNAs的PCR验证结果将变化最明显的rno-miR- 221-3p及靶向本课题组前期实验相关基因的rno-miR- 199a-3p进行PCR验证，并把检测时间点扩展到5个。验证结果显示，rno-miR-221-3p，rno- miR-199a-3p只在6 h的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，其他各时间点均明显上调(P < 0.05)，见表5。两者在移植后24 h，48 h，1周3个时间点表达量与所对应的芯片结果近似，rno- miR-221-3p的峰值时间在移植后24 h，rno-miR-199a-3p峰值时间在移植后48 h，各自变化趋势与芯片结果一致，说明miRNA芯片结果具有可信性。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料健康8-16周龄SD大鼠116只，雄性60只，雌性56只，体质量220-300 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK(湘) 2013-0004，饲养于昆明医科大学动物实验中心SPF级实验室，术前禁食12 h，不禁水。

microRNA芯片(miRNA array)制备：miScript™ miRNA PCR Arrays专为检测不同组织或细胞中特定基因的表达量而设计，这些基因按照定制要求成套设置，可实现精确定量检测多个编码基因的表达水平，其检测结果所显示的表达差异为疾病、信号通路的相关编码基因提供了进一步的研究线索。对于目录产品，每块96孔板包含84对PCR引物，在同一块96孔板上，设置有12个反应孔包被了不同类型的对照，用以检测从反转录到qPCR整个过程的反应效率。每孔所对应的microRNA如表1所示。

1.2 造模方法实验过程及对动物的处理符合动物伦理学要求。实验分2组，实验组大鼠减体积肝移植50对，供体手术中切除肝左叶、尾状叶、三角叶和盘状叶，保留肝中叶及肝右叶，所得供体质量约占切肝前质量的50%，再根据实际所称供体的质量，选取大于供体体质量40-50 g的大鼠作为受体，这样肝移植术后供体质量与受体原肝脏质量之比即约为40%。取出供体后将门静脉和肝下下腔静脉分别套入不同型号的套管，胆道用细小支撑管植入供体的胆管中；最后进行受体的肝移植手术，受体先切除受体的原来肝脏组织，然后将准备好的供体肝脏植入受体中，按照文献[7-10]的方法，以Kamada等^[11-12]的双袖套法为基础进行受体手术，分别吻合供受体的门静脉、肝上下腔静脉、肝下下腔静脉及胆管，开放血供，止血，关腹，不进行肝动脉血管重建。空白对照组即假手术组16只，只行开关腹手术。

1.3 造模成功的检测标准手术后存活超过1 d视为手术成功，可在相应时间点取标本，取标本时如发现腹腔积液、腹腔感染、肝脏肿大淤血则放弃标本，视为造模失败。每个时间点取6只大鼠标本做检测。

1.4 基因芯片检测

总RNA的提取及质量检测：按照TRIzol试剂说明书的步骤，逐步提取出各组肝脏组织中的总RNA。应用紫外分光光度计测定总RNA 的吸光度A_{260 nm}值和A₂₈₀ _nm值，用A_{260 nm}值计算其浓度，并计算A_260nm/A₂₈₀ _nm检测其纯度；琼脂糖凝胶电泳法进一步检测总RNA质量。

反转录合成cDNA：取出反转录试剂盒各成分、室温融化后，短暂离心、置于冰上。在冰上按照下列顺序依次加入加入反应成分如表2，轻轻混匀、短暂离心，将PCR管置于PCR仪上，37 ℃反应60 min，95 ℃ 5 min终止反应。该cDNA可以进行后续的PCR，real-time PCR等检测，或者-70 ℃长期保存。

microRNA芯片检测：将定量PCR 96孔板置于冰上，加入反应成分如表3。

用封板膜密封PCR板，轻轻震荡。1 000 r/min离心 1 min。将PCR板放入C仪器中进行PCR反应检测。反应条件为：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，总共40个循环。实验重复3次。

microRNA芯片数据分析PCR：反应刚进入对数期时，原始模板浓度及反应体系等差异尚未放大，扩增的目的基因的量可以近似地看作只与原始模板浓度和扩増循环数有关。模板浓度的相对测量可以用Ct来表示，Ct是扩增曲线和阈值线的交点。阈值线是与扩增图相交于确定Ct值的线，一般由软件自动生成。用2^-^??Ct法对各组所测得Ct值进行分析，比较各组间的相对miRNA表达差异。具体计算如下：??Ct=(Ct实验样品-Ct内参对照)-(Ct对照样品-Ct内参对照)；相对表达水平=2^-^??Ct)。用QIAGEN公司为产品提供的在线分析工作表分析测试样本数据。

目的miRNA的PCR验证：参照表3反应成分，分别加入表4引物，反应条件为：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，总共40个循环，行rno- miR-221-3p和rno-miR-199a-3p的PCR验证。实验重复3次。

1.5 主要观察指标观察大鼠术后存活情况及并发症情况，总RNA的质量检测，microRNA芯片检测结果，目的miRNAs的PCR验证结果。

1.6 统计学分析应用Graphpad Prism 5统计软件进行分析，计量资料采用x(_)±s表示，组间均数比较采用方差分析，两组均数间的比较用t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

成人间活体肝移植的开展，扩大了器官的供应量和部分缓解了供肝的短缺，与全肝移植相比活体肝移植(供肝质量与受者体质量比< 0.8%-1.0%或供肝容量占标准肝容量< 30%-40%)使受者的生存率由90%下降至30%-80%，并且严重影响移植肝的功能；另外，超过50%的肝脏切取将对供者产生显著的创伤，甚至危及供者的生命^[13]。建立稳定的小体积肝移植模型是活体肝移研究的基础。大鼠70%肝切除是研究肝脏再生的经典模型，切除70%肝脏后肝细胞增殖的程度和切除肝组织的数量呈线性关系^[14]，过多或过少都会减慢肝再生进程，然而30%大鼠小体积肝移植受体所得到的供肝已接近极限量，加上冷保存，缺血再灌注损伤，功能完好肝细胞数量就更少，因此，手术难度极大，成功率较低，容易发生小肝综合征，实验为了提高手术成功率，延长大鼠存活时间，降低小肝综合症发生率，从而减少对实验结果的干扰，特意使用40%减体积肝移植模型^[15]，既提高了模型成功率，又最大限度地利用肝脏再生潜能。

最近几年miRNAs在肝脏再生方面的研究多以大鼠肝部分切除术为动物模型，成果颇丰，找到了很多对肝脏再生有调控功能的miRNAs，也探索出了一些调控机制^[16-18]，然而大鼠减体积肝移植不仅经历了肝切除肝脏体积的丧失，还有冷灌注、冷保存、缺血再灌注损伤，术后肝脏再生有其独特性，比单纯的肝切除及缺血再灌注损伤更复杂，能否找到靶向性较强的miRNA是该研究方向的突破口。因此，实验在大鼠40%减体积肝移模型的基础上，利用miRNA基因芯片技术检测miRNAs表达谱的差异。发现11个microRNA表达上调，除了rno-let-7b-5p在术后1周出现明显回落，趋于正常值外，其他10个miRNAs在24 h，48 h，1周3个时间点的表达量均超过对照组2倍以上。在表达下调的microRNAs中，rno-miR-150-5p在上述3个时间点的表达量与对照组相比下调均超过2倍，rno-miR-26b-5p和rno-miR-19a-3p只有24 h一个时间点下调超过2倍。在这些差异表达的miRNAs中，有研究比较深入，跟肝脏再生相关的let-7家族、miR-21、miR-34a、miR-150和miR-221等^[19-23]，它们都可以作为大鼠减体积肝移植术后肝脏再生的调控靶点。此外，还有与缺血再灌注损伤密切相关的miR-146a^[24-26]，它可能参与大鼠肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤的调控。另外，miR-199a-3p与miR-26b在最新的研究中发现与肝癌细胞的增殖及迁移有关系^[27-30]，其中miR-26b在卵巢癌的研究中也有类似的报道^[31]，它们在正常肝细胞中有无调控增殖的作用?还有在肝脏组织研究较少的rno-miR-103-3p，rno-miR-142-5p，rno-miR-186-5p，rno-miR-19a-3p在肝脏中发挥什么功能？在所有差异表达的miRNAs中，是否有和肝脏冷保存损伤相关的miRNA？从大鼠减体积肝移植后miRNAs表达谱变化中发现的这些问题为今后的研究提供了新的思路。

在差异表达的miRNAs中，实验挑选变化较明显且研究较为透彻的rno-miR-221-3p及靶向本课题组前期实验相关基因的rno-miR-199a-3p进行PCR验证，证实了miRNAs芯片结果的可信性，为下一步研究奠定了理论基础。实验中所使用的miRNAs芯片含有84对PCR引物，可筛选的miRNAs较少，还有更多的miRNAs参与了大鼠减体积肝移植术后肝脏再生、缺血再灌注调控，将来的研究可以设计包含更多miRNAs引物的高通量芯片，筛选出更多有意义的miRNAs。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

减体积肝移植模型大鼠肝脏组织miRNAs表达谱变化

Changes in miRNAs expression profiling in the liver of a rat model after reduced-size liver transplantation

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