血竭提取物促进成纤维细胞增殖及胶原分泌

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.46.012

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (46): 7437-7441.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.46.012

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

血竭提取物促进成纤维细胞增殖及胶原分泌

李丹¹，惠瑞²，胡永武³，韩岩¹，郭树忠⁴

¹解放军总医院整形修复科，北京市 100853；²解放军海军总医院神经外科，北京市 100048；解放军第四军医大学附属西京医院，³药剂科，⁴整形外科，陕西省西安市 710032

修回日期:2014-10-19 出版日期:2014-11-12 发布日期:2014-11-12
通讯作者: 郭树忠，博士，主任医师，解放军第四军医大学附属西京医院整形外科，陕西省西安市 710032 韩岩，解放军总医院整形修复科，北京市 100853
作者简介:李丹，女，汉族，2009年北京协和医学院毕业，博士，主治医师，主要从事创面愈合、皮瓣显微外科方面的研究。

Effects of Dragon’s blood extracts on fibroblast proliferation and procollagen type III

Li Dan¹, Hui Rui², Hu Yong-wu³, Han Yan¹, Guo Shu-zhong⁴

¹Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; ²Department of Neurosurgery, Navy General Hospital of PLA, Beijing 100048, China; ³Department of Pharmacy, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; ⁴Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Revised:2014-10-19 Online:2014-11-12 Published:2014-11-12
Contact: Guo Shu-zhong, M.D., Chief physician, Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China Han Yan, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
About author:Li Dan, M.D., Attending physician, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：血竭为传统医学中生肌方剂的主要成分，长期应用于临床治疗多种难愈性创面，具有确切的疗效，但血竭在创面愈合过程中对正常成纤维细胞分泌胶原的影响，目前未见报道。

目的：观察血竭提取物对成纤维细胞增殖及胶原分泌的作用。

方法：应用氯仿、乙酸乙酯、乙醇对血竭依次回流提取得到血竭提取液，用DMEM培养液稀释后培养成纤维细胞。将人正常皮肤来源成纤维细胞分别培养于血竭氯仿提取液(氯仿提取组)、血竭乙酸乙酯提取液(乙酸乙酯提取组)、血竭乙醇提取液(乙醇提取组)含1%二甲基亚砜DMEM(含1%二甲基亚砜DMEM组)和正常培养(对照组)条件下。MTT法检测不同血竭提取物在不同质量浓度(0.002，0.02，0.2，2，20 g/L)培养条件下，确定最适合成纤维细胞生长的血竭提取物，并检测在此条件下，成纤维细胞形态、生长曲线、细胞周期、分泌Ⅲ型前胶原水平的变化。

结果与结论：血竭乙酸乙酯提取物在0.2-2 g/L范围内，可以促进正常人成纤维细胞增殖，在2 g/L浓度值时促进增殖作用最显著，因此2 g/L乙酸乙酯提取物为最适合成纤维细胞生长的一组血竭提取物。与对照组相比，2 g/L乙酸乙酯提取组成纤维细胞的细胞融合现象增多，细胞浓度增加，S期的细胞比例增加，减少Ⅲ型前胶原表达。提示血竭乙酸乙酯提取物既可促进创面愈合，又不致于过度增生形成病理性瘢痕。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 成纤维细胞, 血竭, 创面愈合, 细胞增殖, Ⅲ型前胶原, 中药

Abstract:

BACKGROUND: Dragon’s blood is the main ingredient of traditional medicine prescription for promoting granulation, which has been used in clinical treatment of a variety of refractory wounds and achieved the exact effects. But the Dragon’s blood effect on collagen secretion from normal fibroblasts has not been reported.

OBJECTIVE: To investigate the effects of Dragon’s blood extract on the proliferation and secret function of fibroblasts in vitro.

METHODS: Dragon’s blood was extracted by extracts chloroform, acetoacetic ester, and alcohol in turn. Normal human fibroblasts were respectively cultured in Dragon’s blood extracts of chloroform, acetoacetic ester, and alcohol, DMEM containing 1% dimethyl sulfoxide, and normal culture medium. Then, the fibroblasts were cultured in vitro in different media containing gradient dilutions of Dragon’s blood extracts (0.002, 0.02, 0.2, 2, 20 g/L), which was followed by cell proliferation determination assessed with MTT assay. Under the optimal concentration, the cell growth curves were drawn and the flow cytometry was used to determine the changes of cell cycle. The concentration of procollagen type III in the supernatant of the fibroblast culture systems was measured by radioimmunoassay.

RESULTS AND CONCLUSION: 0.2 g/L-2 g/L dilution of Dragon’s blood extracted by acetoacetic ester enhanced the proliferation of fibroblasts in a dose-dependent manner. The 2 g/L was the optimal dilution of Dragon’s blood extracted by acetoacetic ester, and it increased the ratio of S cells in cell cycle than control group and decreased procollagen type III. These findings indicate that Dragon’s blood acetoacetic ester extract can improve the proliferation of cultured human fibroblasts in vitro, and decrease the secretion of procollagen type III of fibroblasts, and it can be beneficial to improve wound healing and inhibit hypertrophic scar.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: fibroblasts, drugs, chinese herbal, plant extracts, cell proliferation

中图分类号:

R318

李丹，惠瑞，胡永武，韩岩，郭树忠. 血竭提取物促进成纤维细胞增殖及胶原分泌[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(46): 7437-7441.

Li Dan, Hui Rui, Hu Yong-wu, Han Yan, Guo Shu-zhong. Effects of Dragon’s blood extracts on fibroblast proliferation and procollagen type III [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(46): 7437-7441.

图/表（结果） 3

2.1 血竭提取物对成纤维细胞增殖的影响及最适浓度筛选 氯仿提取组及乙醇提取组在各种浓度条件下，对成纤维细胞增殖的影响与对照组相比，差异均无显著性意义 (P > 0.05)。乙酸乙酯提取物在浓度为0.2-2 g/L时均有不同程度促进成纤维细胞增殖的作用，并且呈剂量依赖关系， 2 g/L时促进成纤维细胞作用最显著(P < 0.05)，故2 g/L血竭乙酸乙酯提取物为促进成纤维细胞增殖的最适浓度。含1%二甲基亚砜组与对照组无显著差异(P > 0.05；图1)。因此2 g/L乙酸乙酯提取物为最适合成纤维细胞生长的一组血竭提取物，后面的实验仅探讨其与对照组的差异。

2.2 血竭提取物对成纤维细胞形态的影响 光学显微镜下可见，在质量浓度为2 g/L的乙酸乙酯提取物培养24 h后，成纤维细胞的细胞融合现象较对照组明显，对照组仅部分成纤维细胞散在融合(图2)。

2.3 血竭提取物最佳浓度条件下的成纤维细胞生长曲线 成纤维细胞在血竭乙酸乙酯提取物最佳浓度2 g/L条件下培养，可见培养8 h时其吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)，且随时间的延长而逐渐增大，在24 h时2组的吸光度值均达到峰值(P < 0.05)，而后2组的吸光度值逐渐下降，但2 g/L血竭乙酸乙酯提取物组细胞的吸光度值仍明显高于对照组(P < 0.05；图3)。

2.4 血竭提取物对成纤维细胞细胞周期的作用 流式细胞术检测到，培养24 h后，2 g/L血竭乙酸乙酯提取物组成纤维细胞处于G₁期的比例明显低于对照组(P < 0.05)，但S期的细胞比例则明显高于对照组(P < 0.05)；见表1。

2.5 血竭提取物对成纤维细胞分泌Ⅲ型前胶原的影响 在培养0-72 h时，2 g/L血竭乙酸乙酯提取物组与对照组成纤维细胞中Ⅲ型前胶原水平均呈持续递增的趋势，且其中 2 g/L血竭乙酸乙酯提取物组成纤维细胞中Ⅲ型前胶原水平在24-72 h低于对照组(P < 0.05)；见表2。

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察。

时间及地点：实验于2005年1至6月在解放军第四军医大学附属西京医院整形外科实验室完成。

材料：

组织：应用正常皮肤成纤维细胞来源于健康人体植皮手术残留皮肤，供者3人，均为青年男性年龄在19-31岁之间，所有供者均自愿参加，对实验过程完全知情同意并签署“知情同意书”，实验方案及操作获解放军第四军医大学附属西京医院伦理委员会批准。

药物：血竭为棕榈科植物麒麟竭果实和藤茎中的树脂，购自印度尼西亚皇冠公司。

方法：

成纤维细胞分离培养：应用皮肤标本3例组织贴块法进行原代培养^[5]，实验用3-5代细胞。

血竭提取物制备：由西京医院药剂科协助完成。将血竭捣碎后经氯仿、乙酸乙酯、体积分数95%乙醇依次回流提取，得到氯仿提取液、乙酸乙酯体提取液、乙醇提取液，经水浴挥干，以二甲基亚砜助溶得到质量浓度为200 g/L的溶液，流通蒸汽灭菌30 min，常温保存。使用时将氯仿提取液、乙酸乙酯体提取液、乙醇提取液三种提取液分别溶解于DMEM培养液，配制成稀释质量浓度为0.002，0.02，0.2，2，20 g/L的溶液。实验分为氯仿提取组、乙酸乙酯提取组、乙醇提取组、含1%二甲基亚砜DMEM组和对照组。含1%二甲基亚砜DMEM组为含体积分数1%二甲基亚砜的DMEM(氯仿提取组、乙酸乙酯提取组及乙醇提取组均需要二甲基亚砜助溶)。其中氯仿提取组、乙酸乙酯提取组和乙醇提取组3个组又分别分0.002，0.02，0.2，2，20 g/L 5个亚组。

选择最适生长浓度：采用MTT比色法分析^[11]。分别将对数生长期的成纤维细胞接种于96孔板，每孔200 μL，细胞浓度为5×10⁷L^-¹，于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中孵育24-48 h，待细胞完全贴壁后，吸弃培养液，加入各组溶液(150 μL/孔)进行培养，每组均设6个平行孔。于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后，每孔加5 g/L MTT 10 μL，孵箱中培养4 h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜 (150 μL/孔)，震荡10 min。酶联免疫检测仪在450 nm波长下读取吸光度值。筛选出最适合成纤维细胞生长的一组血竭提取物。

绘制细胞生长曲线：将最适合成纤维细胞增殖的一组血竭提取物浓度下培养成纤维细胞，采用MTT比色分析法，检测0，8，16，24，32，40，48 h的吸光度值反映细胞数量，绘制生长曲线。

细胞周期检测：采用流式细胞术，取6瓶对数生长期的成纤维细胞，每瓶计数约2.5×10⁵。弃去培养液，加入最适培养浓度血竭提取液5 mL，对照组加入5 mL DMEM培养液，在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱内孵育24 h，弃液，加入0.25%胰酶消化2 min，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM终止消化，收集细胞，1 000 r/min离心5 min，加入PBS洗涤2次，离心(800-1 000 r/min，5 min)，弃上清，加入1 mL PBS吹散细胞团块，加入冰乙醇2 mL固定后碘化丙啶避光染色15 min，置入流式细胞仪检测细胞周期。

Ⅲ型前胶原水平测定：采用放射免疫分析法采用放射免疫分析法对成纤维细胞培养上清液中的Ⅲ型前胶原水平进行检测^[12-16]。分别将对数生长期的成纤维细胞接种于96孔板，细胞浓度5×10⁷L^-¹，每孔200 μL，于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中孵育24-48 h，待细胞完全贴壁后，吸弃培养液，实验组加入最适浓度血竭提取物条件培养液 (200 μL/孔)，对照组加入DMEM培养液(200 μL/孔)，每组均设3个平行孔。于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养，分别于0，12，24，36，48，60，72 h，吸取上清液150 μL/孔，按照Ⅲ型前胶原放免试剂盒说明步骤加样，绘制标准曲线并测定样品。Ⅲ型前胶原的水平在放射免疫γ自动计数仪上测得。

主要观察指标：MTT法检测血竭提取物对成纤维细胞增殖的影响，并绘制最适浓度下生长曲线，流式细胞术检测最适浓度条件下成纤维细胞细胞周期，放射免疫法检测最适条件下培养的成纤维细胞分泌Ⅲ型前胶原的情况。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。实验所得数据采用统计分析软件SPSS 13.0软件(美国SPSS公司)进行分析，应用组间比较采用Student t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

血竭是中国传统医学中常用的生肌类药物，在临床上，被用于治疗糖尿病性溃疡、压疮、术后切口愈合不良等难愈性创面，具有确切可靠的疗效。在南美洲民间医学中也有大量对创面止血促进愈合方面的应用。目前，学者们将血竭的此类功效归结为其具有活血化瘀、抗菌消炎、促进表皮细胞游走、抗脂质过氧化等作用^[17-22]。本实验观察到，血竭乙酸乙酯提取物具有显著促进成纤维细胞增殖的作用。

血竭属于树脂类中药，主要含有血竭素、血竭红素等黄酮类化合物及三萜类化合物等多种复杂成分，且溶解度差异较大。本实验采取溶剂提取法经氯仿、乙酸乙酯和乙醇依次回流提取，将血竭不同极性成分进行初步分类，旨在缩小对于血竭单一有效成分的研究范围。本实验结果表明，氯仿及乙醇提取物对于成纤维细胞无明显作用，血竭乙酸乙酯提取物具有显著促进成纤维细胞增殖的作用，且在0.2-2 g/L浓度范围内呈剂量依赖关系。国内有学者报道，将血竭经石油醚、氯仿、乙酸乙酯回流提取在乙酸乙酯部位可以分离到黄酮类化合物^[23-27]，提示本实验中血竭乙酸乙酯提取物发挥作用的部分可能为黄酮类化合物。

成纤维细胞在创面修复过程中发挥重要作用，其在伤口愈合过程中经过迁移、增殖、分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同组成肉芽组织，修复组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件^[28]，是创面愈合中的关键步骤，其中成纤维细胞增殖分化是最重要的细胞活动之一。本实验观察到，在质量浓度为2 g/L时，血竭乙酸乙酯提取物对成纤维细胞具有显著促进增殖的作用，流式细胞仪检测发现细胞周期中G₁期比例降低，S期比例比对照组增加，证实了血竭乙酸乙酯提取物可以促进正常人成纤维细胞越过在G₁期中间存在一个细胞分裂的限制点，进入增殖状态。结合文献报道，Vaisberg等^[8]研究发现南美洲血竭Taspine成分在50 ng/L浓度显著促进人成纤维细胞迁移，作者认为血竭对于肉芽组织填充过程中成纤维细胞迁移、增殖的显著促进作用，可能是其直接促进创面愈合的机制。

细胞外基质大体上可以分为胶原、蛋白聚糖、糖蛋白三大类^[29]。在创伤修复过程中，成纤维细胞是它们最重要的来源。成纤维细胞过度增殖和分泌，导致细胞外基质异常沉积，造成病理性瘢痕。因此在组织修复过程中，促进创面愈合和减少瘢痕形成在临床治疗上常存在着一定矛盾。本实验发现血竭乙酸乙酯提取物可以显著促进成纤维细胞增殖，却降低了其细胞外基质Ⅲ型前胶原的分泌量，可能是血竭促进创面成纤维细胞增殖并产生一定量细胞外基质，既促进创面愈合，又不致于过度增生形成病理性瘢痕的原因。该作用是否与某些多肽生长因子的作用机制相同，值得深入探讨。血竭乙酸乙酯提取物中发挥作用的是否为黄酮类物质，尚待进一步证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Effects of Dragon’s blood extracts on fibroblast proliferation and procollagen type III

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