脂肪干细胞诱导分化的现状及前景

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.026

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞是由中胚层发育而来的多能干细胞，在特殊的生长因子和环境等诱导培养条件下，可以向不同的谱系分化。
目的：详细阐述脂肪干细胞诱导分化的条件及鉴定方法。
方法：应用计算机检索万方数据库及PubMed数据库2005至2014年10年间的文献，中文检索词为“脂肪干细胞，诱导，分化”；英文检索词为“adipose derived stem cells，differentiation”。依据纳入排除标准选择37篇文献进行归纳总结。
结果与结论：脂肪干细胞在抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子β作用下可向软骨细胞分化；成脂诱导液的配方包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛；成骨分化常用的诱导剂包含地塞米松或维生素D3、抗坏血酸，β-甘油磷酸钠；碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及维生素B27可联合应用诱导脂肪干细胞成神经分化；向心肌细胞分化普遍应用的诱导因子是5-氮杂胞苷；血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共同作用可以诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化。随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展，脂肪干细胞的分化研究也会更加深入，在目前对脂肪干细胞诱导分化现象观察的基础上，应加强对其内在的分子机制及调控脂肪干细胞可塑性的基因和蛋白的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 诱导, 脂肪细胞, 软骨细胞, 骨细胞, 心肌细胞, 血管内皮细胞, 神经细胞

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are pluripotent stem cells developed from the mesoderm, which can differentiate into different lineages induced by specific growth factors and under certain environmental conditions.
OBJECTIVE: To describe the induced differentiation and identification of adipose-derived stem cells in detail.
METHODS: A computer-based search of Wanfang and PubMed databases was performed for relevant articles published from 2005 to 2014 using the keywords of “adipose derived stem cells, induced, differentiation” in Chinese and English, respectively. According to inclusion and exclusion criteria, 37 articles were selected in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells can differentiate into chondrocytes under the induction of ascorbic acid, insulin, dexamethasone, and transforming growth factor β. Recipe for adipogenic induction medium consists of 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), insulin, dexamethasone, indomethacin; and commonly used inducers for osteogenic differentiation include dexamethasone or vitamin D3, ascorbic acid, β-glycerophosphate. Basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor and vitamin B27 may be combined to induce the differentiation of adipose-derived stem cells into neurons. 5-Azacytidine acts as a commonly used factor for inducing the differentiation of adipose-derived stem cells into cardiomyocytes. Combination of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor can induce adipose-derived stem cells to differentiate into vascular endothelial cells. With the rapid development of molecular biology and cell biology, research on the differentiation of adipose-derived stem cells will be more in-depth. Based on the current observation of adipose-derived stem cell differentiation, internal molecular mechanism as well as genes and proteins for regulation of adipose-stem cell plasticity should be explored in depth.

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Key words: Stem Cells, Cell Differentiation, Adipocytes, Adult Stem Cells

中图分类号:

R318

赵娜. 脂肪干细胞诱导分化的现状及前景[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 969-975.

Zhao Na. Induced differentiation of adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 969-975.

图/表（结果） 1

2.1 脂肪干细胞向脂肪细胞诱导分化及鉴定脂肪细胞再生为乳房切除后的修复、软组织缺损重建、脂肪营养不良及美容方面的软组织充填提供了新的途径，而脂肪干细胞能在多种因素的诱导下分化为脂肪细胞，且与其他组织来源的干细胞相比，脂肪干细胞具有更好的定向脂肪细胞分化的潜能，可能成为整形外科组织工程生物填充材料首选的种子细胞^[4]。

目前常用的成脂诱导液配方包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯脂酶抑制因子，可上调AMP循环水平)，胰岛素、地塞米松、吲哚美辛(表1)。黄宏等^[5]自成年雄性小香猪腹部皮下脂肪中分离培养得到脂肪干细胞，取第3代细胞进行诱导，应用成脂诱导剂(体积分数10%胎牛血清+1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L胰岛素+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L IBMX+DMEM/ F12培养基)诱导3 d，然后换基础培养基(体积分数10%胎牛血清+10 μmol/L胰岛素+DMEM/F12培养基)诱导3 d，如此3个循环后，成功将脂肪干细胞诱导为脂肪细胞。还有研究认为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)及骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP-4)也能诱导脂肪干细胞的成脂分化^[6]，但血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是否具有相同的作用还有争议。

脂肪干细胞诱导为脂肪细胞的鉴定一般用油红O染色，油红为脂肪染色剂，易溶于脂质，染后脂质呈红色，细胞核呈淡蓝色(图3A)。油红O染色步骤简便，染色结果肯定，但其染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相。因过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ是脂肪细胞特异性核转录因子，对脂肪细胞的分化起关键作用，故也有研究用免疫组织化学或RT-PCR检测PPARγ水平验证成脂分化潜能。

2.2 脂肪干细胞向骨细胞诱导分化及鉴定张荣耀等^[7]研究显示，与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞更易向

成骨分化，这种作用可能与Notch信号的相关蛋白表达水平有关。目前已经广泛应用的成骨诱导液配方包括地塞米松或1，25-二羟基维生素D3、抗坏血酸，β-甘油磷酸钠(表1)，常用的剂量地塞米松为0.1 μmol/L，抗坏血酸为50 μmol/L，β-甘油磷酸钠为10 mmol/L，联合诱导两三周脂肪干细胞可分化为骨细胞。据报道雌激素、骨形态发生蛋白能促进脂肪干细胞向骨细胞分化，成纤维细胞生长因子对脂肪干细胞成骨分化的影响还有待进一步研究，脂肪干细胞来源于人或动物可能导致干预结果相反。

成骨诱导后的鉴定：①碱性磷酸酶(ALP)检测：碱性磷酸酶是成骨细胞的特异性标志性酶，经Gomori钙钴法染色，胞质中呈现灰黑色颗粒或块状沉淀即为碱性磷酸酶颗粒，是阳性反应；还可用碱性磷酸酶染色试剂盒检测碱性磷酸酶活性，进行定量检测。②茜素红染色：是特异的钙盐染色方法，利用沉积的钙与茜素红发生显色反应，矿化结节呈现红色的效果。③von Kossa法染色：是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银，阳性反应时出现钙化结节(图3B)。

2.3 脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化及鉴定 Afizah等^[8]研究认为，脂肪干细胞的成软骨能力很弱；安荣泽等^[9]也得到了相似的结果，他们比较了脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞的成软骨能力，发现骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的潜能更高。但也有学者提出了不同的看法，Rebelatto等^[10]认为两种干细胞的成软骨能力基本一致，而余方圆等^[11]则认为成软骨分化时脂肪干细胞较骨髓间充质干细胞更为敏感。因此，脂肪干细胞是否适合作为软骨组织工程的理想种子细胞还有待更深入的研究。

当前促进脂肪干细胞向软骨细胞分化的方法有软骨细胞共培养法、外源性生长因子诱导液培养法及基因修饰等，这几种方法比较诱导液培养法诱导效果更好一些。外源性生长因子诱导有仅用一种生长因子诱导的单一诱导，以及用2种或2种以上生长因子的联合诱导。单一诱导常用的生长因子有转化生长因子β、骨形态发生蛋白2，6，7，14等；联合诱导种常用的配方有抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子β等(表1)，也有学者认为联合应用转化生长因子β和骨形态发生蛋白6能提高脂肪干细胞的成软骨潜能^[12]。

成软骨诱导后的鉴定：①甲苯胺蓝染色：是软骨的特异性染色，细胞核染成蓝色，软骨染成紫(红)色(图3C)。②Ⅱ型胶原免疫组化染色：关节软骨的胶原主要是Ⅱ型胶原，所以Ⅱ型胶原免疫组化染色能特异性鉴定软骨细胞，阳性反应是软骨细胞的胞浆被染成棕黄色，胞核不着色。

2.4 脂肪干细胞向神经细胞诱导分化及鉴定应用因子诱导脂肪干细胞向神经细胞分化的研究很多。Wragc等^[13]采用分步法诱导脂肪干细胞，首先加入10 μg/L表皮生长因子(EGF)、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)； 3 d后加入120 μmol/L吲哚美辛、3 mg/L胰岛素、 300 μmol/L IBMX，得到了神经样细胞。应诚诚等^[14]在Wragc等实验的基础上进行了改良，除了加EGF和bFGF外还添加了脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，诱导后神经细胞荧光染色胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、β-微管蛋白(β-tubulin)Ⅲ蛋白表达阳性率分别为(74.0±3.3)%、(65.3±2.1)%。Zhang 等^[15]比较了同一大鼠的脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的能力，结果发现诱导后脂肪干细胞的神经元和神经胶质标志物的表达更高。

成神经诱导后的鉴定：①Nestin免疫组化染色：巢蛋白(Nestin)是一个神经元标记，可以验证最原始的神经上皮，是神经干细胞标记物。②β-微管蛋白Ⅲ免疫组化染色：是神经细胞的特异性微管蛋白,已被认为是神经元早期发育的标志。③GFAP免疫组化染色：胶质纤维酸性蛋白主要存在于星形细胞内，是神经胶质标志物。以上3种标志物均可进行免疫荧光检测。

2.5 脂肪干细胞向心肌细胞诱导分化及鉴定已经证实5-氮胞苷(5-azacytidine，5-AZA)可诱导脂肪干细胞向心肌细胞分化，诱导后能表达心肌特异性的肌动蛋白和肌钙蛋白^[16]。Carvalho 等^[17]用含5-氮杂胞苷的培养基培养脂肪干细胞，在所有的分化细胞中均检测到了横纹肌肌动蛋白和连接蛋白43 的表达。王晓明等^[18]用5-氮杂胞苷分别诱导心包部位和腹股沟部位脂肪组织来源干细胞，结果显示心包来源脂肪干细胞的心肌分化能力大于腹股沟来源细胞(53%与32%，P < 0.01)，心包部位的脂肪干细胞在转录因子和cTnT表达方面体现出较强的心肌分化潜能。

虽然在很多的研究中5-氮杂胞苷都成功诱导了脂肪干细胞向心肌细胞的分化，但其诱导作用仍存在争议，对来源于人的脂肪干细胞是否有效尚缺乏足够的证据，单纯的5-氮杂胞苷的诱导分化为心肌细胞的作用是否足够？其对脂肪干细胞的分化有没有传代限制性^[19]？而且5-氮杂胞苷得诱导条件(药物浓度、诱导时间等)还没有一个统一的标准，因此很多学者对脂肪干细胞的心肌分化做了有益的探索。Gwak 等^[20]认为转化生长因子β1有诱导脂肪干细胞心肌化的能力；张琰琴^[21]发现中药地黄多糖能提高5-氮胞苷诱导脂肪干细胞向心肌细胞的转化率；另外，血管内皮生长因子、干扰素3、干扰素6、干细胞因子(SCF)也能诱导脂肪干细胞向心肌细胞分化。近些年心肌细胞提取液诱导法及与心肌细胞共培养法也成为脂肪干细胞心肌分化的新方向^[19^，^22]。

成心肌细胞诱导后的鉴定：诱导后细胞失去脂肪干细胞梭形的形态，应符合心肌细胞形态(图3D)；可以用免疫细胞化学法检测心肌细胞特异性标志，包括心肌特异性肌钙蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)、MLC-2v、GATA-4、α-重链肌球蛋白及β-重链肌球蛋白、横纹肌肌动蛋白、缝隙连接蛋白43等的表达，也可用RT-PCR方法检测心肌细胞的特异性基因^[23]。

2.6 脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化及鉴定血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共同作用可以诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化。刘琳等^[24]分离培养兔脂肪干细胞，用血管内皮细胞诱导液(M199培养液+50 μg/L 血管内皮细胞生长因子+10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子与体积分数10%胎牛血清)诱导21 d，显微镜细胞下呈铺路石样形态，血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原染色阳性，透射电镜下可见W-P小体，说明兔脂肪干细胞在体外可诱导分化为血管内皮细胞。周虹等^[25]用血管内皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子将人脂肪间充质干细胞体外向内皮细胞诱导分化后的细胞作为种子细胞，种植于脱细胞猪主动脉瓣膜成功构建了组织工程心脏瓣膜。

成血管内皮细胞诱导后的鉴定：诱导后细胞应呈典型的铺路石样形态(图3E)；检测内皮细胞特异性标记CD31及Ⅷ因子阳性表达Fischer，透射电镜下，部分细胞内可见W-P小体(血管内皮细胞特有的细胞器，图3F)^[24]；成血管内皮细胞诱导后应有吞噬乙酰化的低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)及在Matrigel 上形成小管样结构的能力，即血管内皮细胞功能的特异实验Dil-Ac-LDL吞噬实验与Matrigel小管形成实验阳性。

2.7 脂肪干细胞向其他细胞诱导分化及鉴定

向胰岛细胞诱导分化及鉴定：杨光等^[27]用高糖DMEM(25 mmol/L)、碱性成纤维细胞生长因子和尼克酰胺共同诱导脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化，并通过双硫腙染色及细胞胰岛素染色证实了诱导的胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。诱导后的鉴定可采用免疫细胞化学染色表明细胞内含有免疫活性胰岛素，也可用RT-PCR检测胰岛β细胞的细胞标志，或者进行培养上清液的胰岛素蛋白定量测定。

向肝样细胞诱导分化及鉴定：脂肪干细胞向肝样细胞分化的主要诱导因子为肝细胞生长因子(HGF)，其他一些细胞因子，如制瘤素M(OSM)、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子(SCF)等也能起到一定的诱导作用^[28]。诱导后的肝样细胞的功能性特征鉴定：过碘酸-雪夫染色(PAS染色)检测细胞内糖原储存；免疫细胞化学染色和RT-PCR分析肝样细胞内白蛋白(ALB)的表达。

向表皮细胞诱导分化及鉴定：李强等^[29]用的表皮细胞诱导培养基包括表皮细胞生长因子(EGF)、全反式维A酸(ATRA)、纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、谷氨酰胺等，他们将人脂肪干细胞用此诱导液诱导8 d，观察到部分细胞角蛋白呈阳性表达，证实脂肪干细胞在体外有分化为表皮细胞的可能性。

还有研究发现脂肪干细胞在特定环境下有向平滑肌细胞、尿路上皮细胞、淋巴管细胞、内耳毛细胞、角膜细胞、类髓核细胞、精子细胞分化的潜能^[30-35]，更深层次的研究正在进行。

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引言

材料方法

1 资料和方法 Data and methods

1.1 资料来源

检索人及检索时间：本文的资料检索是由作者应用计算机在2014年11月进行。

检索文献时限：近10年的文献(2005至2014年)。

检索数据库：万方数据库(网址http://med. wanfangdata.com.cn/)及PubMed数据库(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/pubmed/)。

检索词：中文检索词为“脂肪干细胞，诱导，分化”；英文检索词为“adipose derived stem cells，differentiation”。

检索文献类型：纳入研究原著类文献(主要是基础研究)，不纳入综述、Meta分析、病例报告及会议论文。

检索文献量：共检索得到1 908篇文献，其中万方数据库检索得到769篇中文文献，在PubMed数据库检索得到1 139篇英文文献。

1.2 入选标准

纳入标准：①脂肪干细胞体外诱导分化相关的基础研究，无论脂肪干细胞的来源是动物还是人均纳入。②脂肪干细胞培养条件研究的相关报道。③重复研究中纳入比较典型有代表性且发表在权威杂志的文献，并选择较新的文献。

排除标准：①综述、述评、Meta分析类文献。②仅介绍脂肪干细胞分离培养及生物学特性的文献。③脂肪干细胞的应用研究，无论是临床试验报道还是动物体内实验均不纳入。④会议文献及重复研究。

1.3 资料提取方法 检索共得到1 908篇文献，排除综述、述评及Meta分析类文献348篇、再根据文题筛除与本文内容不相关的文献878篇，剩余682篇文献查看摘要，去除重复文献，筛选设计严谨、有代表意义的文献63篇进一步查阅全文，最后纳入35篇权威杂志或近期发表的、资料完整的文献进行综述，具体流程见图2。

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