中国组织工程研究

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1477-1481.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.001

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells •    下一篇

改良原代培养体系提高人脐带间充质干细胞的产量

高彦琳1，2，张宁坤2，陈厚良2，高连如2，朱智明2   

  1. 1安徽医科大学海军临床学院，北京市 100048；2解放军海军总医院，北京市 100048
  • 出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
  • 通讯作者: 朱智明，硕士，主任医师, 解放军海军总医院，北京市 100048
  • 作者简介:高彦琳，女，1989年生，安徽省宿州市人，汉族，安徽医科大学海军临床学院在读硕士，医师，主要从事干细胞治疗缺血性心肌病方面的研究工作。
  • 基金资助:

    国家自然科学基金面上项目(81170094)

Improved primary culture system increases the yield of human umbilical cord mesenchymal stem cells

Gao Yan-lin1, 2, Zhang Ning-kun2, Chen Hou-liang2, Gao Lian-ru2, Zhu Zhi-ming2   

  1. 1Clinical College of Navy Medicine, Anhui Medical University, Beijing 100048, China; 2Navy General Hospital, Beijing 100048, China
  • Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
  • Contact: Zhu Zhi-ming, Master, Chief physician, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
  • About author:Gao Yan-lin, Studying for master’s degree, Physician, Clinical College of Navy Medicine, Anhui Medical University, Beijing 100048, China; Navy General Hospital, Beijing 100048, China
  • Supported by:

    the National Natural Science Foundation of China, No. 81170094

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摘要：

背景：目前关于脐带间充质干细胞培养方法的研究很多，但尚无关于初次培养后废弃物的相关研究。

 
目的：探讨优化人脐带来源间充质干细胞体外培养的最佳方法。
方法：采用组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞，记为初次培养组。将原代培养瓶中的培养液及组织离心，重新分成组织组、混合组和纯液组进行再次培养。观察4组原代细胞的细胞形态、获得时间和细胞得率；MTT法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型。
结果与结论：初次培养组、再次培养组织组、再次培养混合组、再次培养纯液组获取细胞的平均时间分别为(15.00±0.45) d，(7.0±0.3) d，(8.00±0.25) d，(8.00±0.25) d。每个T75培养瓶可获取的第1代细胞数分别为(4.0±0.5)×105、(9.0±0.55)×105、(15.0±0.2)×105、(7.0±0.33)×105个。倒置显微镜下观察4组细胞为形态相对均一的梭形贴壁细胞，呈平行排列生长或漩涡状生长。4组细胞的生长曲线、增殖活性、表面标记物检测均无明显差异。结果表明对脐带间充质干细胞的原代培养体系进行再次培养，可在短时间内扩增出大量原代细胞。

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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程


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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 细胞培养, 华通胶, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, a lot of research about culture methods for umbilical cord mesenchymal stem cells, but not for the waste of primary system.

OBJECTIVE: To explore the best culture method of human umbilical cord mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were prepared by tissue explants method, recorded as initial culture group. The centrifugal fluid and tissue of the primary culture flask were centrifuged and divided into three groups for secondary culture: tissue group, mixed group and pure liquid group. Cell morphology, time for cell acquisition, and yield of primary cells in the four groups were observed; the cell growth curve was analyzed by MTT assay; and cell cycle and phenotype were detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: The average time for cell acquisition in the initial culture group, tissue group, mixed group and pure liquid group were (15.00±0.45), (7.0±0.3), (8.00±0.25) and (8.00±0.25) days, respectively. The number of cells at first generation was (4.0±0.5)×105, (9.0±0.55)×105, (15.0±0.2)×105 and (7.0±0.33)×105 per T75 culture bottle, respectively. Under the inverted microscope, cells in the four groups were fusiform-like adherent cells, which were in parallel or circinate arrangement. Growth curve, proliferative activity, surface markers of the four groups had no significant differences. The human umbilical cord mesenchymal stem cells can be obtained rapidly and largely through the secondary culture to the primary culture system.
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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程


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Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Cells, Cultured

中图分类号: 

本实验采用组织块培养法提取脐带中间充质干细胞。通常来讲组织块贴壁法是将小的组织块均匀铺于培养瓶底，原代细胞从组织块边缘爬出。虽然组织块贴壁法方便易行，操作简单，但存在原代细胞收获率低、培养周期长等问题[28-29]，难以适应组织工程对种子细胞的需要。本实验中初次培养组获取原代细胞的平均时间大约2周，获取细胞数量较少，符合组织块贴壁法培养的结果。一般传代结束后就会将培养原代细胞的组织和培养液丢弃。本实验是将废弃的组织和培养液离心后，分成组织组、混合组和纯液组进行再次培养，大约1周即可传代，且获取的细胞数为初次培养的2倍左右。相对于传统组织贴壁法，这种改进的方法可在较短时间内获得大量原代细胞。因此，对脐带间充质干细胞的原代培养体系进行再次培养，可以在短时间内扩增出大量原代细胞。
从文章结果中对于初次培养组和再次培养组织组、混合组、纯液组的比较可以推测：初次培养后组织块内细胞并未完全爬出；在初次培养的过程中可能形成了某些黏附物质和生长因子，能促进组织块贴壁和生长[30]；组织块再经过一轮培养后，纤维组织松解，细胞易于爬出；原代培养的培养液中可能存在一些散在细胞。本文仅是针对高效率扩增细胞进行研究，其进一步机制和原因有待于做深入研究。
综上所述，在传统组织块贴壁法的基础上进行再次贴壁培养，得到的脐带间充质干细胞在形态、生长曲线、增殖速率、免疫表型等方面与初次培养的细胞无明显差异。相对于传统组织贴壁法，这种再次培养的方法具有成本低、操作简单、易于短时间内获取大量原代细胞等优点，可以为再生医学提供足够的种子细胞。
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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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