干细胞培育技术的研究与进展：创新、突破与高质量

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着干细胞基础研究和临床研究的开展，对干细胞的需求量在不断增加，但相对落后的干细胞培育技术，制约了干细胞研究的开展。

目的：对国内外开展的干细胞培育技术的改进和创新作一综述。

方法：在标题和摘要中，以“stem cells, induced pluripotent stem cells, cultivation, efficiency, reprogramming”或“干细胞，诱导多能干细胞，培育，效率，重编程”为检索词，检索中国期刊全文数据库(CNKI)、维普数据库、万方数据库和PubMed数据库中2005年1月至2014年11月关于干细胞培育技术的文章。同一领域文章则选择近期发表或发表在权威杂志上的文章。初检得到61篇文献，根据纳入标准，选择其中的39篇文献进行综述。

结果与结论：干细胞培育技术的进步和改进，有效地增加了干细胞的培育数量，提高了干细胞的培育质量，促进了干细胞基础及临床研究的开展。随着干细胞培育技术的进一步创新和突破性进展，高效地培育出高质量的干细胞将成为可能，人类疾病的干细胞移植试验的研究将得到极大的推动。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 诱导多能干细胞, 培育, 效率, 重编程

Abstract:

BACKGROUND: With the development of fundamental research and clinical research on stem cells, the quantity demanded for stem cells is on the increase, but the relatively out-dated cultivating technology of stem cells restrict the development of the research on stem cells.

OBJECTIVE: To review the improvement and innovation of stem cell culture techniques both at home and abroad.

METHDOS: In the title and abstract, “stem cells, induced pluripotent stem cells, cultivation, efficiency, reprogramming” in Chinese and English chosen as search terms were utilized to search for the papers related to stem cell culture techniques published from January 2005 to November 2014 in CNKI, VIP, Wanfang and PubMed databases, respectively. In the same field, articles published lately in the authoritative journals were preferred. Totally 61 articles were searched initially, and only 39 articles were included in result analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: The development and improvement of stem cell culture techniques effectively increase the culturing quantity of stem cells, improve the development of basic and clinical studies on stem cells. With the further innovation and breakthrough of stem cell culture techniques, it will be possible to efficiently culture high-quality stem cells, and the stem cell transplantation tests for human diseases will be promoted greatly.

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Key words: Stem Cells, Induced Pluripotent Stem Cells, Cell Culture Techniques

中图分类号:

R318

涂雪松. 干细胞培育技术的研究与进展：创新、突破与高质量[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1613-1618.

Tu Xue-song. Stem cell culture technology: innovation, breakthrough and high quality[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1613-1618.

图/表（结果） 1

2.1 通过改进和创新诱导多能干细胞培育技术，提高诱导多能干细胞的培育效率和质量 2006年，日本的Takahashi等^[1]首次通过导入4个干细胞转录因子，即OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC，将已分化的体细胞逆转为具有多项分化潜能的细胞。这种通过重编程得到的干细胞被命名为诱导多能干细胞。诱导多能干细胞诞生后，其培育机制的探讨及如何提高培育效率、降低培育风险，一直是学者们研究的重点。Yuan等^[4]认为，重编程主要是通过改变细胞的表观遗传学，将成体细胞转化为干细胞。现在大量研究已经证实，外源导入的干细胞特异性基因是通过在体细胞内引起广泛的染色质重塑，引起整个体细胞表观组的重编程。米格尔实验组会同中国深圳、香港及德国、英国多国科学家，对体细胞的重编程过程进行了研究。他们比较了在重编程过程中体细胞、重编程过程中的细胞、干细胞这3种细胞中RNA聚合酶Ⅱ的分布，结果发现：RNA 聚合酶Ⅱ参与了体细胞重编程过程的调控，但如何调控不清楚；RNA聚合酶Ⅱ在多能性基因上处于“暂停”的状态，是导致逆转效率低下的原因^[5]。诱导多能干细胞的培育效率低下，以及因诱导多能干细胞的基因不稳定带来的成瘤风险，已经成为诱导多能干细胞培育技术的瓶颈。为此，学者们进行了种种努力，创造了许多新的培育方法，有效地提高了诱导多能干细胞的培育效率，降低了诱导多能干细胞的培育风险。

2.1.1 通过减少导入的干细胞转录因子的数目，降低诱导多能干细胞培育的成瘤风险 Wu等^[6]尝试只用OCT4培育诱导多能干细胞获得成功，而且培育的诱导多能干细胞中未出现癌细胞。

2.1.2 通过Zscan4与Yamanaka因子共同使用，提高诱导多能干细胞的培育效率和质量中科院上海生命科学研究院的科学家发现^[7]，与单用Yamanaka因子相比，Zscan4与Yamanaka因子共同使用，显著增加了获得完全来自诱导多能干细胞小鼠的概率[58%(11/19):9% (1/11)]。该研究结果显示，Zscan4的加入，稳定了在重编程过程中细胞的基因，使诱导多能干细胞的质量得到了显著提高。研究者提出，Zscan4与Yamanaka因子共同使用，能提高诱导多能干细胞的培育效率和质量，主要因为Zscan4不仅能促进细胞端粒区与非端粒区遗传物质的稳定，而且能快速延长重编程细胞端粒的缘故。

2.1.3 通过抑制H3K9组蛋白，加速重编程过程，提高诱导多能干细胞的培育速度美国宾夕法尼亚大学Perelman医学院的Soufi等^[8]发现一种称为H3K9的组蛋白与诱导多能干细胞的重编程有关，如果在培养液中添加H3K9抑制剂阻断H3K9蛋白的生成，则可显著加快重编程过程。

2.1.4 通过提高c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2因子的表达，提高诱导多能干细胞的诱导效率美国麻省总医院、哈佛干细胞研究所Polo等^[9]通过全基因组分析检测了诱导多能干细胞的前体细胞，发现由诱导多能干细胞的前体细胞转化为诱导多能干细胞要经历两次转录波，分别由c-Myc/Klf4和Oct4/Sox2调控，如果没有这4个因子的参与，则无法完成由诱导多能干细胞前体细胞向诱导多能干细胞的转化；如果提高这4个因子的表达，不但可以完成诱导多能干细胞的诱导，而且可以提高诱导多能干细胞的诱导效率。

2.1.5 通过使Setdb1酶失活和使用H3K9去甲基化酶，培育出完全重编程的诱导多能干细胞科学家们发现，在培育诱导多能干细胞的过程中，经常会培育出一些在外观、生长速度等方面酷似诱导多能干细胞，但在基因表达和功能上与诱导多能干细胞完全不同的被称作“pre-iPSc”的干细胞。如果能找到“pre-iPSc”产生的原因，将其清除或转化为诱导多能干细胞，就可以提高诱导多能干细胞的培育速度和质量。中科院广州生物医药健康研究院的科学家发现^[10]：骨形态发生蛋白是在培育诱导多能干细胞过程中产生“pre-iPSc”的重要原因，骨形态发生蛋白通过调节H3K9的甲基转移酶阻碍诱导多能干细胞生成；Setdb1酶的活性高和H3K9的甲基化是使“pre-iPSc”难以转化为诱导多能干细胞的重要原因；通过使Setdb1酶失活和使用H3K9的去甲基化酶，可以使“pre-iPSc”在96 h内100%转化为诱导多能干细胞；维生素C加入培养液后能将“pre-iPSc”转化为诱导多能干细胞，是因为其含有H3K9去甲基化酶。

2.1.6 通过敲除体细胞中的Mbd3基因，提高重编程效率 Rais等^[11]发现，敲除小鼠体细胞中的Mbd3基因，然后对其进行培育，能显著提高诱导多能干细胞的诱导效率。

2.1.7 通过使用一种特殊的蛋白质，在无需滋养层细胞(Ff)及无需动物血清(Xf)的情况下，简单、高效、安全地培养出干细胞在干细胞的培育中，通常需使用含有实验鼠饲养细胞和胎牛血清培养液补充营养。Kanatsu-Shinohara等^[12]报道，在对精原干细胞进行无饲养层细胞培养时，必须加入血清才能保证精原干细胞生长、增殖。但动物血清的使用可能会增加培育过程中感染的风险。Hamra等^[13]报道，胎牛血清对精原干细胞的长期培养会造成负面影响，增加感染机会和导致其分化。因此，避免使用胎牛血清，成为未来干细胞培育的方向。日本京都大学诱导多能干细胞研究所的Nakagawa等^[14]应用一种无血清培养基StemFit^TM，同时使用一种Laminin-511 E8蛋白质，简单高效地培养出诱导多能干细胞，同时减少了培育过程中感染的风险。

2.1.8 通过在分子水平上调节磷酸化RNA聚合酶Ⅱ激酶的活性，显著提高体细胞重编程效率米格尔实验组与多国科学家在研究中发现，如果在分子水平调节磷酸化RNA聚合酶Ⅱ激酶的活性，促进其从“暂停”到“延伸”状态的转变，能显著提高体细胞重编程的效率^[15]。

2.2 通过“间接谱系转化(indirect lineage conversion, ILC)技术”，高效、安全地培育出干细胞

2.2.1 通过“间接谱系转化技术”，将成体细胞转化为特定谱系的干细胞，即分化潜能受限的干细胞，提高干细胞培育的速度和安全性 “直接谱系转化技术”是利用诱导多能干细胞技术，将体细胞转化为诱导多能干细胞，以后，诱导多能干细胞具有多项分化潜能，可以转化为任何谱系或类型的细胞。由于“直接谱系转化技术”培育干细胞的时间长(2个月左右)，诱导多能干细胞的基因不稳定有成瘤的风险，因此，逐渐地被“间接谱系转化技术”取代。“间接谱系转化技术”不是将体细胞转化为诱导多能干细胞，而是转化为只能向某一种类型细胞分化的干细胞，即特定谱系的祖细胞。因“间接谱系转化技术”培育出的干细胞分化潜能受限，且不经过诱导多能干细胞阶段，因此具有培育时间短，培育出的干细胞以后发生突变概率低的特点。“间接谱系转化技术”是由美国萨克生物医学研究所开发的。美国萨克生物医学研究所的Kurian等^[15]利用15 d就将人类的皮肤细胞转化为血管细胞的祖细胞。当这些血管细胞的祖细胞转化为血管内皮细胞和平滑肌的血管细胞时，研究者将这些血管细胞移植入小鼠体内。研究者发现，这些被移植的血管细胞融入小鼠的血管体系中。中科院广州生物医药与健康研究院的科学家们设计将人尿液细胞转化为诱导多能干细胞，却培育出了神经干细胞^[16]。科学家们使用的技术就是间接谱系转化技术。研究者将培育出的神经干细胞移植进动物模型脑内，发现这些神经干细胞分化为宿主的神经细胞，存活并融入宿主的细胞体系中。英国剑桥大学的Shi等^[17]经过重编程，将人皮肤细胞直接转化为大脑干细胞。大脑干细胞在实验室分化为皮质投射神经细胞。

2.2.2 通过向成纤维细胞导入3个基因，不经过诱导多能干细胞阶段，直接培育出血小板干细胞日本庆应大学医学系的Ono等^[18]向人和实验鼠皮肤成纤维细胞导入P45NFE2、MafG、Mafk基因，对其进行培养，结果发现，只需17 d成纤维细胞就转化为血小板细胞。成纤维细胞在转化为血小板细胞前，先转化为血小板干细胞，然后再由血小板干细胞分化为血小板细胞。由于采用“间接谱系转化技术”，没有经过诱导多能干细胞阶段，因此，培育时间短(经过诱导多能干细胞阶段需50多天)，培育出来的血小板细胞发生癌变的危险极小。

2.3 通过新的调控因子，提高成纤维细胞向神经干细胞转化的效率中科院动物研究所的焦建伟研究组在探索提高成纤维细胞向神经干细胞转分化效率方面，取得了突破。研究人员发现，孤核受体Rarg和Nr5a2可以极大的提高成纤维细胞到神经干细胞的转分化效率，并且转分化的时间缩短，由转分化的神经干细胞形成的神经元，其功能和成熟度均有不同程度的提高^[19]。

2.4 通过选用特殊支架和使用特定的生物反应器，增加培育的干细胞的增殖能力和多能性

2.4.1 选用2-(乙胺基)丙烯酸乙酯[2-(diethylamino) ethyl acrylate]做支架进行胚胎干细胞培育，增强胚胎干细胞的增殖能力和保持较长时间的多能性英国爱丁堡大学的Zhang等^[20]筛选出一种化合物，叫2-(乙胺基)丙烯酸乙酯[2-(diethylamino)ethyl acrylate]，发现用这种化合物作为支架对胚胎干细胞进行培养，胚胎干细胞不但可以黏附在上面生长，而且其增殖能力和多能性的保持可达2-6个月。

2.4.2 通过使用三维胶原支架，延长正在进行培育的神经干细胞的自我更新能力中科院遗传与生物学研究所的科学家们用三维胶原支架对神经干细胞进行神培养^[21]，结果发现，与用二维胶原支架对神经干细胞进行培养相比，前者培养的神经干细胞的bHLH转录因子hes和Id表达明显上调。bHLH转录因子hes和Id是维持和反映神经干细胞自我更新能力的因子。用三维胶原支架进行神经干细胞的培养，能明显延长神经干细胞的自我更新能力。研究者对三维胶原支架的这种作用机制进行了研究，发现在用三维胶原支架进行培养神经干细胞过程中，mTOR的抑制因子REDD1高表达，如果敲除REDD1，则提高神经干细胞转化为神经细胞的水平。研究者认为，通过激活REDD1抑制mTOR的活性，是三维胶原支架维持神经干细胞自我更新能力的作用机制。

2.4.3 通过在特定生物反应器中悬浮培养，大规模培养干细胞加拿大多伦多大学生物材料与生物医学工程研究所Fluri等^[22]的研究显示，如果将干细胞放在特定的生物反应器中悬浮培养，可以明显提高干细胞的培育速度，适合干细胞的大规模培养。

2.5 利用Sox2做诱导剂，快速、安全地培育出诱导性神经干细胞美国格拉德斯通研究所的Ring等^[23]将Sox2基因分别导入到人和小鼠的皮肤细胞中，结果发现，仅仅几天时间，人和小鼠的皮肤细胞就转化为诱导性神经干细胞，1个月内，这些诱导性神经干细胞分化为成熟的神经细胞(能传递电信号)并形成神经网络。与传统的用小分子和转录因子的组合来诱导皮肤细胞转化为神经干细胞相比，单用Sox2的诱导方法，神经干细胞的培育速度更快。由于不经历诱导多能干细胞阶段，所以单用Sox2诱导出来的神经干细胞未来发生肿瘤的可能性极低。

2.6 通过加入能激活干细胞受体的抗体，诱导出神经干细胞美国斯克里普斯研究所(TSRI)的Xie等^[24]通过筛选，找到了一种能激活骨髓干细胞特定受体的抗体，将其加入到体外培养的人骨髓干细胞中，发现培养皿中的细胞开始增殖，对这些细胞进行检测，证实其为神经前体细胞。研究者提出，这一研究成果为直接将这种抗体注入血液用于神经疾病的治疗提供了理论依据。

2.7 利用多种转录因子，直接将胚胎皮肤细胞转化为神经干细胞美国斯坦福医学院的Lujan等^[25]利用11种转录因子将胚胎小鼠皮肤细胞直接转化为神经前体细胞。随后，这些神经前体细胞转化为神经系统各类细胞如神经细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞。研究者发现，在这些转录因子中，FoxG1、Sox2和Brn2是起决定作用的转录因子。将这些神经系统细胞移植进小鼠脑内后发现，他们整合到宿主脑内，并产生出对神经冲动起重要作用的蛋白质。

2.8 通过“体细胞核转移”(SCNT），将成年体细胞转化为胚胎干细胞美国纽约干细胞基金研究所的Yamada等^[26]利用“体细胞核转移”，将成纤维细胞(皮肤细胞)转化为胚胎干细胞。

2.9 通过对一些关键信号通路调控因子的调控，将恒河猴皮肤细胞诱导成原始多潜能干细胞　北京大学生命科学学院邓宏魁研究组^[27]发现了一些关键信号通路的调控因子，通过对这些因子的调控，在国际上首次将恒河猴的皮肤细胞培育成“原始多潜能干细胞”。有学者称，这是继Yamanaka之后，干细胞培育领域一项重要突破。

2.10 通过控制活性氧的加入量，保持精原干细胞的增殖在精原干细胞的培育中，为抑制精原干细胞分化和保持其增殖能力，除了需加入胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子和干细胞因子、非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和β-巯基乙醇等外，还需加入活性氧。以往的研究表明，加入的活性氧过多，会降低精子功能，导致不育，Morimoto等^[28]在培养的小鼠精原干细胞中添加抑制活性氧功能的药物，结果发现，精原干细胞变得难以增殖，表明加入的活性氧不足同样会引发精原干细胞无法增殖。因此，在精原干细胞的培育中，只有控制活性氧的加入量，使其既不多也不少，才能保持精原干细胞的增殖。

2.11 通过使用包括抗肿瘤药物舒尼替尼在内的小分子化合物，抑制血管内皮生长因子受体(VEGFRs)，维持胚胎干细胞的自我更新并促进重编程中科院上海谢欣研究小组^[29]发现：即使在白血病抑制因子存在的条件下，小鼠胚胎干细胞还是很容易自发向中内胚层分化，并且分泌血管内皮生长因子。研究小组还发现抗肿瘤药物舒尼替尼可以通过抑制血管内皮生长因子受体有效防止胚胎干细胞的自发分化，并在无白血病抑制因子和滋养层细胞的条件下促进干细胞自我更新；缺氧诱导因子1α和内质网应激促进胚胎干细胞分泌血管内皮生长因子，而抑制这两条通路可以通过抑制血管内皮生长因子受体，维持干性。研究小组提出，胚胎干细胞存在一条自分泌血管内皮生长因子并诱导自发分化的通路，如果利用小分子化合物抑制该通路，可以有效维持干细胞的自我更新。

2.12 通过采用长时间低温冻存技术，对培育的干细胞进行长时间、高质量保存 Dariolli等^[30]对猪的脂肪间充质干细胞进行了长时间低温冻存，发现猪脂肪间充质干细胞在低温冻存3-12个月后，其增殖活性、核型、可塑性和正常衰老等指标与冻存前没有明显的差别，说明猪脂肪间充质干细胞进可以在体外长时间高质量保存。

2.13 通过使用Cdc42蛋白抑制剂，延缓造血干细胞的老化美国辛辛那提儿童医院医学中心的学者们发现通过使用Cdc42蛋白抑制剂，可以延缓造血干细胞的老化^[31]。

2.14 通过降低Oct4的表达，提高胚胎干细胞的自我更新能力英国爱丁堡大学的研究人员发现，如果降低Oct4的表达，则可促进胚胎干细胞的增殖水平^[32]。

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引言

材料方法

讨论

干细胞移植是未来人类治疗难治性疾病的出路和希望。为了达到这个目标，必须建立起高效、安全的干细胞培育技术体系，以大量培育出满足临床和研究需要的质量合格且成瘤性极小的干细胞。为了最大限度地提高干细胞的培育速度，人们进行了各种尝试。如Huangfu等^[33]使用组蛋白质去乙酰酶抑制剂VPA作为重编程因子后，可以使诱导多能干细胞的培育速度提高10-100倍；如Mali等^[34]通过使用Butyrate sodium，使诱导多能干细胞的培育速度提高50倍以上；Esteban等^[35]仅仅改变了细胞培养液的成分就使诱导多能干细胞的培育速度提高10-50倍。为了提高干细胞的培育质量，减少肿瘤的发生，人们也进行了探索。在转录因子方面，Oct4、Sox2、c-MYC、Klf4是最先开始使用的培育诱导多能干细胞的转录因子，但增殖率低，因此，学者们寻找其他方法，以提高效率。研究证明，增加转录因子的数目是一种办法。Mali等^[36]通过增加Sv40T将培育诱导多能干细胞的效率提高了10-100倍。外源性基因的插入会增加干细胞基因突变的机会，因此，在干细胞培育过程应当尽可能少的使用。c-MYC是一种能促进细胞增殖的原癌基因^[37]，但有致癌作用，在干细胞增殖培育的过程中尤其应当避免使用。Kim等^[38]尝试只使用Oct4做转录因子培育诱导多能干细胞获得成功。Wu等^[39]也成功地只用Oct4将小鼠胚外组织细胞逆转化为诱导多能干细胞。在载体方面，学者们尽量避免使用反转录病毒、慢病毒，如果必须要使用，也会在使用后设法将其切除。在干细胞培育过程中需要加动物血清、生长因子、抗生素、酶等物质，但这些东西可能会对干细胞的遗传稳定性和生物学特性产生不利影响。迄今为止，干细胞增殖的培育技术研究取得了很大的进展，但未解决的问题也不少。相信，在科技发展的推动下，在干细胞研究工作者的努力下，干细胞增殖的培育技术难题一定会得到解决，合格的干细胞一定会源源不断地培育出来。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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