间充质干细胞诱导糖尿病小型猪同种异体胰岛移植的免疫耐受

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (14): 2558-2562.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.013

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

间充质干细胞诱导糖尿病小型猪同种异体胰岛移植的免疫耐受

杨锐，马昭杰，陈容平，王梅，张振，蔡德鸿，陈宏

南方医科大学珠江医院内分泌科，广东省广州市 510282

收稿日期:2012-07-13 修回日期:2012-08-13 出版日期:2013-04-02 发布日期:2013-04-02
通讯作者: 陈宏，博士，主任医师，教授，南方医科大学珠江医院内分泌科，广东省广州市 510282
作者简介:杨锐★，男，1977年生，广东省广州市人，汉族，2010年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，讲师，主要从事糖尿病胰岛移植应用基础研究。 yangrui91@163.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(30570884)。

Immune tolerance induced by bone marrow mesenchymal stem cells after islet allotransplantation in diabetic minipigs

Yang Rui, Ma Zhao-jie, Chen Rong-ping, Wang Mei, Zhang Zhen, Cai De-hong, Chen Hong

Department of Endocrinology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Received:2012-07-13 Revised:2012-08-13 Online:2013-04-02 Published:2013-04-02
Contact: Chen Hong, M.D., Chief physician, Professor, Department of Endocrinology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
About author:Yang Rui★, Master, Attending physician, Lecturer, Department of Endocrinology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China yangrui91@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30570884

摘要/Abstract

摘要：

背景：胰岛移植为有望根治糖尿病的一种方法，而移植排斥问题阻碍了移植的开展，诱导受体对供体移植物的免疫耐受是解决同种异体移植排斥反应的关键。
目的：观察骨髓间充质干细胞输注对糖尿病小型猪同种异体胰岛移植物存活时间的影响。
方法：无菌条件下抽取动物骨髓，离心弃上清。取单核细胞层，洗涤后加入L-DMEM培养基，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1。培养48 h后换液去除未贴壁的细胞，依据贴壁培养法分离和扩增间充质干细胞。取第5代细胞作为移植供源，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1。四氧嘧啶制备糖尿病小型猪模型，随机分为骨髓细胞组和干细胞+骨髓细胞组，经肝门静脉分别植入胰岛细胞、骨髓细胞，胰岛细胞、骨髓细胞和骨髓间充质干细胞。
结果与结论：骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注较单纯骨髓细胞输注能显著延长同种异体小型猪胰岛移植物存活时间(P < 0.05)，同时受体血清胰岛素能较长时间维持较高水平。提示骨髓间充质干细胞输注能显著延长猪胰岛移植物存活时间，并促进胰岛移植物正常功能的发挥。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 骨髓间充质干细胞, 胰岛, 移植, 同种异体胰岛移植, 免疫耐受, 骨髓细胞, 胰岛细胞, 糖尿病小型猪模型, 小型猪, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Islet transplantation is a promising method used to radically cure diabetes mellitus. The immune rejection caused by transplantation hinders the development of transplantation. The immune tolerance of recipients to donor grafts is a key to solving the problem of allotransplantation rejection reaction.
OBJECTIVE: To investigate the influence of infusion of bone marrow mesenchymal stem cells on the survival time of islet allograft in the minipigs after islet allotransplantation.
METHODS: Under sterile condition, minipig bone marrow was taken and the supernatant was discarded after centrifugation. After washed with L-DMEM culture medium, mononuclear cells were adjusted to be 1×10⁹/L. After 48-hour culture, nonadherent cells were discarded and mesenchymal stem cells were isolated and amplified. Passage 5 cells were taken as donors and cell concentration was adjusted to be 1×10¹⁰/L. Minipig models of alloxan-induced diabetes mellitus were prepared and then randomly divided into two groups: bone marrow cells and bone marrow cells + mesenchymal stem cells. In the bone marrow cells group, islet cells and bone marrow cells were infused. In the bone marrow cells + mesenchymal stem cells group, islet cells, bone marrow cells and bone marrow mesenchymal stem cells were infused.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with infusion of simple bone marrow cells, infusion of bone marrow mesenchymal stem cells and bone marrow cells significantly prolonged the survival time of islet allografts (P < 0.05) and maintained high serum insulin level for a longer time in diabetic minipigs. These findings suggest that bone marrow mesenchymal stem cell infusion can significantly prolong the survival time of islet allografts and contribute to the normal function of islet allografts in diabetic minipigs.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, bone marrow mesenchymal stem cells, islet, transplantation, islet allotransplantation, immune tolerance, bone marrow cells, islet cells, minipig model of diabetes mellitus, minipig, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

杨锐，马昭杰，陈容平，王梅，张振，蔡德鸿，陈宏. 间充质干细胞诱导糖尿病小型猪同种异体胰岛移植的免疫耐受[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2558-2562.

Yang Rui, Ma Zhao-jie, Chen Rong-ping, Wang Mei, Zhang Zhen, Cai De-hong, Chen Hong. Immune tolerance induced by bone marrow mesenchymal stem cells after islet allotransplantation in diabetic minipigs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2558-2562.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验选用小型猪6只，分为2组，无脱失，进入结果分析6只。

2.2 小型猪胰岛生物学活性 纯化后，平均每头小型猪消化胰腺(15.62±1.09) g组织，平均每克小型猪胰腺组织可获得胰岛细胞团(3 025.83±350.28)IEQ, 胰岛纯度为(75.97±3.15)%。纯化后的胰岛细胞高糖时胰岛素的释放量为(35.31±2.09) mIU/L，为低糖时(12.87± 0.94) mIU/L的2.74倍(P < 0.05)，提示纯化后胰岛细胞功能良好。

2.3 小型猪间充质干细胞细胞形态学观察 原代骨髓单个核细胞接种后，因培养液中含有未完全清除的其他细胞如红细胞和细胞碎片等，镜下观察比较混浊，可见大量的单个核细胞悬浮培养液中，大小不等，呈圆形，见图1A；接种24 h后有部分细胞开始贴壁生长，少许细胞开始变形，48 h首次换液后，贴壁细胞明显增大呈梭形、三角形或不规则形，开始有细胞分裂增殖形成散在的细胞团。经过3次换液后，悬浮细胞已基本清除，贴壁细胞明显增多呈漩涡状排列，部分发生融合。融合达80%时传代。传代后细胞生长迅速，均匀分布，细胞排列更加有序，见图1B；连续四五次传代后细胞可被纯化，呈均匀有序的成纤维母细胞形态。

2.4 小型猪间充质干细胞表型测定 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞中CD29、CD44阳性细胞的表达率分别为95.6%、97.1%，CD34、CD45阳性细胞的表达率分别为2.25%、2.32%，见图2。

2.5 移植物生存时间 见图3，表1，骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注组胰岛移植物生存时间较单纯骨髓细胞输注组显著延长(P < 0.05)，平均生存时间为17 d。

2.6 糖尿病小型猪血清胰岛素水平的测定 见表2，骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注组移植后7，14 d猪血清胰岛素水平较移植前明显增高(P < 0.05)，排斥后胰岛素水平回落。单纯骨髓细胞输注组移植后7d胰岛素水平亦明显增高(P < 0.05)。

参考文献

[1] Li M, Cai DH, Zhang H, et al. Jiefangjun Yixue Zazhi.2008; 33(3):269-272.李明,蔡德鸿,张桦,等.间充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受的研究[J].解放军医学杂志,2008,33(3):269-272.

[2] Zhang H, Cai DH, Han JL, et al.Nanfang Yikedaxue Xuebao. 2007;27(6):824-826.张桦,蔡德鸿,韩钧凌,等.半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究[J]. 南方医科大学学报.2007,27(6):824-826.

[3] Zhang H, Chen H, Sun J，et al.Guangdong Yixue.2007; 28(3): 349-351.张桦,陈宏,孙嘉,等.推进式离心管结合单密度梯度法快速纯化大鼠胰岛[J].广东医学,2007,28(3):349-351.

[4] Guo Z，Wu T,Sozen H,et al.A substantial level of donor hematopoietic chimerism is requiredto protect donor-specific islet grafts in diabetic NOD mice. Transplantation. 2003;75(7): 909-915.

[5] Masak K,Yoshinori I,Shin M, et al.An irradiation-free nonmyeloablative bone marrow transplantation model : important of the balance between donor T-cell number and the intensity of conditioning.Transplantation. 2005;80(9): 1145-1152.

[6] Zhang J, Zhang Q, Zhang YC, et al. Qiguan Yizhi. 2011;6(2): 350-353.张剑,张琪,张英才,等.骨髓间充质干细胞对异种胰岛移植排斥反应的影响[J].器官移植,2011,6(2):350-353.

[7] Ding Y, Xu D, Feng G, et al. Mesenchymal stem cells prevent the rejection of fully allogenic islet grafts by the immunosuppressive activity of matrix metalloproteinase-2 and -9. Diabetes.2009;58: 1797-1806.

[8] Zhao Y, Lin B, Darfl inger R, Zhang Y, et al. Human cord blood stem cellmodulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice.PLoS One.2009;4(1):e4226.

[9] Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol.2002;30(1): 42-48.

[10] Krampera M,Glennie S,Dyson J ,et al .Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the responses of naïve antigen specific T-cells to their cognate peptide.Blood. 2003; 101(9):3722-3729.

[11] Aggarwal S, Pittenger F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood. 2005; 105(4): 1815-1822.

[12] Park MJ, Shin JS, Kim YH,et al. Murine mesenchymal stem cells suppress T lymphocyte activation through IL-2 receptor α (CD25) cleavage by producing matrix metalloproteinases. Stem Cell Rev.2011;7:381-393.

[13] Sioud M,Mobergslien A,Boudabous A,et al. Evidence for the involvement of galectin-3 in mesenchymal stem cell suppression of allogeneic T-cell proliferation. Scand J Immunol. 2010;71(4): 267-274.

[14] Deng WM, Han Q, You SG, et al. Zhonghua Jianyanyixue Zazhi.2003;26(8):466-469.邓为民,韩钦,尤胜国,等.异基因骨髓源间充质干细胞移植形成稳定的嵌合体并诱导免疫耐受的研究[J].中华检验医学杂志,2003, 26(8):466-469.

[15] Zhang J,Li H,Jiang N,et al. Inhibition of rejection in murine islet xenografts by CTLA4Ig and CD40LIg gene transfer.Chin Med J(Engl).2010;123(21):3106-3109.

[16] Wang Y,Zhang A,Ye Z,et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibit acute rejection of rat liver allografts in association with regulatory T-cell expansion. Transplant Proc.2009;41(8):4352-4356.

引言

材料方法

设计：分组对比观察。
时间及地点：实验于2010年2月至2011年1月在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。
材料：
实验动物：雄性4-6个月西藏小型猪6只，体质量15-25 kg，南方医科大学动物中心提供，四氧嘧啶建立小型猪糖尿病模型。
间充质干细胞诱导糖尿病小型猪同种异体胰岛移植的免疫耐受实验用试剂：
Main drugs and reagents:

实验方法：
小型猪骨髓间充质干细胞培养、扩增及鉴定：麻醉动物后无菌条件下抽取骨髓20 mL，离心获取单核细胞层，贴壁培养，48 h后换液去除未贴壁细胞，此后每三四天换液1次, 依据贴壁培养法分离和扩增骨髓间充质干细胞。用FITC标记兔抗猪的CD29、CD34、CD44、CD45，按1 μg抗体/106细胞分别标记细胞，于室温避光保存30 min。取出后PBS洗涤离心2次，加入PBS 500 μL重悬成单细胞悬液，流式细胞仪检测。取第5代细胞作为移植供源，调整细胞浓度1×10¹⁰ L^-1。
骨髓细胞悬液的制备：获取的骨髓液离心弃上清后，加入红细胞裂解液去除红细胞，离心洗涤后加入RPMI1640培养基培养，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，锥虫蓝染色计数检测活细胞率。
四氧嘧啶制备糖尿病小型猪模型：在胰岛移植前10 d左右，观察小型猪的健康情况，记录体质量、进食量、饮水量和尿量，所有动物禁食12 h后，于耳源静脉注射5%的四氧嘧啶(200 mg/kg)。四氧嘧啶溶液用新鲜的生理盐水配制，采用涡旋混匀器充分混匀,避光保存。现用现配，尽量在5-8 min内注射完毕。按编号注射，注射72 h后取耳缘静脉血以微量血糖测定仪测定各实验小型猪的血糖水平，若连续2次空腹血糖超过7.0 mmol/L者即糖尿病模型建模成功。
猪胰岛细胞的分离及纯化：胰管内灌注胶原酶V，经自制的半自动胰腺消化装置消化^[2]，胰腺消化物用自制的推进式离心管结合HCA-Ficoll单一密度梯度液(1.096 g/mL)纯化^[3]，双硫腙(DTZ)对胰岛进行特异性染色，检测胰岛细胞量和纯度，并利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。
实验分组和同种异体胰岛移植：动物随机分为单纯骨髓细胞输注组(骨髓细胞组)，骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注组(干细胞+骨髓细胞组)，每组各3头。在无菌条件下，将5×10⁴胰岛细胞、1×10¹⁰骨髓细胞和/或1×108骨髓间充质干细胞混匀，经肝门静脉移植入受体内，移植后第2和第5天肌肉注射环孢素A作预处理，移植后监测血糖、胰岛素等的变化。
移植物生存时间判断：移植后第1周每天受体小型猪耳缘静脉取血以微量血糖测定仪测血糖1次，从第2周开始隔日测1次血糖，连续2次血糖水平≥11.1 mmol/L，以第1次时间认为排斥反应发生，即细胞死亡，判断为移植物生存时间。
主要观察指标：细胞形态学观察、胰岛细胞获取量及细胞活率、移植物存活时间、动物模型血糖水平、动物模型血清胰岛素水平。
统计学分析：数据以x±s表示，采用SPSS 13.0进行方差分析，两独立样本均数t 检验，两两比较采用LSD法，生存分析用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

通过在受体内建立混合嵌合体诱导免疫耐受已成为胰岛移植领域诱导免疫耐受研究较多的方法之一。许多实验提示嵌合状态的形成是移植物存活的基础，多种动物模型实验也已证实诱导稳定的混合嵌合体能够形成终生的供体特异性耐受^[4]。

传统的骨髓细胞输注虽能在短期内达到混合嵌合状态,但很快随着嵌合率的下降,耐受状态难以维持。近年来也有许多研究者通过多次特异性输血或供体淋巴细胞输注的方法来达到更持久的嵌合状态，然而这样却增加了移植物抗宿主病的发生率，且对受体进行的各种预处理也带来了许多的临床风险^[5]。可以抑制异种胰岛移植大鼠的排斥反应^[6]。

最近研究发现骨髓间充质干细胞具有免疫调节和免疫抑制的特性^[7]，能通过调控调节性T细胞来发挥免疫调控作用^[8]。在混合淋巴细胞反应的初期或第3天，加入狒狒的骨髓间充质干细胞，能够抑制进行中的异基因混合淋巴细胞反应，使其增殖活性下降50%以上^[9]。许多实验室对上述骨髓间充质干细胞抑制淋巴细胞增殖反应的机制进行了广泛的研究，除细胞间的直接接触外^[10]，骨髓间充质干细胞还可能通过产生可容性细胞因子发挥其抑制作用^[11]。通过释放可溶性因子直或间接调控T细胞相关受体或配体在体内外均有调节作用^[12-13]。

骨髓间充质干细胞的免疫调节特性在动物移植免疫耐受的研究中已取得一定成果。邓为民等^[14]证实小鼠移植同基因骨髓细胞的同时输入异基因骨髓骨髓间充质干细胞可形成稳定的嵌合体，使供体源皮肤移植物长期存活，可以延长胰岛移植物的存活时间^[15-16]。本课题组前期研究也发现：骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注能有效的延长骨髓细胞诱导的移植免疫耐受，并较长时间维持胰岛移植物的正常功能。本实验通过骨髓细胞联合骨髓间充质干细胞输注的新方法进一步优化了胰岛移植免疫耐受的诱导方案，该实验为大动物实验，为今后人胰岛移植免疫耐受的诱导方案提供了宝贵的实验数据参考。

间充质干细胞诱导糖尿病小型猪同种异体胰岛移植的免疫耐受

Immune tolerance induced by bone marrow mesenchymal stem cells after islet allotransplantation in diabetic minipigs

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[3]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[4]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[5]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[6]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[7]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[8]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[9]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[10]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[11]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[12]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[13]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[14]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[15]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.