人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肺损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (14): 2563-2569.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.014

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人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肺损伤

崔蕾¹，雷鑫²，牛玉虎²，陈彦¹，牛勃³，刘卓拉¹

1山西医科大学第二附属医院呼吸科，山西省太原市 030001
2山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001
3首都儿科研究所生物技术研究室，北京市 100020

收稿日期:2012-08-04 修回日期:2012-08-27 出版日期:2013-04-02 发布日期:2013-04-02
通讯作者: 刘卓拉，博士，博士生导师，山西医科大学第二附属医院呼吸科，山西省太原市 030001 liuzhuola@126.com
作者简介:崔蕾★，女，1982年生，山西省太原市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事间充质干细胞和急性肺损伤研究。 namoamituofofo@163.com

Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute lung injury in rats

Cui Lei¹, Lei Xin2, Niu Yu-hu², Chen Yan¹, Niu Bo³, Liu Zhuo-la¹

1 Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
3 Department of Biotechnology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China

Received:2012-08-04 Revised:2012-08-27 Online:2013-04-02 Published:2013-04-02
Contact: Liu Zhuo-la, Doctor, Doctoral supervisor, Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China liuzhuola@126.com
About author:Cui Lei★, Studying for master’s degree, Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China namoamituofofo@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞具有免疫调节特性，脐带间充质干细胞因其特有的优势，将在急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的临床应用中有着光明的前景。
目的：探讨脐带间充质干细胞移植对内毒素性大鼠急性肺损伤模型的保护作用。
方法：将48只健康雄性SD大鼠随机均分为正常对照组、急性肺损伤组和脐带间充质干细胞移植组。后两组采用经气管内滴注内毒素建立急性肺损伤模型。成功造模1 h后，脐带间充质干细胞移植组，经气管内滴注脐带间充质干细胞混悬液，正常对照组和急性肺损伤组同法予以等量生理盐水。分别在干预后24，72 h，观察肺组织病理改变，检测病理组织评分、肺组织干湿质量比、髓过氧化物酶活性及血浆白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α水平。
结果与结论：脐带间充质干细胞移植可以减轻内毒素诱导的急性肺损伤模型的损伤程度；脐带间充质干细胞移植组在各时间点与急性肺损伤组比较，病理损伤评分、肺干湿质量比、肺组织髓过氧化物酶活性、血浆白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平均明显降低，血浆白细胞介素10水平明显升高。说明脐带间充质干细胞对内毒素性急性肺损伤模型有保护作用；其保护机制可能为脐带间充质干细胞移植维持肺内炎性递质和抗炎递质平衡。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 脐带间充质干细胞, 急性肺损伤, 内毒素, 细胞移植, 炎症反应, 病理损伤评分, 肺干湿质量比, 白细胞介素, 肿瘤坏死因子, 抗炎递质, 急性呼吸窘迫综合征, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have immunomodulatory properties. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells have unique advantages, and have a bright future in the clinical treatment of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation on endotoxin-induced acute lung injury model.
METHODS: Forty-eight healthy male Sprague Dawley rats were randomly divided into normal control group, acute lung injury group and umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation group. The rats in the acute lung injury group and umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation group were used to establish the acute lung injury model through intratracheal instillation of endotoxin. One hour after modeling, rats in the umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation group were instilled with umbilical cord-derived mesenchymal stem cells suspension intratracheally, and the rats in the normal control group and acute lung injury group were instilled with normal saline in the same dose intratracheally. After treated for 24 and 72 hours, the pathological changes of the lung tissue were observed, and the histological score, wet and dry weight ratio of the lung tissue, myeloperoxidase activity and the levels of interleukin-6, interleukin-10 and tumor necrosis factor-α were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation could attenuate lung injuries in rat models of acute lung injury. Compared with acute lung injury group, the histological score, wet and dry weight ratio of the lung tissue, myeloperoxidase activity and the levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in the umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation group were decreased at different time points, while the level of interleukin-10 was increased. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells have protective effect on endotoxin-induced acute lung injury models; the protection mechanisms may be that the umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation can maintain the balance between inflammatory mediators and anti-inflammatory mediators in lung tissues.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, acute lung injury, endotoxin, cell transplantation, inflammatory response, protective effect, pathological injury score, lung wet and dry weight ratio, interleukin, tumor necrosis factor, anti-inflammatory neurotransmitters, acute respiratory distress syndrome, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

崔蕾，雷鑫，牛玉虎，陈彦，牛勃，刘卓拉. 人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肺损伤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2563-2569.

Cui Lei, Lei Xin, Niu Yu-hu, Chen Yan, Niu Bo, Liu Zhuo-la. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute lung injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2563-2569.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析 48只大鼠均进入结果分析，无脱失者。

2.2 脐带间充质干细胞形态学观察 原代脐带间充质干细胞接种后12-14 d，细胞可达80%-90%融合。传代后，细胞形态逐渐趋于一致，至第3代脐带间充质干细胞，细胞呈均匀一致的长梭形，平行或旋涡状紧密排列，见图1。

2.3 脐带间充质干细胞表面标志物鉴定及分化能力测定 流式细胞仪表型鉴定结果显示，分离培养的人类脐带间充质干细胞具有典型的间充质干细胞表性特征，CD29、CD44、CD105均呈阳性表达，不表达CD34，见图2。细胞成脂诱导21 d，经油红O染色后，细胞浆内均可见红色脂滴形成；细胞成骨诱导21 d，经茜素红染色，可见大量玫瑰红色钙结节形成，见图3。

2.4 肺组织病理学改变 正常对照组各时间点观察肺泡结构清晰，肺泡间隔完整，肺泡腔清晰，见图4A，B。急性肺损伤组24 h时可见肺泡正常结构消失，肺泡间隔明显增厚，肺间质及肺泡腔内大量炎性细胞浸润及红细胞漏出，肺泡腔内广泛透明膜形成，见图4C。72 h时仍可见肺泡间隔增厚，肺间质及肺泡腔内炎性细胞浸润及红细胞漏出，肺泡腔内透明膜形成，损伤较24 h时略减轻，见图4D。细胞移植组24 h时肺泡结构基本清晰，肺泡间隔仍较正常对照组增厚，较急性肺损伤组明显变薄，肺间质内少量炎性细胞浸润及红细胞漏出，肺泡腔内无透明膜形成，72 h时肺组织损伤明显减轻，见图5。

2.5 肺组织病理损伤评分 正常对照组在24，72 h两个时间点病理损伤评分差别不明显。急性肺损伤组在各时间点病理损伤评分较正常对照组均显著增加(P < 0.05)；脐带间充质干细胞移植租与急性肺损伤组在各时间点比较，病理损伤评分明显降低(P < 0.05)；脐带间充质干细胞移植租在各时间点的病理损伤评分仍明显高于正常对照组(P < 0.05)，见表1。

2.6 血浆白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α水平变化 24，72 h时血浆肿瘤坏死因子α水平比较，急性肺损伤组较正常对照组均显著增加，脐带间充质干细胞移植租与急性肺损伤组比较均降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；在相同时间点血浆白细胞介素6水平比较，急性肺损伤组较正常对照组均显著增加(P < 0.05)，脐带间充质干细胞移植租与急性肺损伤组比较，在24 h时白细胞介素6含量略降低，差异无显著性意义(P > 0.05)，在72 h时白细胞介素6含量明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；在相同时间点血浆白细胞介素10含量比较，急性肺损伤组较正常对照组均显著增加(P < 0.05)，人脐带间充质干细胞移植租与急性肺损伤组比较均增高，且差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.7 大鼠肺组织髓过氧化物酶活性改变 在24，72 h肺组织髓过氧化物酶活性比较，急性肺损伤组较正常对照组均显著增加，脐带间充质干细胞移植租与急性肺损伤组比较均降低，且差异有显著性意义(P < 0.05)；脐带间充质干细胞移植租与正常对照组比较，24 h时差异显著(P < 0.05)，72 h时差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.8 大鼠肺湿/干质量比的变化 在24，72 h两个时间点，急性肺损伤组肺湿/干质量比较正常对照组相比均显著增加(P < 0.05)；脐带间充质干细胞移植租与急性肺损伤组在相同时间点比较，肺湿/干质量比降低，且有显著差异(P < 0.05)；脐带间充质干细胞移植租与正常对照组比较，24 h时间点差异显著(P < 0.05)，72 h时间点比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2009年12月至2010年4月在山西医科大学生物化学和分子生物学实验室完成。
材料：
实验动物：健康雄性SD(Sprague Dawley)大鼠48只，8周龄，体质量180-200 g，清洁级，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(晋)2009-0001。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
脐带来源：脐带均来源于健康足月新生儿剖宫产后，由山西医科大学第二医院妇产科提供，均与孕妇签署知情同意书，实验过程符合医学伦理学标准。
脐带间充质干细胞移植对内毒素诱导的大鼠急性肺损伤模型实验的主要试剂与仪器：
Main reagents and instruments:

方法：
人脐带间充质干细胞的分离与培养：脐带经PBS充分洗涤，剔除动静脉，剪碎至1 mm³大小，接种到T-75 cm²细胞培养瓶中，加入10 mL含体积分数10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的α-MEM培养基，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养。3 d后首次换液，除去非贴壁细胞；以后每3 d换1次液。当细胞生长达到70%-80%融合时，按1∶2比例进行传代接种，第3代细胞用于后续实验。
细胞表型分析及多向分化能力测定：取第3代人脐带间充质干细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD105、CD29、CD44和 CD34的表达。用脂肪细胞诱导培养基和成骨细胞诱导培养基分别诱导人脐带间充质干细胞向脂肪细胞及成骨细胞分化，油红O及茜素红染色后观察。
大鼠急性肺损伤模型的制备^[11]：48只大鼠随机数字表发均分成正常对照组、急性肺损伤组、脐带间充质干细胞移植组。大鼠经腹腔内注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，与操作台倾斜45°固定，冷光源照射于大鼠前颈部，医用镊子撑开口咽、暴露气管开口处，PE-10导管气管插管。急性肺损伤组及脐带间充质干细胞移植组经气管内滴注脂多糖(5 mg/kg)0.1 mL建立急性肺损伤模型，造模1 h后脐带间充质干细胞移植组经气管内滴注脐带间充质干细胞混悬液(1×10⁶溶于0.1 mL生理盐水中)，正常对照组及急性肺损伤组经气管内滴注等量的生理盐水。干细胞移植后24，72 h大鼠在麻醉状态下取血液及肺组织用于后续的检测，每时间点、每组各8只。
血浆细胞因子测定：在各时间点将大鼠经腹腔内注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后固定，开腹暴露腹主动脉，抽取血液5 mL，置于4 ℃离心机中离心10 min， 3 000 r/min，离心半径13.5 cm，封装后保存于-70 ℃冰箱中用于集中检测。用ELISA试剂盒测定血浆中白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α水平变化。
肺组织病理改变及病理损伤评分：取血后打开胸腔，分离肺组织，取右肺下叶以100 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚度切片苏木精-伊红染色，光镜观察病理改变，并在双盲条件下由病理科医师评分[13]。
髓过氧化物酶活性测定：取左肺制备10%肺组织匀浆， 4 ℃离心机，4 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心10 min，取上清液，分装后-70 ℃保存备用。用髓过氧化物酶试剂盒测定肺组织髓过氧化物酶活性。
肺湿/干质量比测定：取右肺上叶，生理盐水漂洗，滤纸吸干肺组织表面水分，称取肺组织湿质量，肺组织放入烘箱中70 ℃干燥48 h，再次称取肺干质量。肺湿质量除以肺干质得出肺湿/干质量比。
主要观察指标：主要观察大鼠肺组织病理损伤改变、肺组织内中性粒细胞浸润及活化程度、大鼠体内炎性递质和抗炎递质含量变化及肺组织含水量改变，评价大鼠急性肺损伤及治疗后修复程度。
统计学分析：数据均由第一作者采用SPSS 13.0软件包处理，计量资料以x±s表示，各组之间比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)，方差齐时两组之间比较采用 S-N-K 检验，方差不齐时用 Games-Howell 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

严重脓毒症或肺炎患者的临床死亡率高达90%，是导致急性呼吸窘迫综合征患者死亡的主要病因^[14]，血浆中内毒素水平与脓毒征所引起的急性肺损伤密切相关，说明内毒素是导致急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症的重要致病因素。本实验经气管内滴注脂多糖建立急性肺损伤模型，大鼠在24 h时间点观察：病理片可见肺泡间隔明显增宽，炎症细胞浸润，肺泡内大量透明膜形成；病理损伤评分、肺湿/干质量比、髓过氧化物酶活性均较正常对照组明显增高；在72 h时间点观察：病理片表现与24 h相似，病理损伤评分、髓过氧化物酶活性、肺湿/干质量比较24 h时略有所降低，但与正常对照组比较仍明显增高。上述结果表明经气管内滴注脂多糖后，大鼠的病理改变符合急性期急性肺损伤的病理改变；肺组织中髓过氧化物酶活性明显升高,进一步证实了肺组织内大量中性粒细胞的聚集；肺湿/干质量比明显增高证明大鼠肺内含水量增加，肺水肿形成，说明本实验经气管内滴注脂多糖诱导大鼠急性肺损伤模型复制成功。

脐带来源的间充质干细胞于1991年被首次发现^[15]，近年来逐渐取代骨髓来源的间充质干细胞，成为间充质干细胞领域中研究的热点^[16]。大量研究证实，人脐带间充质干细胞符合国际细胞治疗协会关于人脐带间充质干细胞的鉴定标准，可成功诱导为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等多种细胞，成为细胞治疗、组织工程与再生医学中理想的种子细胞^[17-19]。实验从形态学、细胞表面标记物与多向分化潜能这三个方面对分离培养所获得的P3代细胞进行鉴定，结果发现，细胞贴壁生长，高表达CD29⁺、CD44⁺、CD105⁺，不表达CD34^-，可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞，符合国际细胞治疗协会关于人脐带间充质干细胞的鉴定标准。

有研究表明间充质干细胞对脂多糖诱导的急性肺损伤有保护作用^[20]。Yamada等^[21]发现给予脂多糖后4 h，外周血中的间充质干细胞明显增加；用含有绿色荧光蛋白标记的胚肝细胞重建 C57BL/6小鼠骨髓，经脂多糖诱导急性肺损伤3周后，肺内出现大量GFP阳性的细胞，一部分细胞表达上皮细胞的表面标志物细胞角蛋白，另一部分细胞表达内皮细胞的表面标志物CD34，表明内源性间充质干细胞在治疗脂多糖诱导的急性肺损伤中发挥了重要的作用。外源性间充质干细胞也会归巢在损伤肺组织中发挥重要生物学作用。Mei等^[22]在经气管内给予小鼠脂多糖30 min后经静脉注射间充质干细胞，发现3 d后支气管肺泡灌洗液中细胞总量和中性粒细胞数量明显减少，病理学分析证实肺内炎性细胞浸润减少、增厚的肺泡间隔变薄、肺间质水肿减轻；将经荧光标记的间充质干细胞注入肺损伤小鼠体内，15 min后即能在肺组织中观察到荧光标记的间充质干细胞，持续大约72 h。Gupta等^[10]在脂多糖诱导损伤后4 h经气管内滴注间充质干细胞，发现BALF中总蛋白浓度及肺组织肺湿/干质量比明显降低，病理学分析显示肺组织出血及水肿减轻，而灭活的间充质干细胞及纤维母细胞移植均无上述效果。表明外源性间充质干细胞移植能够有效地缓解脂多糖诱导的急性肺损伤。目前研究表明，间充质干细胞具有免疫调节作用，通过下调固有免疫细胞和获得性免疫细胞的活性抑制机体的免疫反应^[23-24]。在急性肺损伤动物模型中，间充质干细胞移植抑制免疫细胞活化和聚集，调节机体内促炎因子和抗炎因子的产生。

本实验结果显示，脐带间充质干细胞(1×10⁶)移植治疗后，病理片可见肺泡壁基本完整，肺泡间隔明显变薄，肺间质内炎性细胞浸润程度及红细胞漏出程度较急性肺损伤组明显减轻，肺间质水肿亦明显减轻，肺泡腔内透明膜消失；病理损伤评分、肺湿/干质量比、髓过氧化物酶活性均较急性肺损伤组明显降低；血浆促炎因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素6较急性肺损伤组明显降低、抗炎因子白细胞介素10较急性肺损伤组明显升高。上述结果表明脐带间充质干细胞(1×10⁶)移植治疗对脂多糖诱导的急性肺损伤有一定的保护作用，其机制可能为脐带间充质干细胞移植下调了促炎因子水平并上调了抗炎因子的产生，使肺内炎性递质和抗炎递质保持平衡，使肺内环境由促炎症反应向抗炎症反应转变，从而阻止肺内炎症反应继续进展。

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外审意见与作者答疑：

问题1 单纯MSCs气管注入正常小鼠是否对以上这些指标有所影响未知，建议补充？
作者回答：前期资料查询时国外有三篇经气道途径移植MSCs治疗ALI的文献报道[1-3]，均未阐明单纯MSCs气管注入对正常小鼠的影响，我们亦未注意到这个问题，未做相关的预实验及实验。在下一步不同MSCs给入途径治疗效果的比较中，我们会完善实验设计，加入这部分实验。
[1]Gupta N, Su X, Popov B, et al. Intrapulmonary delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves survival and attenuates endotoxin-induced acute lung injury in mice. J Immunol.2007;179(3):1855–1863.
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[3] Kim ES, Chang YS, Choi SJ, et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells attenuates Escherichia coli-induced acute lung injury in mice. Respir Res. 2011;12:108.

问题2 检测时间点分为24h、72h，为何选取该时间点请给予解释，且建议给出单次MSCs注入后不同时间段细胞停留于体内的情况？
作者回答：检测时间点选取原因：相关文献及前期实验表明大鼠经气管内滴注LPS造模后24 h时间点，肺组织损伤程度最高，所以选取24 h时间点观察UC-MSCs移植后肺部损伤及修复情况，可以更有利的证明UC-MSCs移植后的治疗作用；相关文献表明MSCs移植后72h，体内几乎检测不到MSCs，说明MSCs在体内的免疫调节及修复作用主要集中于MSCs移植后至72 h这个时间段，所以选取这个时间点观察相关肺损伤指标。

问题3 单次MSCs注入后不同时间段细胞停留于体内的情况如何？
作者回答：最初实验设计有MSCs移植活体示踪研究，可以连续监测不同时间点UC-MSCs在大鼠体内停留情况，但由于资金及实验条件的限制，这部分实验未能实施，但目前国内外有干细胞活体示踪相关研究。

人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肺损伤

Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute lung injury in rats

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