大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (14): 2570-2577.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.015

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大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

卫肖艳¹，张莉¹，林明²，陈欢¹，彭博¹，彭园园¹，李富运¹，洪培馨¹，范伊凡¹

1 北京中医药大学针灸推拿学院，北京市 100029
2 北京大学医学部基础医学院细胞生物学与遗传学系，北京市 100083

收稿日期:2012-10-26 修回日期:2013-01-31 出版日期:2013-04-02 发布日期:2013-04-02
通讯作者: 张莉，教授，北京中医药大学针灸推拿学院针灸临床系，北京市 100029 zhangli1572@sina.com
作者简介:卫肖艳☆，女，1982年生，山西省运城市人，汉族，北京中医药大学在读博士，主要从事针灸与血管再生的研究。 wxy66603704@163.com
基金资助:
国家自然科学基金专项基金项目(81141120)。

Isolation, culture and identification of rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells

Wei Xiao-yan¹, Zhang Li¹, Lin Ming², Chen Huan¹, Peng Bo¹, Peng Yuan-yuan1, Li Fu-yun¹, Hong Pei-xin¹, Fan Yi-fan¹

1 College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029, China
2 Department of Cell Biology and Genetics, College of Basic Medical Sciences, Health Science Center, Peking University, Beijing 100083, China

Received:2012-10-26 Revised:2013-01-31 Online:2013-04-02 Published:2013-04-02
Contact: Zhang Li, Professor, College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029, China zhangli1572@sina.com
About author:Wei Xiao-yan☆, Studying for doctorate, College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029, China wxy66603704@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of Vhina (Special Program), No. 81141120

摘要/Abstract

摘要：

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同，在实验中难以重复。
目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。
方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞，使用EGM-2 MV培养基进行诱导培养，采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定，并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。
结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后，在生长的早期(8 d左右)、晚期(15 d左右)其细胞形态有一定差异，早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见，晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8，21 d的细胞均为阳性。③免疫荧光化学染色：8 d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15 h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2 MV进行诱导培养，经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 内皮祖细胞, 单个核细胞, 密度梯度离心法, 细胞培养, 细胞鉴定, 管腔形成, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Endothelial progenitor cells have a very broad application prospect, but the isolation and culture methods differ greatly and therefore are hard to repeat.
OBJECTIVE: To investigate the isolation and culture methods of bone marrow-derived endothelial progenitor cells.
METHODS: Bone marrow mononuclear cells were isolated from 4-week-old Sprague-Dawley rats by density gradient centrifugation methods and cultured by EGM-2 MV medium. Then the cells were identified by morphological observation, FITC-UEA-1 binding and Dil-Ac-LDL uptake assay, and fluorescent immunocytochemistry for detection CD133 and VEGFR2 expression. In addition, angiogenic tube formation was determined by Matrigel tube formation assays.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Morphology: After induced culture, the isolated bone marrow mononuclear cells exhibited a spindle-shaped, triangular, and round appearance in the early stage (about the 8th day) and round and short spindle-shaped appearance in the late stage (about the 15th day). (2) FITC-UEA-1 binding and Dil-Ac-LDL uptake assay: Cells were positive on days 8 and 21. (3) Fluorescent immunocytochemistry: on day 8, cells expressed CD133 and VEGFR2. (4) Matrigel tube formation assays: Capillary-like structures formed at 15 hours on Matrigel. These findings suggest that rat bone marrow mononuclear cells isolated by density gradient centrifugation method and cultured by EGM-2MV medium correspond to the characteristics of endothelial progenitor cells. This method is simple, quick, and reliable to harvest enough endothelial progenitor cells.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, endothelial progenitor cells, mononuclear cells, density gradient centrifugation, cell culture, cell identification, tube formation, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

卫肖艳，张莉，林明，陈欢，彭博，彭园园，李富运，洪培馨，范伊凡. 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2570-2577.

Wei Xiao-yan, Zhang Li, Lin Ming, Chen Huan, Peng Bo, Peng Yuan-yuan, Li Fu-yun, Hong Pei-xin, Fan Yi-fan. Isolation, culture and identification of rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2570-2577.

图/表（结果） 4

2.1 大鼠骨髓源内皮祖细胞体外诱导的形态学观察显微镜下观察，新分离骨髓单个核细胞呈圆形，里面混有部分红细胞，见图1A；原代细胞接种二三天时，部分圆形细胞伸开突起，呈短梭形贴壁，见图1B；之后贴壁细胞数目不断增多，至4 d将未贴壁细胞移去再重新接种二三天后仍有部分贴壁。首次换液后细胞生长加快，呈集落样生长，见图1C；7 d时细胞生长旺盛，已较为密集，可见纺锤形、三角形、圆形等不同形态之细胞，见图1D；10 d左右时，未传代培养的细胞可继续培养30-40 d，形态为圆形、短梭形等，呈“铺路石”样，见图1E、1F；机械吹打法传代培养的细胞迅速呈“克隆”样增殖，生长迅速，见图1G。

实验中不进行传代而持续培养的情况下，发现细胞生长存在2个生长高峰，第1个位于8 d前后，第2个生长高峰位于15 d左右。细胞的形态在生长的早期、晚期有一定差异，早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见，晚期以圆形、短梭形细胞多见。

2.2 摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验结果 倒置荧光显微镜下观察，摄取Dil-Ac-LDL的细胞胞浆呈红色，摄取FITC-UEA-1的细胞胞浆呈绿色。骨髓单个核细胞培养8 d时，双阳性的细胞约占细胞总数的95%以上，见图2A、2B。骨髓单个核细胞培养21 d时，大部分细胞染色仍呈双阳性，见图2C、2D。说明骨髓单个核细胞培养8 d和21 d时均能够同时摄取Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1，为正在分化的内皮祖细胞。

2.3 免疫荧光染色结果 骨髓单个核细胞培养8 d时，行免疫荧光化学法法检测细胞表面抗原表达情况。荧光显微镜下可见，在蓝光激发下，经FITC标记的CD133染色的细胞表面呈绿色荧光，见图3A；在绿光激发下，经PE标记的VEGFR2染色的细胞呈红色荧光，见图3B。说明表面抗原CD133与VEGFR2的表达均为阳性。

2.4 管腔形成实验结果 将培养21 d的骨髓源原代内皮祖细胞接种至包被了Matrigel的96孔板上后，15 h左右甚至更早即可见细胞拉长变形，分化为管腔状结构，见图4。

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引言

内皮祖细胞是一群异质性的细胞群体^[1]，主要起源于骨髓里复杂的前体细胞，并以不同的分化阶段存在于外周循环中^[1-2]。因其是能分化为内皮细胞的前体细胞，因此被命名为内皮祖细胞。1997年时，Asahara等^[3]首次利用细胞表面标志物CD34等通过免疫磁珠的方法从人的外周血中成功分离得到内皮祖细胞，并证明其在体内有形成血管的能力，随后于1999年证明来源于骨髓的内皮祖细胞能以血管发生的方式参与出生后的生理与病理性的血管形成^[4]。内皮祖细胞的成功发现彻底改变了人们对于血管形成的认识，它能够选择性地归巢到受损或者缺血部位，参与局部的血管发生与血管新生，从而形成血管，同时，还能促进内皮的修复等。近年来，研究显示内皮祖细胞具有十分广阔的应用前景，可用于血管新生、内皮再生、心血管病治疗、肿瘤的治疗、缺血性治疗、组织工程、基因治疗等领域^[5-12]，因此，简单、快速、可靠、足量地获取内皮祖细胞十分必要。

目前，获取内皮祖细胞常用的方法主要有免疫磁珠分离法、流式细胞分选术、密度梯度离心法，或以上几种方法相互配合等^[13-16]。前两种方法获取的细胞较纯，但由于内皮祖细胞为异质性群体，选用单独的表面标志容易将大量的原本属于内皮祖细胞的细胞群丢弃，使获取的细胞数目较少，且生存分化能力有限，同时，成本较高，不利于大规模的培养扩增，因此，许多研究者采用密度梯度离心法来获取骨髓单个核细胞^[17-18]。但是，目前国内外学者对于内皮祖细胞分离和培养的方法表述并不一致^[19-20]，在实验中往往难以重复。

实验进行了SD大鼠骨髓来源的内皮祖细胞的分离、培养与鉴定，为进一步研究和应用内皮祖细胞奠定基础。

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：实验于2011年9月至2012年9月在北京大学医学部细胞生物学系实验室完成。
材料：
骨髓源性内皮祖细胞的供体实验动物：SD大鼠，雄性，三四周龄，体质量(120±10) g，SPF级，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证编号：SCXK(京)2011-0012。
EGM-2 MV BulletKit(CC-3202)由EBM-2与EGM-2MV SingleQuots组成，后者含FBS 25 mL、Hydrocortisone 0.2 mL、重组人碱性成纤维细胞生长因子2 mL、血管内皮生长因子0.5 mL、R3-IGF-1 0.5 mL、Ascorbic acid 0.5 mL、人表皮生长因子0.5 mL、GA-1000 0.5 mL。
大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定所用主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

方法：
大鼠骨髓单个核细胞的分离：取大鼠1只，腹腔注射过量的10%水合氯醛麻醉致死，浸入盛有体积分数75%乙醇的烧杯中消毒15 min后移出，无菌条件下取出股骨、胫骨，去除干净附着于骨表面的肌肉。将获取的骨头浸入盛有磷酸盐缓冲液的小烧杯中，5 min后将骨头移出，取滴管吸取1 mL磷酸盐缓冲液冲洗后放于无菌小培养皿中，用小剪刀减去骨头两端的干骺端，暴露出骨髓腔。取一支10 mL一次性注射器抽取6 mL的磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔数次，至骨头发白透亮，收集细胞悬液。取大鼠淋巴细胞分离液6 mL加入12 mL的离心管中，倾斜45°，再缓缓将细胞悬液加于淋巴细胞分离液之上，使其体积比为1∶1，注意保持两者之间的界面清晰，勿使其彼此混合。将离心管配平后放于离心机中，离心半径12 cm，2 500 r/min，离心25 min；缓缓取出离心管，可看到离心管内的液体分为4层，最下层为红细胞与粒细胞，中间层为淋巴细胞分离液，最上层为血浆与磷酸盐缓冲液，在中间层与最上层之间有一层薄薄的云雾状层，包含有骨髓单个核细胞、淋巴细胞等，以移液器直插入该层，缓缓抽吸；将抽取的液体转移入另一离心管中，然后加入10 mL磷酸盐缓冲液，吹打均匀，离心，离心半径12 cm，1 500 r/min，10 min；吸弃上清液，取10 mL磷酸盐缓冲液将细胞沉淀吹打均匀，离心，半径12 cm，1 500 r/min，10 min；吸弃上清液，加入3mL EGM-2 MV完全培养基，将细胞沉淀吹打均匀，并计数，调整细胞浓度为(5.0-6.0)×10⁹ L^-1[21]。
细胞培养板的预包被：取200 µL质量浓度为1 g/L的纤维连接蛋白，加入3.8 mL的磷酸盐缓冲液中，将其稀释为质量浓度为50 mg/L的终液。使用时按照5 µg/cm²包被，即24孔板的每孔中加入200 µL的纤维连接蛋白，在室温条件下静置30 min。吸出多余的纤维连接蛋白，储存备用。
内皮祖细胞的诱导培养：将调整好浓度的细胞悬液加入预先包被好的24孔板中，每孔1 mL，轻轻晃动培养板使细胞分散均匀，置于37 ℃、CO₂体积分数5%、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，4 d后首次换液，去除未贴壁的细胞，以后每三四天换液1次。10 d左右时，将其分成两组分别处理。其中一组细胞不进行传代，继续培养30-40 d，每三四天换液1次，并对其进行鉴定；另一组通过机械吹打法传代培养，换液方法同前，此组仅观察形态学变化。
形态学观察：每天于倒置显微镜下观察细胞形态学的改变。
摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：取培养8 d与21 d的细胞，将孔内的液体吸弃，每孔加入300 µL Dil-Ac-LDL (10 mg/L)，置于二氧化碳培养箱中孵育4 h取出后用磷酸盐缓冲液漂洗3次，注意动作轻柔，每次5 min；再以40 g/L多聚甲醛固定15 min后，用磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min；加入FITC-UEA-1 (10 mg/L)^[22]，每孔300 µL，继续置于培养箱中孵育1 h；以磷酸盐缓冲液漂洗3次后置于倒置荧光显微镜观察并拍照。能够同时摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1的细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞。
免疫荧光化学染色：取培养8 d的细胞，将孔内的培养液弃去，以磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min；加入40 g/L多聚甲醛室温固定30 min后，以磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min；加入5%BSA置于培养箱中孵育30 min后，吸弃BSA；分别加入一抗VEGFR2(工作浓度1∶100)、CD133(工作浓度1∶200)，室温过夜或者置于二氧化碳培养箱中37 ℃ 1 h；以磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min；加入对应二抗PE标记山羊抗兔IgG(工作浓度1∶20)与FITC标记的兔抗山羊IgG(工作浓度1∶200)，孵育1 h；以磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min，倒置显微镜下观察。
管腔形成实验：从-20 ℃冰箱中取出Matrigel置于 4 ℃冰箱中过夜解冻；实验前将移液器枪头、96孔细胞培养板等器材置于4 ℃冰箱中预冷30 min；在低温环境中向96孔板中加入Matrigel原液，每孔60 µL，注意加胶时一次性加入板底，枪头内胶液不要打尽，以免产生气泡，将铺好的培养板轻轻晃动，以使液面尽量水平；将铺好的培养板置于培养箱中30 min，使其成胶；取预先消化好的21 d的骨髓源原代内皮祖细胞，调整其浓度为4×10⁸ L^-1，每孔加入150 µL细胞悬液，置于标准二氧化碳培养箱中培养(37 ℃、CO₂体积分数5%、饱和湿度)；于15 h后于倒置显微镜下观察管腔形成情况并拍照^[23]。
主要观察指标：骨髓源性内皮祖细胞摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1的情况；骨髓源性内皮祖细胞免疫荧光化学染色观察；骨髓源性内皮祖细胞管腔形成能力的观察。

讨论

自从Asahara等分离和培养出内皮祖细胞后，越来越多的学者开始对其进行研究。但是由于内皮祖细胞在外周血中的数量很少，健康人的100 mL血液仅能获取约5×10⁶个细胞，因此获得足量的内皮祖细胞成为基础与临床研究的瓶颈。通过研究发现，不仅外周血中存在内皮祖细胞，骨髓、脐血、脾脏、胎肝等多种组织都能分离培养出内皮祖细胞^[24-28]。有研究发现，相对于外周血和脐血来说，骨髓中含有大量的干细胞和祖细胞，内皮祖细胞的含量更为丰富，且增殖能力更强^[29]。同时，骨髓还具有取材方便、创伤小、自体使用无排异反应等优点，因此骨髓成为内皮祖细胞的最佳来源。

获取骨髓冲洗液后可以利用密度梯度法获取骨髓单个核细胞，然后采用特殊培养基诱导培养以得到内皮祖细胞，这一点得到了绝大多数研究者的认同，但对于首次换液的时间及方式的报道则差异较大。既往有研究认为，利用差速贴壁法在实验48 h时将已贴壁的细胞丢弃，将未贴壁的细胞收集继续接种培养以得到内皮祖细胞^[30]。另有研究者认为可在第4天时直接换液再每3 d换液1次来培养。实验采用将细胞接种后直接于4 d时再进行换液的方法，并对其不进行传代而持续培养，发现细胞生长存在2个生长高峰，第1个位于8 d前后，第2个生长高峰位于15 d左右^[31]。在研究中还发现，培养早期出现的细胞与晚期的细胞在形态方面有一定的差异：原代细胞培养第3-8天的细胞以三角形与纺锤形者为多见； 8 d左右，逐渐出现圆形与短梭形样细胞，且逐渐增多，至15 d左右此类细胞已逐渐占统治地位，逐渐呈铺路石样，早期的细胞渐少见。因此认为在原代细胞接种培养后4 d换液是比较合适的时间，可以得到两种不同特点的内皮祖细胞，以便于根据实验的需求进行选择。上述的研究发现与既往的研究结果较一致，Hur等[18]曾报道称成人外周血来源的内皮祖细胞存在两种不同类型，根据它们出现的时间分别命名为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞。早期内皮祖细胞于培养的3-5 d时出现贴壁细胞，成簇分布，呈纺锤形，能增殖但较缓慢，约能存活4周，其基因表达不完整，随着生长逐渐表达CD31、CD45，开始低水平表达KDR与VE-cadherin等基因，增殖与分化能力较弱；晚期内皮祖细胞出现在第2-4周，有光滑的胞浆轮廓，贴壁牢靠，呈铺路石样外观，增殖迅速，很快便可由几个细胞增殖形成克隆，融合为单层，能表达KDR、CD31、vWF和VE-cadherin等基因，有更强的抗凋亡能力、分化能力与体外成血管能力。两者均能够摄取摄取Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1。
为了证明所获取的细胞确实为内皮祖细胞，对其进行了相关的鉴定。目前公认的内皮祖细胞鉴定方法为主要有3种：一是形态学观察，二是观察内皮祖细胞摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1的能力，三是采用免疫荧光化学染色或流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。内皮祖细胞被认为具有摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1的能力^[32-33]。实验对培养8 d与21 d的细胞分别进行摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验，结果显示绝大部分细胞二者均为阳性。内皮祖细胞的表面抗原通常包括CD34、CD133、VEGFR2^[34-35]，其中CD34、CD133是干细胞的主要标志，CD34主要表达在造血干细胞、内皮祖细胞等表面，而内皮祖细胞在分化内皮细胞的过程中，CD133含量迅速降低并表达出内皮细胞的膜抗原^[36-37]，VEGFR2则是区别内皮系细胞与非内皮系细胞的重要标志。实验采用了免疫荧光化学法鉴定了表面抗原CD133与VEGFR2的表达情况，其结果均为阳性。由于管腔形成能力是内皮祖细胞与内皮细胞的重要功能特性，故在以上3种鉴定方法之外又进行了管腔形成能力实验以观察内皮祖细胞的功能特性，结果发现获得的细胞能够在Matrigel形成管腔样结构，从而证实了其具有形成管腔的能力。

通过实验发现，分离和培养内皮祖细胞比较理想的方法是，利用密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞后，将细胞以合适的密度接种于包被有纤维连接蛋白的培养器皿内，然后以EGM-2 MV进行诱导培养，在接种后的4 d进行换液，以后每3 d换液1次。这种方法能够简单、方便、可靠地获取两种内皮祖细胞，以便于不同的实验需求。若欲使用早期内皮祖细胞，可于8 d左右消化以进行后续试验，若欲使用晚期内皮祖细胞，则需将细胞继续培养至15 d以后，再根据细胞状态选用。而对于内皮祖细胞的鉴定则最好在传统的3种鉴定方法之外，辅以管腔形成能力试验，以观察内皮祖细胞的功能情况。

研究中还发现，实验过程中的一些操作细节对于内皮祖细胞的获取至关重要。在获取骨髓单个核细胞的过程中，要注意操作的迅速、无菌。可将大鼠过量麻醉致死后迅速浸泡15 min，然后移入无菌台剥去外层皮毛，使用小剪刀、无菌纱布或棉花等清除干净股骨与胫骨表面附着肌肉。减去干骺端后，可采用磷酸盐缓冲液进行冲洗，亦可采用培养基等，因培养基带有一定的颜色，其冲洗液在离心后较使用磷酸盐缓冲液冲洗离心后所
形成的云雾状层更容易分辨，且培养基含有较多的适合细胞生长的营养物质，亦有利于细胞活力的保持，但是相对而言成本较高。在细胞接种前，尽可能对细胞培养板进行包被，可采用纤维连接蛋白^[38-39]、鼠尾胶等^[40]。观察发现，采用纤维连接蛋白包被过的细胞培养板较未包被过的培养板，细胞贴壁更为迅速和牢靠。因分离出的骨髓单个核细胞中混杂有大量的红细胞，容易影响细胞计数，可在第2次离心获取细胞沉淀时，先弃去上清，加入1 mL 磷酸盐缓冲液并吹打均匀，然后加入3 mL红细胞裂解液或者NH₄Cl溶液置于4 ℃冰箱内孵育10 min，再加入8 mL 磷酸盐缓冲液离心，以裂解红细胞。实验中最为关键的细胞接种的密度，既往有文献报道采用以(5.0-6.0)×10⁹L^-1为宜^[21]，密度过大或过小皆不利于细胞的贴壁与分化。细胞的首次换液时间以4 d为宜，换液时可移去90%的细胞培养基，再加入新鲜的培养基，由于细胞在生长的过程中可能会分泌一些生长因子，因此保留部分旧培养基有利于细胞的生长。

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

Isolation, culture and identification of rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells

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