体积分数95%乙醇建立薄型子宫模型大鼠子宫内膜中波蛋白和血管内皮生长因子的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.019

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (5): 718-722.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.019

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体积分数95%乙醇建立薄型子宫模型大鼠子宫内膜中波蛋白和血管内皮生长因子的变化

许艳萍¹，赵桂峰²，苗佳宁²，谭季春¹

¹中国医科大学附属盛京医院妇产科辅助生殖中心，辽宁省沈阳市 110001；²中国医科大学附属盛京医院实验研究中心，辽宁省本溪市 117000

收稿日期:2015-12-16 出版日期:2016-01-29 发布日期:2016-01-29
通讯作者: 谭季春，博士，主任医师，教授，博士生导师，中国医科大学附属盛京医院妇产科辅助生殖中心，辽宁省沈阳市 110001
基金资助:
辽宁省科学技术计划项目(2012225014)

Changes in vimentin and vascular endothelial growth factor expression in a rat model of thin endometrium established by 95% ethanol

Xu Yan-ping¹, Zhao Gui-feng², Miao Jia-ning², Tan Ji-chun¹

¹Center for Assisted Reproduction, Department of Obstetrics and Gynecology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China; ²Experimental Research Center, Shengjing Hospital of China Medical University, Benxi 117000, Liaoning Province, China

Received:2015-12-16 Online:2016-01-29 Published:2016-01-29
Contact: Tan Ji-chun, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Center for Assisted Reproduction, Department of Obstetrics and Gynecology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
About author:Xu Yan-ping, Studying for master’s degree, Center for Assisted Reproduction, Department of Obstetrics and Gynecology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Supported by:
the Liaoning Province Science and Technology Program, No. 2012225014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

薄型子宫：是指子宫内膜厚度低于能够获得妊娠的阈厚度，即小于7 mm，可严重影响子宫的容受性。

子宫内膜：是指构成哺乳类子宫内壁的一层，分为致密层、海绵层和基底层3层。内膜表面2/3为致密层和海绵层统称功能层，受卵巢性激素影响发生周期变化而脱落。基底层为靠近子宫肌层的1/3内膜，不受卵巢性激素影响，不发生周期性的变化。子宫内膜对动情素和孕激素都起反应，因此可随着性周期(发情周期、月经周期)发生显著的变化。动情素可引起子宫肥大，孕激素可促使子宫内膜发生特殊的妊娠初期变化，或改变子宫内膜的性质，使之具有产生蜕膜的能力。子宫内膜覆盖着黏膜，由黏膜上皮与其下方的固有层所组成。黏膜上皮为柱状上皮、立方上皮或复层柱状上皮，动情素分泌时，各上皮细胞将长大、分裂使数目增多。固有层中黏膜上皮下方的部分称为机能层，上皮细胞进入其中形成子宫腺，并对动情素起反应。机能层的下层称为基底层，富有血管。

背景：乙醇化学损伤法能够有效对大鼠子宫进行薄型子宫内膜建模，薄型子宫内膜增殖相关蛋白表达减少，有助于研究薄型子宫内膜相关发生机制，为临床治疗提供指导。

目的：探索高浓度乙醇致薄型子宫后子宫内膜中波蛋白和血管内皮生长因子的表达变化。

方法：SD雌鼠右侧子宫缓慢注入0.3 mL体积分数95%乙醇建立薄型子宫模型，左侧子宫注入等量生理盐水作为对照侧。

结果与结论：与对照侧相比，大鼠损伤侧子宫内膜明显变薄，腺体数量减少，结构紊乱，波蛋白和血管内皮生长因子表达明显降低。说明体积分数95%乙醇损伤可有效建立大鼠薄型子宫内膜动物模型，且与增殖相关的蛋白在薄型子宫内膜中表达出现变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0003-3055-519X(许艳萍)

关键词: 实验动物, 基因病毒载体及相关因子模型, 薄型子宫内膜, 动物建模, 乙醇, 波蛋白, 血管内皮生长因子, 免疫组化, western blot

Abstract:

BACKGROUND: Ethanol chemical damage method can be used to establish thin endometrium rat model. Expression of proliferation-related proteins is decreased in thin endometrium animal model, which contributes to the study of thin endometrium-related mechanism and provides guidance for clinical treatment.
OBJECTIVE: To explore the changes in vimentin and vascular endothelial growth factor expression in rat models of high concentrations of ethanol-induced thin endometrium.
METHODS: 0.3 mL 95% ethanol was slowly injected in the right uterus of female Sprague-Dawley rats to establish rat models of thin endometrium. An equal volume of physiological saline was injected into the left uterus as control sides. RESULTS AND CONCLUSION: The thickness of endometrium in the injured uterus was significantly thinner than the control ones. Number of glands reduced, structure became disorder, and vimentin and vascular endothelial growth factor expression markedly diminished. These results suggest that 95% ethanol injury can effectively establish rat models of thin endometrium. Proliferation-related protein expression altered in the thin endometrium.

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许艳萍，赵桂峰，苗佳宁，谭季春. 体积分数95%乙醇建立薄型子宫模型大鼠子宫内膜中波蛋白和血管内皮生长因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(5): 718-722.

Xu Yan-ping, Zhao Gui-feng, Miao Jia-ning, Tan Ji-chun. Changes in vimentin and vascular endothelial growth factor expression in a rat model of thin endometrium established by 95% ethanol[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(5): 718-722.

图/表（结果） 2

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引言

薄型子宫内膜是指子宫内膜厚度低于能够获得妊娠的阈厚度，即小于7 mm^[1]。薄型子宫内膜可严重影响子宫的容受性，导致胚胎种植率明显降低^[2]，且患者还表现出月经过少、不孕等症状^[3]。然而，导致薄型子宫内膜的原因尚不能完全确定。目前公认的危险因素有高龄、感染史、避孕药史、基础疾病、生殖器结核以及宫腔手术史等^[4-9]，刮宫也是导致子宫内膜过薄的原因之一^[10-12]。目前常用雌激素、阿司匹林、粒细胞集落刺激因子等药物治疗薄型子宫内膜^[13-16]，但效果并不肯定^[17-23]，因此需要更好的动物模型来进行相关的研究。

建立薄型子宫内膜可采取物理法、化学法、热损伤法以及机械损伤法^[24-26]。Guney等^[11^，^25]通过氟化物的氧化应激反应建立子宫内膜损伤模型，还通过900 MHz物理损伤建立子宫内膜损伤模型。但大多数研究常使用100 ℃的水热损伤子宫内膜建立模型。作者所在团队尝试过热损伤法，其损伤程度不易控制，且易出现子宫感染、腐烂以及模型动物死亡等问题。由于乙醇黏稠度低，流动性好，可均匀分布于子宫内壁，且几乎不发生宫腔粘连，为后续宫腔注射细胞或药物治疗提供方便，可用于化学损伤法建立大鼠薄型子宫内膜模型^[27]。

波蛋白是构成间质细胞骨架的主要成分，对于维持细胞的完整性具有重要作用。相比于正常大鼠，缺乏波蛋白的受伤大鼠恢复的更为缓慢^[28]。血管内皮生长因子的表达水平可反映血管的增殖情况^[29-30]。因此，作者拟以体积分数95%乙醇通过化学损伤法建立薄型子宫内膜大鼠模型，并观察子宫内膜中波蛋白和血管内皮生长因子的表达变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 设计自身对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至5月在中国医科大学盛京医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：8周左右未交配雌性SPF级SD大鼠12只，体质量200-250 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXY(辽) 2010-0001。通过阴道涂片确定大鼠动情周期一致。实验得到中国医科大学附属盛京医院动物伦理部门批准。

1.4 方法

1.4.1 造模方法雌鼠造模前禁食1d体积分数5%水合氯醛麻醉后(6 mL/kg)，仰卧位固定，正中逐层切开腹部，用生理盐水冲洗腹腔，提拉腹腔右侧脂肪组织，暴露右侧子宫与输卵管连接处，动物微量注射器(北京博朗宁科技有限公司)顺阴道方向于输卵管子宫连接处于宫腔内缓慢注入0.3 mL体积分数95%乙醇，左侧子宫注入等量生理盐水。 5 min后如子宫无持续出血且阴道无液体外溢，逐层关腹缝合。造模后青霉素连续腹腔注射3 d。

1.4.2 造模成功检测标准子宫内膜变薄，腺体减少，排列紊乱，视为造模成功。

1.4.3 形态学变化 3个动情周期后^[31]，大鼠过量麻醉处死，取双侧子宫，去除外侧浆膜以及肌肉层，以40 g/L多聚甲醛固定，包埋后切片(厚度4 μm)，苏木精-伊红染色，光镜观察内膜厚度、腺体结构及数量。内膜厚度为肌层到宫腔距离的平均值。

1.4.4 免疫组化染色波蛋白表达于间质细胞的胞浆部位，反应间质细胞生长状态；血管内皮生长因子主要反应血管增殖生长状况。取大鼠双侧子宫，去除外侧浆膜以及肌肉层，40 g/L多聚甲醛固定，包埋后切片(厚度4 μm)，微波加热法修复内源性抗原，过氧化氢封闭内源性过氧化物酶37 ℃孵育30 min，PBS洗3次。山羊血清封闭后依次滴加稀释后的一抗(波蛋白1∶200，血管内皮生长因子 1∶100；美国Abcam公司)4 ℃过夜。第2天组织切片室温下放置 30 min复温，PBS洗3次，二抗(迈新试剂公司)孵育30 min，PBS洗3次，滴加辣根过氧化物酶，DAB(迈新试剂公司)显色，苏木精(迈新试剂公司)染核1 min，封固后光镜(日本Olympus公司)下观察，随机取2个400倍视野，统计100个细胞中阳性细胞数量，结果取平均值。

1.4.5 Western blot分析取大鼠双侧子宫，去除外侧浆膜以及肌肉层，-80 ℃冻存，于冰上裂解组织，4 ℃离心，取上清液进行蛋白浓度测定。确定蛋白浓度后，蛋白样品中滴加上样缓冲液，100 ℃沸水加热5 min使蛋白充分变性，配置10%分离胶，上样后电泳。转膜结束后脱脂奶粉封闭。滴加TBST稀释一抗(波蛋白1∶2 000，β-actin 1∶2 000；上海碧云天生物科技有限公司)，4 ℃摇床过夜。滴加稀释后二抗(1∶3 000；上海碧云天生物科技有限公司)，ECL(上海碧云天生物科技有限公司)发光法检测蛋白，化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)检测波蛋白与内参的灰度值比值。

1.5 主要观察指标两侧子宫内膜形态及波蛋白和血管内皮生长因子表达水平。

1.6 统计学分析使用SPSS 17.0软件进行数据的统计分析。结果用x(_)±s表示，采用t 检验比较组间差异，检验水准α= 0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

使用氟化物损伤子宫内膜建立模型过程中，氟化物科引起体外培养的子宫内膜细胞出现多种病理性损伤，影响其体外增殖能力。但氟化物对卵巢生殖道均有影响，可促进卵巢细胞凋亡。子宫内膜变薄的原因亦可能来自损伤的卵巢。此外，光动力法及电磁波法操作难度较大，受温度，作用时间等因素的影响，医源性不可逆损伤的发生率较高。热损伤法感染率，死亡率均较高，而所造模多为瘢痕粘连，宫腔狭窄形态^[32-36]。乙醇在临床上广泛应用于内膜异位囊肿的治疗，治疗效果得到一定的肯定。乙醇注射建立薄型子宫内膜的机制主要通过细胞脱水坏死，达到子宫内膜变薄的目的。乙醇的流动性使其用量可控性更强，作用更加均匀，其在宫腔内起到一定的充盈作用，减少了术后粘连梗阻的发生率。

此次实验采用SD大鼠而非小鼠，主要考虑到小鼠子宫较小，增加操作难度，乙醇用量不好控制，且损伤效果不够明显。而使用显微注射器代替普通注射器，可减少针尖对宫壁的刺激。子宫外壁血管较多，显微注射器的应用也减少出血风险。子宫所处位置较深，为红色细长组织，周围经常有较多脂肪组织，于是通过易于辨认的脂肪组织寻找子宫可准确快速定位子宫组织，避免了盲目探腹带来的损伤。选择的注射位置为输卵管与子宫连接处偏子宫侧，朝向阴道方向缓慢注射至宫腔，一方面可避免乙醇对卵巢的损伤。众所周知，卵巢损伤后分泌雌激素减少，亦可使子宫内膜变薄；另一方面，缓慢注射有利于乙醇的吸收，减少梗阻发生的风险。5 min后观察到针尖处和阴道均无液体外溢，腹腔无持续或不明原因出血后方可逐层关腹。

波蛋白具有重要的生物学功能，主要与维持细胞器形态，参与有丝分裂及细胞分化有关，对伤口愈合，细胞凋亡等亦有一定关系。血管内皮生长因子表达直接反应血管生成。子宫内膜受损后，形态学上内膜层肌层均变薄，间质中腺体数量减少，结构紊乱。相应的，反应间质生长状态的波蛋白表达下降。波蛋白表达下降，反过来作用于受损子宫内膜，影响其细胞凋亡，组织修复。同样，体积分数95%乙醇使细胞脱水，死亡。内膜小血管亦发生坏死，反应血管生成的血管内皮生长因子表达下降。血管生成对于细胞的生长是必不可少的，损伤的子宫内膜受血管生成的影响，修复更为缓慢。说明这2种蛋白表达与薄型子宫内膜的发生关系密切。

本实验也存在一些不足之处：样本量较少，且大鼠子宫与人的子宫形态结构差别很大，大鼠繁殖能力强，损伤后修复快，生理性修复周期亦较短。体积分数95%乙醇可使大鼠子宫内膜变薄，但对于损伤是否伤及基底层，是否影响大鼠受孕情况以及损伤后能否进行有效修复等问题都有待于进一步研究。

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