2.1  各组细胞miR-148a mRNA表达的比较  qRT-PCR检测结果显示，对照组细胞内miR-148a mRNA表达高于空白对照组(P < 0.01)；低表达组细胞内miR-148a mRNA表达低于空白对照组和对照组(P < 0.01)；低表达阴性对照组细胞内miR-148a mRNA表达高于空白对照组和低表达组(P < 0.01)；高表达组细胞内miR-148a mRNA表达高于空白对照组、对照组及低表达组(P < 0.01)；高表达阴性对照组细胞内miR-148a mRNA表达高于空白对照组、低表达组(P < 0.01)，低于高表达组(P < 0.01)，见图1。

2.2  各组细胞增殖活力的比较  CCK-8检测结果显示，低表达组细胞增殖活力低于空白对照组和对照组(P < 0.01)；低表达阴性对照组细胞增殖活力高于低表达组(P < 0.01)；高表达组细胞增殖活力高于空白对照组、对照组及低表达组(P < 0.01)；高表达阴性对照组细胞增殖活力高于低表达组(P < 0.01)，低于高表达组(P < 0.01)，见图2。

2.3  各组细胞MHC和cTnT蛋白的表达  免疫荧光染色结果显示，MHC阳性表达呈绿色荧光、cTnT阳性表达呈红色荧光，空白对照组细胞质中未见红色和绿色荧光，对照组、低表达组和高表达组细胞质中可见红色和绿色荧光，见图3A-D和图3F-I。对照组MHC和cTnT阳性细胞比例高于空白对照组(P < 0.01)；低表达组MHC和cTnT阳性细胞比例高于空白对照组，低于对照组(P < 0.01)；高表达组MHC和cTnT阳性细胞比例高于空白对照组、对照组和低表达组(P < 0.01)，图3E和图3J。

2.4  各组细胞MHC和cTnT蛋白表达的比较  Western blot检测结果显示，对照组细胞MHC和cTnT蛋白表达高于空白对照组(P < 0.01)；低表达组细胞MHC和cTnT蛋白表达低于对照组(P < 0.01)；高表达组细胞MHC和cTnT蛋白表达高于空白对照组、对照组和低表达组(P < 0.01)，见图4A-C。

心肌血液供应障碍可导致心肌细胞不同程度的死亡，而心肌细胞的自我更新能力有限，且成体心脏中内源性心脏干细胞数量有限，导致较大面积的心肌细胞发生死亡是一个不可逆的病理生理过程^[1]。心肌缺血坏死发生的同时，机体的自我保护机制也会启动，炎症细胞募集于损伤区域释放炎症因子，激活细胞因子，促进血管新生，从而改善心脏的血氧供应，但不足以改善心脏的舒缩功能和组织再生能力^[2]。心肌坏死区域发生纤维化，周围正常心肌细胞代偿性肥大引起心脏重塑，最终进展为心力衰竭，故机体自身修复无法有效改善心肌功能^[3]。此外，目前临床常用的医疗方法也无法实现心肌功能的恢复^[4]。因此，促进梗死区域内心肌细胞再生，增加心肌细胞数量以阻止心脏重塑的发生，是防止心肌梗死后心力衰竭和降低远期死亡率的关键。

应用干细胞定向分化为心肌样细胞进行细胞治疗，实现心肌再生为急性心肌梗死患者带来希望^[5]。干细胞属于未分化的幼稚细胞，具有自我复制和多向分化能力^[6]。心肌细胞的移植疗法，是直接将体外分离得到的干细胞或其他细胞移植到梗死区域，以替代纤维化组织，从而改善心肌功能^[7]。目前，用于心肌再生医学治疗研究的干细胞包括胚胎干细胞、间充质干细胞、胚性心肌细胞、内皮祖细胞和心肌祖细胞等^[8]，大量临床试验中应用干细胞移植治疗缺血性心肌病的疗效存在争议^[9]。有研究表明，经过体外诱导分化为心肌样细胞后再移植对心脏的修复效果明显优于未进行分化诱导预处理而直接移植的干细胞^[10]。还有研究发现，在干细胞移植后的1周内即有90%的细胞死亡，且移植的细胞不具有节律性而导致心律不齐^[11]。因此，移植具有成熟心肌细胞功能的细胞对改善心脏功能具有重要意义。近年来，先后有研究证实骨髓间充质干细胞^[12]、脐血间充质干细胞^[13]、脂肪间充质干细胞^[14]、胎盘间充质干细胞^[15]、诱导性多能干细胞在体内、外分化为表达成熟心肌细胞特异性标志物的心肌样细胞^[16]，但诱导效率一直不尽如人意。

诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化的过程与胚胎时期心脏的发育过程相似^[17]。诱导性多能干细胞的优势为自体心肌细胞的治疗提供了新途径^[18]。动物实验研究表明，将人诱导性多能干细胞体外诱导为心肌样细胞移植到心肌梗死区域，能显著缩小梗死面积并改善心脏功能，同时移植细胞能与原有心肌细胞发生同步收缩和电活动^[19]。目前，研究人员通过外源添加小分子化合物或生长因子、应用仿生支架培养或与心肌细胞共培养的方法将诱导多能干细胞诱导分化为心肌样细胞，但尚无实现心肌样细胞定向分化的规范诱导方法，干细胞在分化过程中存在诸多不确定因素，实验可重复性差，获得的细胞成熟度低^[20]。因此，探讨将人诱导性多能干细胞诱导分化为功能性心肌样细胞的高效方法至关重要。干细胞向心肌样细胞分化过程中有多种基因的参与，微小RNA(micro RNA，miRNA)对基因表达起重要的调控作用，通过促进细胞的增殖和干细胞的定向分化发挥作用^[21]。蒋昌科等^[22]研究发现，miR-148a在人间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中表达上调。该研究通过上调或抑制miR-148a的表达，观察miR-148a对人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化的调控作用，并探讨其可能机制，为心肌损伤的细胞治疗提供实验依据。

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1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  自2018年5月至2019年3月在广西医科大学实验中心完成。

1.3  材料

1.3.1  细胞株  人诱导多能干细胞购买于北京赛贝生物技术有限公司，批号：CA4002106。

1.3.2  实验试剂和仪器  PSCeasy^®人多潜能干细胞解冻液、PSCeasy^®人多潜能干细胞复苏培养基、PSCeasy^®人多潜能干细胞消化液、PSCeasy^®人多潜能干细胞铺底工作液、PSCeasy^®人多潜能干细胞培养基、CardioEasy^®人心肌细胞分化试剂盒、CaridoEasy^®人心肌细胞纯化培养基、CaridoEasy^®人心肌细胞消化液、CardioEasy^®心肌复苏培养基、CardioEasy^®人心肌细胞维持培养基(北京赛贝生物技术有限公司)；miR-148a模拟物(miR-148a mimic)、miR-148a抑制物(miR-148a inhibitor)(GeneCopoeia公司)；全细胞蛋白提取试剂盒(Amresco公司)；Lipofectamine 2000转染试剂、CCK-8试剂盒(Thermo Fisher公司)；Trizol(Invitrogen公司)；DAPI(Sigma公司)；兔抗人肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)、心脏肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)单克隆抗体(Abcam公司)；兔抗人β-actin多克隆抗体、羊抗人IgG3-FITC、辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG、增强型ECL发光试剂盒(PeproTech公司)；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、牛血清白蛋白(北京索莱宝生物公司)；PCR扩增试剂盒、AM 1005一步法荧光定量RT-PCR试剂盒、7500型荧光定量PCR仪和PCR扩增仪(ABI公司)；CO₂培养箱和酶标仪(Thermo公司)；荧光光学显微镜和荧光倒置相差显微镜(Leica公司)；恒温水浴箱(苏州力意达仪器科技有限公司)；凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  人诱导性多能干细胞的培养  参照HELLEN等^[23]方法，将存放于液氮中装有人诱导性多能干细胞的冻存管取出，加入人多潜能干细胞解冻液迅速放入37 ℃恒温水浴箱中解冻，吸取细胞悬液移入离心管内，1 000 r/min离心  5 min，小心吸去上清液，用人多潜能干细胞复苏培养基重悬细胞，用人多潜能干细胞铺底工作液均匀涂抹于培养皿底部晾干，将人诱导性多能干细胞悬液接种于上述培养皿内，37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养24 h，显微镜下观察有部分细胞贴壁后换液，去除悬浮细胞，改用人多潜能干细胞培养基继续培养，每隔2 d换液1次，镜下观察到圆形的细胞克隆团聚集生长时进行传代，每代培养5 d左右，进行传代时在培养皿中加入人多潜能干细胞消化液，静置5 min，待贴壁细胞变圆后用人多潜能干细胞培养基终止消化，用吸管吹打获得细胞悬液，    1 000 r/min离心5 min，用人多潜能干细胞培养基重悬细胞，按1∶8比例传代。

1.4.2  人诱导性多能干细胞向心肌样细胞的诱导分化  参照TU等^[24]的方法，取第3代人诱导性多能干细胞，用含人心肌细胞分化添加剂的人心肌细胞分化基础培养基在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中常规培养，每隔3 d换液1次，培养21 d后用人心肌细胞纯化培养基将获得的心肌样细胞纯化，24 h后改用人心肌细胞维持培养基继续培养 7 d，所有细胞均培养28 d。

1.4.3  实验分组与细胞处理  将已鉴定的第3代人诱导性多能干细胞在诱导分化前1 d分为6组，处理如下：①空白对照组：不予处理的人诱导性多能干细胞；②对照组：人诱导性多能干细胞向心肌样细胞诱导分化，同1.4.2所述；③低表达组：在人诱导性多能干细胞向心肌样细胞诱导分化第1，7，14，21天在诱导分化培养基中加入10 nmol/L miR-148a抑制物处理24 h，后续诱导分化同1.4.2所述；④低表达阴性对照组：在人诱导性多能干细胞向心肌样细胞诱导分化第1，7，14，21天在诱导分化培养基中加入10 nmol/L miR-148a抑制物阴性对照处理24 h，后续诱导分化同1.4.2所述；⑤高表达组：在人诱导性多能干细胞向心肌样细胞诱导分化第1，7，14，21天在诱导分化培养基中加入10 nmol/L miR-148a模拟物处理24 h，后续诱导分化处理同1.4.2所述；⑥高表达阴性对照组：在人诱导性多能干细胞向心肌样细胞诱导分化第1，7，14，21天在诱导分化培养基中入10 nmol/L miR-148a模拟物阴性对照处理   24 h，后续诱导分化处理同1.4.2所述。由于预实验中发现10 nmol/L miR-148a抑制物和miR-148a模拟物对细胞作用的最长时效为6 d，而向心肌样细胞诱导分化的时间较长，故采用多次给药的方式，每隔6 d在换液时加药1次。

1.4.4  CCK-8法检测各组细胞增殖活力  参照文献[25]的方法，各组细胞用人心肌细胞维持培养基制成细胞悬液，以每孔100 μL培养液中含4×10³个细胞的密度接种于96孔培养板，每组设5个复孔，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养12 h，加入10 μL CCK-8工作液轻摇混匀，培养箱中继续培养2 h，用酶标仪在450 nm波长下检测各孔的吸光度值(波长450 nm)，细胞增殖活力越大所测的吸光度值越高。根据公式：活细胞百分比(%)=(实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%，计算相对细胞增殖活力。

1.4.5  qRT-PCR法检测各组细胞中miR-148a的表达^[26]  培养28 d后，用人心肌细胞消化液消化各组细胞，待细胞变圆悬浮后收集至离心管，1 000 r/min离心5 min，去除上清液，向细胞沉淀中滴加Trizol，反复用吸管吹打，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，提取各组细胞总RNA，凝胶电泳法检测RNA质量，以提取的总RNA为模板，用PCR扩增试剂盒在PCR扩增仪上进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板，应用一步法荧光定量RT-PCR试剂盒在实时荧光定量PCR仪上进行检测，反应体系为20 μL，以人GAPDH为内参对照，每组设置5个复孔；50 ℃ 2 min、95 ℃ 2 min、94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s，循环45次，获得Ct值，采用ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量，引物序列见表1。

1.4.6  免疫荧光染色检测细胞中MHC和cTnT的表达^[27]  由于miR-148a抑制物阴性对照和miR-148a模拟物阴性对照对细胞miR-148a mRNA的表达和细胞增殖活力没有影响，故只选取空白对照组、对照组、低表达组和高表达组细胞进行免疫荧光检测。培养28 d后，用人心肌细胞消化液消化各组细胞，待细胞变圆悬浮后收集至离心管，      1 000 r/min离心5 min，去除上清液，用人心肌细胞维持培养基重悬细胞，制成细胞浓度为1×10⁸ L^-1的细胞悬液，接种于事先铺好无菌盖玻片的一次性6孔培养板的各孔内，48 h细胞贴壁完成后取出盖玻片，丙酮固定细胞10 min，0.3% Triton X-100透膜20 min，体积分数为10%山羊血清37 ℃封闭30 min，加入兔抗人MHC(1∶50)和cTnT   (1∶100)单克隆抗体，4 ℃避光孵育过夜，次日滴加羊抗人IgG3-FITC避光孵育45 min，DAPI染核3 min，抗淬灭封固剂封固，荧光显微镜下观察，每组随机选取200倍6个视野，计算阳性表达细胞占细胞总数的百分比。以蓝色荧光染色的细胞核计数细胞总数，以绿色和红色荧光计数阳性细胞数。

1.4.7  Western blot检测细胞中MHC和cTnT的表达^[28]  由于miR-148a抑制物阴性对照和miR-148a模拟物阴性对照对细胞miR-148a mRNA的表达和细胞增殖活力没有影响，故只选取空白对照组、对照组、低表达组和高表达组细胞进行Western blot检测。培养28 d后，用人心肌细胞消化液消化各组细胞，待细胞变圆悬浮后收集至离心管，    1 000 r/min离心5 min，去除上清液，用全细胞蛋白提取试剂裂解细胞，10 000 r/min、4 ℃离心5 min，小心吸取上清液，检测蛋白浓度后煮沸使蛋白变性，调整蛋白浓度使各组上样量均为40 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，2.5%牛血清蛋白室温封闭30 min，分别滴加兔抗人MHC (1∶300)、cTnT(1∶500)单克隆抗体和兔抗人β-actin多克隆抗体(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，次晨滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)摇床孵育1 h，PBS漂洗3次，滴加ECL化学发光工作液在凝胶成像系统中显影，以β-actin为内参照，用Quantity One软件测量条带灰度，将目的条带的灰度值和内参条带灰度值的比值进行统计分析。

1.5  主要观察指标  ①CCK-8检测细胞增殖活力；②qRT-PCR检测miR-148a mRNA的表达；③免疫荧光染色和Western blot检测MHC和cTnT的表达。

1.6  统计学分析  所有实验结果用x(_)±s表示，应用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

蒋昌科等^[22]通过应用miRNA芯片筛选发现经5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化后异常表达miR-148a，提示miR-148a在干细胞向心肌样细胞定向分化过程中发挥调控作用，可提高分化效率。该研究结果显示，空白对照组人诱导性多能干细胞内即有miR-148a的表达，人诱导性多能干细胞向心肌样细胞定向分化后miR-148a的表达升高，提示miR-148a可能在人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化过程中发挥作用，与张文才  等^[37]研究结果一致。CCK-8检测结果显示，miR-148a可促进心肌样细胞的增殖，可能原因是诱导分化培养基中添加了生长因子。

赖卓莉等^[38]研究发现高表达miR-148a不仅可促进人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，还可促进心肌特异性标记物的表达，其可能机制是通过下调DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达促进干细胞的分化。但作者的前期研究中并未发现人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化过程中DNA甲基转移酶1的表达发生变化，且不受miR-148a的影响，故未在研究中描述。MHC是肌原纤维中肌球蛋白的基本组成单位，在维持心肌纤维的收缩与舒张方面发挥重要作用，也是心肌细胞的标记物^[39]。cTnT是另一个心肌特异性标记抗体，属于原肌球蛋白结合亚基^[40]。由于该研究在诱导过程中并未使用心肌细胞作为共培养物，故所检测的细胞均为人诱导性多能干细胞分化而来的细胞，并非心肌细胞的增殖。由于诱导时间较长，收集的细胞处于分化晚期，无法检测早期特异性转录因子；结果显示，人诱导性多能干细胞中不表达MHC和cTnT，向心肌样细胞分化的细胞表达MHC和cTnT，抑制miR-148a的表达可下调MHC和cTnT阳性表达细胞的比例；相反，上调miR-148a的表达则提高MHC和cTnT阳性表达细胞的比例，提示miR-148a可促进人诱导性多能干细胞向心肌样细胞定向分化并上调心肌特异性标志物MHC和cTnT的表达。

总之，该研究观察到miR-148a促进人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化并能提高细胞增殖活力，并未对相关信号通路进行研究，仅初步确定miR-148a的促进分化作用。今后将深入研究miR-148a的靶基因以及信号通路上下游分子，为心肌细胞再生与组织工程提供更多依据。

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文题释义：

人诱导性多能干细胞来源的心肌样细胞：在体外直接将人诱导性多能干细胞定向诱导分化为心肌样细胞具有供者个体基因的特异性，不仅可以进行发病机制的深入研究，还可以进行个体化药物治疗测试，为精准个性化治疗带来希望。来自于患者自身体细胞的心肌细胞扩增速度快，没有免疫排斥和伦理问题，但目前的主要问题是来自于人诱导性多能干细胞的心肌样细胞成熟程度不佳，分化的细胞不具备成人心肌细胞的电生理活动，且纯化有一定困难。

微小RNA的调节作用：微小RNA是一类内源性的非编码单链RNA，通常含有19-22个核苷酸，可通过靶向结合mRNA而使其降解或抑制其翻译，发挥对靶基因的转录后调控作用。近年来，基于芯片分析技术发现有多个miRNA在心肌分化发育或干细胞向心肌样细胞定向分化过程中发挥调控作用，有正向调控也有负向调控。

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心肌血液供应障碍可导致心肌细胞不同程度的死亡，目前临床常用的医疗方法无法实现心肌功能的恢复。应用干细胞定向分化为心肌样细胞进行细胞治疗，促进梗死区域内心肌细胞再生，增加心肌细胞数量以阻止心脏重塑的发生，是防止心肌梗死后心力衰竭和降低远期死亡率的关键。多种来源干细胞在体内、外分化为心肌样细胞的效率一直不尽如人意。该研究通过上调或抑制miR-148a的表达，观察miR-148a对人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化的调控作用，初步确定miR-148a可促进人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化并能提高细胞增殖活力。今后，深入研究miR-148a的靶基因以及信号通路上下游分子，将为心肌细胞再生与组织工程提供更多依据。

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