依达拉奉联合神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.024

摘要/Abstract

摘要：

背景：依达拉奉是一种自由基清除药，可以减轻受损神经组织水肿和改善脊髓损伤区微环境。
目的：观察依达拉奉联合神经干细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤的修复效果。
方法：成年雌性SD大鼠80只，建立胸9脊髓全横断损伤模型，随机分为4组：对照组不做处理；依达拉奉组脊髓损伤后6 h经尾静脉注射依达拉奉；神经干细胞移植组脊髓损伤后6 h脊髓损伤区域注入神经干细胞悬液；依达拉奉+细胞移植组脊髓损伤后6 h神经干细胞移植的同时尾静脉注射依达拉奉。
结果与结论：造模后8周可观察到PKH-26标记的神经干细胞在体内存活并在脊髓内迁移；细胞移植组和依达拉奉联+细胞移植组可见少量连续性神经纤维通过损伤区。荧光金逆行脊髓追踪显示神经干细胞移植组和依达拉奉+细胞移植组可见被荧光金标记的神经锥体细胞穿越损伤区。PKH-26标记的阳性细胞数及荧光金阳性神经纤维数：依达拉奉+细胞移植组最多，依达拉奉组、神经干细胞移植组次之，对照组最少，各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)；后肢功能运动BBB评分依次为依达拉奉+细胞移植组>神经干细胞移植组>依达拉奉组>对照组。提示依达拉奉能促进神经干细胞在损伤区的存活并向神经细胞分化，依达拉奉联合神经干细胞移植有促进细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 脊髓损伤, 神经干细胞, 移植, 依达拉奉, 修复, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Edaravone is a kind of free radical scavenging drug, which can reduce the edema of the damaged nerve tissue and improve the microenvironment of spinal cord injury areas.
OBJECTIVE: To observe the effects of edaravone combined with neural stem cell transplantation in the treatment of spinal cord injury in rats.
METHODS: A total of 80 Sprague-Dawley rats were used to establish the T9 spinal cord transaction models, and the models were randomly divided into four groups (n=20), namely the control group, edaravone group, neural stem cells transplantation group and neural stem cell transplantation + edaravone group. The models in the control group received no treatment; models in the edaravone group were injected with edaravone via tail vein at 6 hours after spinal cord injury; models in the neural stem cell transplantation group were injected with neural stem cell suspension in the spinal cord injury area at 6 hours after spinal cord injury; models in the neural stem cell transplantation + edaravone group were injected with neural stem cells and edaravone via tail vein at 6 hours after spinal cord injury.
RESULTS AND CONCLUSION: PKH-26-labeled neural stem cells survived and migrated toward the spinal cord at 8 weeks postoperatively; a small amount of continous nerve fibers migrated across the injury site in the neural stem cell transplantation group and neural stem cell transplantation + edaravone group. Fluorogold retrograde spinal cord tracing showed the fluorogold-labeled pyramidal cells migrated across the injury site in the neural stem cell transplantation group and neural stem cell transplantation + edaravone group. The number of fluorogold- labeled nerve fibers and PKH-26 positive cells was largest in the neural stem cell transplantation + edaravone group, greater in the edaravone group but little in the control group, and there was significant difference between groups (P < 0.05). The BBB scores of the hind limb motor function: neural stem cells transplantation + edaravone group > neural stem cell transplantation group > edaravone group > control group. Edaravone can promote the survival of neural stem cells and their differentiation into neural cells at the injury site. Edaravone combined with neural stem cell transplantation can promote the repair of spinal cord injury in rats.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, spinal cord injury, neural stem cells, transplantation, edaravone, repair, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R318

赵志军，孙智敏，张春阳，韩建国，石瑞成，王伟志. 依达拉奉联合神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1862-1867.

Zhao Zhi-jun, Sun Zhi-min, Zhang Chun-yang, Han Jian-guo, Shi Rui-cheng, Wang Wei-zhi. Edaravone combined with neural stem cell transplantation for treatment of spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(10): 1862-1867.

图/表（结果） 10

2.1 神经干细胞形态 脑组织单细胞悬液接种于培养瓶后1 h，大部分细胞沉积瓶底，圆形，无突起。同时可以观察到一些小的细胞团，细胞团的细胞数量较少。1 d后，神经干细胞团增多，较小，形状不规则。小部分细胞团贴壁。5 d后，神经干细胞球增多，较大，形状规则，成球形，见图1。

2.2 BBB评分结果 造模前所有实验大鼠双后肢BBB 评分均为21分，造模后所有大鼠均呈现双后肢瘫痪，所有大鼠切口均愈合良好袁无感染，缝线在3周后脱落。共有5 只大鼠死亡(对照组于第1，2周各死亡1 只；依达拉奉组第1，3周各死亡1 只；神经干细胞移植组第1周死亡1 只；死因均为血尿或膀胱破裂)。造模后3 d内BBB评分均为0分。造模后第2周，4组大鼠后肢运动均出现不同程度的恢复。造模后第4周，各组大鼠后肢运动功能恢复较快，其中依达拉奉+细胞移植组优于依达拉奉组和神经干细胞移植组，开始出现后肢部分承重，并且后肢爪的功能出现不同程度的恢复，差异有显著意义(P < 0.05)，明显优于对照组差异有显著性意义(P < 0.01)。造模后6周，依达拉奉组、神经干细胞移植组、依达拉奉+细胞移植组大鼠后肢运动功能恢复进入平台期。8周末，依达拉奉+细胞移植组大鼠前后肢步态协调有规律，脚掌呈负重位，但无法支撑躯体抬离桌面；神经干细胞移植组和依达拉奉组前后肢步态协调欠佳，两组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 荧光显微镜观察结果 脊髓损伤后8周，神经干细胞移植组、依达拉奉+细胞移植组切片中均可见散在的PKH26染色阳性的红色荧光：对照组，依达拉奉组，神经干细胞组，依达拉奉+细胞移植组分别为0，0，(31.58± 7.64)，(68.62±9.44)个/高倍视野。神经干细胞组(P < 0.05)和依达拉奉+细胞移植组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。见图2-5。

2.4 FG皮质脊髓束逆行追踪结果 对照组脊髓损伤区头侧FG标记的锥体细胞和轴突数(9.6±2.1)个，见图6。

依达拉奉组、神经干细胞组及依达拉奉+细胞移植组脊髓损伤区头侧FG标记的锥体细胞和轴突数分别为(24.6±3.6)，(29.4±4.0)，(42.6±5.1)个，见图7-9，与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05，0.01)。

参考文献

[1] Weaver LC, Dekaban GA, Brown A. Anti-CD11d monoclonal antibody treatment for rat spinal cord compression injury.Experimental Neurology.2012;233(2):606-611.

[2] Carter LM, McMahon SB, Bradbury EJ. Bradbury. Delayed treatment with Chondroitinase ABC reverses chronic atrophy of rubrospinal neurons following spinal cord injury. Experimental Neurology.2011;228(1):149-156.

[3] Duchossoy Y, David S, Baulieu EE, et al. Treatment of experimental spinal cord injury with 3β-methoxy- pregnenolone. Brain Research.2011;1403:57-66.

[4] Morizane K, Ogata T, Morino T, et al. A novel thermoelectric cooling device using Peltier modules for inducing local hypothermia of the spinal cord: The effect of local electrically controlled cooling for the treatment of spinal cord injuries in conscious rats. Neurosci Res. 2012;72(3):279-282

[5] Yang JD,Li GF,Wang JC,et al.Zhonghua Shiyong Zhenduan yu Zhiliao Zazhi. 2011,25(10):979-980,983. 杨建东,李广峰,王静成,等.甲泼尼龙对脊髓损伤大鼠氧自由基的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2011,25(10):979-980,983.

[6] Sun YM,Wang QP,Lin FG,et al.Zhonghua Wuli Yixue yu Kangfu Zazhi. 2010,9:654-656. 孙永明,王庆鹏,林凡国,等.高压氧治疗大鼠脊髓损伤的疗效及其对脂质过氧化反应的影响[J].中华物理医学与康复杂志, 2010,9: 654-656.

[7] He S,Zhang WQ,Zhu J,et al.Changchun Zhongyiyao Daxue Xuebao.2010;26(3):332-333. 何爽,张万强,朱嘉,等.髓复康对恒河猴脊髓半横断损伤后自由基变化的调节作用[J].长春中医药大学学报,2010, 26(3):332-333.

[8] Wang Q, Chen Q, Ding Q, et al. Sevoflurane Postconditioning Attenuates Spinal Cord Reperfusion Injury Through Free Radicals-Mediated Up-Regulation of Antioxidant Enzymes in Rabbits. J Surg Res. 2011;169(2):292-300.

[9] Liu S, Qu Y, Stewart TJ, et al. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(11):6126-6131.

[10] Blits B, Kitay BM, Farahvar A, et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 2005;23(5-6):313-324.

[11] Mura M, Toyama Y, Okano H. Transplantation of neural stem cells for spinal cord injury. Rinsho Shinkeigaku. 2005;45(11): 874-876.

[12] Kamei N, Oishi Y, Tanaka N, et al. Neural progenitor cells promote corticospinal axon growth in organotypic co-cultures. Neuroreport.2004;15(17):2579-2583.

[13] Dasari VR, Spomar DG, Gondi CS, et al. Axonal remyelination by cord blood stem cells after spinal cord injury. J Neurotrauma. 2007;24(2):391-410.

[14] Uji Y, Yamamoto H, Mori T, Akabori H, et al.Edaravone improves the survival of rats subjected to hemorrhagic shock without resuscitation. Surgery Today. 2008;38( 5): 476-477.

[15] Hisano K, Watanabe M, Morimoto Y. Protective effects of the free radical scavenger edaravone against glutamate neurotoxicity in nearly pure neuronal culture. J Anesth. 2009; 23(3):363-369.

[16] Ye R, Kong X, Yang Q, et al.Ginsenoside Rd in Experimental Stroke: Superior Neuroprotective Efficacy with a Wide Therapeutic Window.Neurotherapeutics.2011;8(3):515-525.

[17] Ono H, Nishijima Y, Adachi N, et al. Open AccessImproved brain MRI indices in the acute brain stem infarct sites treated with hydroxyl radical scavengers, Edaravone and hydrogen, as compared to Edaravone alone. Med Gas Res.2011;1(1): 12.

[18] Wang D, Zhang JJ, Yang ZX. Treatment of spinal cord injury by transplanting neural stem cells with NgR gene silencing. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 2010;22(1): 28-31.

[19] Lü HZ, Hu JG. Expression of bone morphogenetic proteins-2/4 in neural stem cells and their lineages. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2009;69(4):441-447.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2011年3至11月在包头医学院完成。
材料：
实验动物：胎龄为14 d的SD胎鼠10只；健康清洁级雌性SD大鼠80只，鼠龄10周龄，体质量250-300 g，均由包头医学院动物研究中心提供，动物质量合格证号：SCXK(蒙)20050003。
主要试剂：
Main reagents:

实验方法：
神经干细胞的培养和鉴定：取孕14-16 d的SD大鼠1只，引颈处死，体积分数为75%的乙醇浸泡消毒，剖腹取出胎鼠(10只)。取胎鼠大脑，去除脑膜和血管，浸泡在DMEM/F12液中，用吸管反复吹打成悬液，过100目孔筛网，接种培养瓶中，加表皮生长因子10 mg/L，碱性成纤维细胞生长因子10 mg/L，N2添加剂，置于37 ℃、体积分数5%CO₂孵育箱中培养。神经干细胞纯度鉴定：神经上皮干细胞蛋白≥70%、神经胶质酸性蛋白≤10%、神经丝微管蛋白≤10%，可以进行下一步实验。
PKH-26标记神经干细胞：胰酶和/或EDTA消化神经干细胞形成单细胞悬液。2×10⁷细胞于锥形离心管中，用无血清培养基洗1次；离心5 min；弃上清，加1 mL稀释液C，重悬细胞保证完全离散，别震荡。染色前，准备 4×10⁶mol/L 的PKH 26染液(用稀释液C稀释)置于离心管中。加1 mL 2 × 细胞到1 mL 2 ×染料，立即用吸管均匀快速混合样品，25 ℃孵育的2-5 min，定时轻轻颠倒离心管保证在25 ℃充分混匀。加入等量血清或1% BSA中止染色反应，孵育1 min。用等量含血清培养基稀释中止的反应液。400×g、25 ℃离心10 min，弃上清。细胞团转入新试管中，进一步洗3次。加10 mL完全培养基，离心，重新悬置细胞。
脊髓损伤模型的制作和分组：80 只大鼠以体积分数10%水合氯醛300 mg/kg 腹腔注射，麻醉成功后将大鼠俯卧固定于动物手术台上，常规消毒后在无菌条件下，以T₁₀为中心取背部正中切口，手术切除T₉-T₁₁椎板，暴露脊髓，改良Allen法制模。脊髓损伤动物模型随机分为对照组(n=20)：不做处理；依达拉奉组(n=20)：脊髓损伤后6 h经尾静脉注射依达拉奉3 mg/kg，连续1周；神经干细胞移植组(n=20)：脊髓损伤后6 h显露出脊髓损伤区域，微量注射器自损伤处头尾两端向损伤处刺入，分别缓慢注入10 μL 1×10¹⁰L^-1细胞悬液，3 min内注射完后留针5 min并用医用生物胶封闭针孔以防止细胞悬液顺针道外溢，逐层缝合伤口；依达拉奉+细胞移植组(n=20)：脊髓损伤后6 h神经干细胞移植的同时经尾静脉注射依达拉奉3 mg/kg，连续1周。造模后每天腹腔注射青霉素3×10⁴ U/kg×2次，共7 d；每天膀胱按压辅助排尿2次，至排尿反射恢复约2周时间。
后肢运动功能BBB(Basso Beattie Bresnahan)评分：所有脊髓损伤大鼠分别在造模后1，3 d及1，2，4，6，8周最后1 d，在固定的、较开放的环境下，对实验大鼠术后活动进行拍照和录像，根据后肢体位、活动方式、活动范围等做BBB功能评分。BBB评分是一项针对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的评分标准。其主要参照指标是后肢、尾部和下部躯干的活动范围和协调性。没有运动功能为0分，完全正常为21分。可以间接反映脊髓损伤的恢复情况。实验评分采用双盲、双人独立评估，由熟悉BBB评分标准的两位非实验人员独自完成，取两者评分结果的平均值作为最后BBB评分的结果，尽量减少评分误差。
荧光显微镜观察：脊髓损伤后8周随机取4组各4只大鼠，取材行伤处组织学检查以证实损伤程度。脊髓损伤处取材行组织学检查，40 g/L多聚甲醛固定，行常规冰冻切片，对组织切片进行荧光显微镜观察。每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野的PKH26 阳性细胞数，取其均值作为每组PKH26阳性细胞数。
大鼠坐骨神经荧光金逆行追踪：脊髓损伤后7周，随机取4组各4只大鼠，麻醉后沿股外侧肌间隙显露坐骨神经，通过组织钳钳夹挫伤坐骨神经，在避光条件下使用微量注射器在坐骨神经挫伤区多点注射2%荧光金，每侧坐骨神经注射0.4 μL，注射速度为0.1 μL/min。每注射位点留针5 min，切口内撒8×10⁴ U的青霉素粉剂，逐层缝合切口，造模后正常饲养。1周后予脊髓损伤处取材行组织学检查。置于30%蔗糖中4 ℃冰箱过夜保存，次日于-18 ℃以OCT冰冻切片包埋剂包埋后作20 μm 厚横断面及冠状面冰冻切片遥每组每只动物取5张切片，荧光显微镜下观察荧光金标记细胞的分布情况。
主要观察指标：①神经干细胞形态。②BBB评分结果。③荧光显微镜观察结果。④FG皮质脊髓束逆行追踪结果。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行分析，实验数据以x(_)±s表示，采用重复测量方差分析，组间多重比较使用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经干细胞移植给脊髓损伤治疗带来了新的希望，但单纯神经干细胞移植对受损脊髓组织的修复并不理想，为进一步提高移植细胞在体内存活、增殖及定向分化为神经元的比例，必须进一步改善脊髓损伤区的微环境^[18-19]。

依达拉奉是一种自由基清除药，可通过清除自由基、抑制脂质过氧化，从而抑制神经细胞、血管内皮细胞的氧化损伤，起到减轻受损神经组织水肿和改善脊髓损伤区微环境的作用。实验将依达拉奉联合神经干细胞移植应用于大鼠脊髓损伤的治疗，结果表明：PKH26阳性细胞、FG阳性神经纤维数神经干细胞组、依达拉奉组及依达拉奉+细胞移植组与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05，0.01)。细胞移植8周后，在损伤脊髓节段仍可检测到PKH26阳性细胞，表明移植后的神经干细胞可以较长时间地在脊髓损伤部位存活和迁移。这与移植8周后肢运动功能BBB评分结果相印证，即依达拉奉+细胞移植组优于神经干细胞组和依达拉奉组(P < 0.05)，明显优于对照组(P < 0.01)。结果说明移植的神经干细胞可以在宿体内存活、迁移形成新生的神经纤维。而联合依达拉奉尾静脉注射能促进细胞移植后在宿体内存活并向神经细胞分化的效果。

作者贡献：设计、实施、评估为本文作者。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。