流式细胞仪检测急性婴幼儿白血病干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：有关儿童急性髓细胞性白血病干细胞含量的测定及急性髓细胞性白血病患儿缓解后白血病干细胞含量与急性白血病微小残留病之间关系的研究国内外未见报道。
目的：通过测定急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC在儿童急性白血病患儿骨髓单个核细胞中的含量，研究急性髓细胞性白血病患儿缓解后白血病干细胞含量与急性白血病微小残留病水平之间的关联。
方法：收集白血病患儿113例次。采用骨髓单个核细胞分离及单细胞悬液制成单细胞悬液，进行单个核细胞染色、急性髓细胞性白血病干细胞分析及根据初诊免疫表型获得白血病相关表型，并采用该白血病相关免疫表型进行单抗组合和流式细胞术测定分析。
结果与结论：①初诊急性髓细胞性白血病组骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞含量明显高于初诊急性淋巴细胞性白血病组和非肿瘤对照组(P均< 0.017)，初诊急性淋巴细胞性白血病组骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量显著高于非肿瘤对照组(P < 0.017)。②对33例次缓解急性髓细胞性白血病患儿急性髓细胞性白血病干细胞和急性白血病微小残留病相关性分析发现，两者存在显著负相关性。结果提示，①急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC也存在于初诊急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓细胞中，且当急性淋巴细胞性白血病获完全缓解时急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量却没有下降，但非肿瘤对照组标本中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的含量极微。②急性髓细胞性白血病患儿缓解后骨髓中急性髓细胞性白血病干细胞含量和急性白血病微小残留病水平之间存在着明显的负相关。

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 急性髓细胞性白血病, 急性淋巴细胞性白血病, 白血病, 肿瘤, 白血病干细胞, 急性白血病微小残留病, 单个核细胞, 免疫表型, CD34, CD38

Abstract:

BACKGROUND: Few studies are reported at home and abroad regarding detection of leukemia stem cell concentration in childhood acute myeloid leukemia and the correlation between leukemia stem cell level in childhood acute myeloid leukemia after remission and minimal residual disease level.
OBJECTIVE: To determine leukemia stem cell level and leukemia stem cell-IPIC level in childhood acute myeloid leukemia both at initial diagnosis and at remission and correlate them to minimal residual disease level in childhood acute myeloid leukemia.
METHODS: A total of 113 samples from patients with childhood acute myeloid leukemia were collected. All heparinized bone marrow mononuclear cells were separated by cell density gradient centrifugation on ficoll-hypaque solution. After washes with PBS containing 0.1% fetal calf serum, mononuclear cell suspension was prepared. Mononuclear cells were stained with fluochrome labeled monoclonal antibodies. Leukemia stem cell level was determined and leukemia-related immunophenotypes were acquired. Immunophenotype determination and flow cytometry analysis were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: Leukemia stem cell level in childhood acute myeloid leukemia group at initial diagnosis was significantly higher than that in acute lymphocytic leukaemia and non-malignancy control groups (both P < 0.017). The leukemia stem cell-IPIC level in childhood acute lymphocytic leukemia at initial diagnosis was significantly higher than that in the non-malignancy control group (P < 0.017). There was a significant negative correlation between leukemia stem cell level and minimal residual disease level in childhood acute myeloid leukemia. The results indicate that (1) the phenotypically same leukemia stem cell populations were also found in the bone marrow of patients with acute lymphocytic leukaemia at initial diagnosis, but the levels were not significantly different when complete remission was achieved. These phenotypically same populations were hardly found in the non-malignancy control group. (2) There was a significant negative correlation between leukemia stem cell level in childhood acute myeloid leukemia and minimal residual disease level in childhood acute myeloid leukemia patients after remission.

Key words: stem cells, embryonic stem cells, acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, leukemia, tumor, leukemia stem cells, acute minimal residual disease, mononuclear cells, immunotype, CD34, CD38

中图分类号:

R394.2

范海滨，陈迪，欧良红，宋军利，宋国. 流式细胞仪检测急性婴幼儿白血病干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1742-1747.

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图/表（结果） 6

2.1 参与者数量分析 纳入白血病患儿23例，非肿瘤对照患儿12例，分为3组，无脱落，全部进入结果分析。

2.2 各组基线资料比较 各组患儿年龄比较差异无显著性意义。见表2。

2.3 初诊白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的含量 11例初诊急性髓细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞的中位含量为166(范围14-1 459)/100 000个；12例初诊急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的中位含量为7(范围0-560)/100 000个；12例非肿瘤对照组患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的中位含量为0(范围0-6)/100 000个。

统计学分析显示，初诊急性髓细胞性白血病组、急性淋巴细胞性白血病组和非肿瘤对照组三者之间急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞- IPIC含量的差异具有显著性意义(P < 0.05)。其中，急性髓细胞性白血病组与急性淋巴细胞性白血病组、急性髓细胞性白血病组与非肿瘤对照组、急性淋巴细胞性白血病组与非肿瘤对照组比较急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量的差异均具有显著性意义(P均 < 0.017)，见图1。

11例初诊急性髓细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中的急性髓细胞性白血病干细胞占CD34⁺CD38^-细胞群的比例(中位值)为28.75%(范围9.98%-98.79%)，其中有2例患儿(18%)的急性髓细胞性白血病干细胞占CD34⁺CD38^-细胞群的比例很高，分别占98.79%和94.61%，余9例(82%)的急性髓细胞性白血病干细胞占CD34⁺CD38^-细胞的比例较低，中位值仅26.29%(范围9.98%-69.47%)。12例初诊急性淋巴细胞性白血病患儿单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC占CD34⁺CD38^-细胞的比例个体差异较大(0-90.44%)，个别急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量很高。

2.4 缓解期白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的含量 39例次缓解急性髓细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞的中位含量为6(范围0-41)/100 000个；44例次缓解急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的中位含量为10(范围0-105 )/100 000个；非肿瘤对照组患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的中位含量为0(范围0-6)/100 000个。

统计学分析显示，缓解急性髓细胞性白血病组、急性淋巴细胞性白血病组和非肿瘤对照组三者之间急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞- IPIC含量的差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

但缓解急性髓细胞性白血病组与缓解急性淋巴细胞性白血病组比较急性髓细胞性白血病干细胞和急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量差异无显著性意义 (P > 0.017)，缓解急性髓细胞性白血病组、缓解急性淋巴细胞性白血病组骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量均高于非肿瘤对照组(P均< 0.017)。

2.5 急性髓细胞性白血病患儿不同时期骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞的含量 11例初诊急性髓细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞的中位含量为166(范围14-1 459)/ 100 000个；7例未缓解急性髓细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞的中位含量为36(范围5-224 )/100 000个；39例次缓解急性髓细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞的中位含量为6(范围0-41)/100 000个；12例对照组患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-II-IC中位含量为0(范围0-6)/100 000个。

统计学分析显示，初诊急性髓细胞性白血病组、未缓解急性髓细胞性白血病组、缓解急性髓细胞性白血病组和对照组四者之间急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量的差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

其中初诊急性髓细胞性白血病组与未缓解急性髓细胞性白血病组急性髓细胞性白血病干细胞含量差异无显著性意义(P > 0.05)，初诊急性髓细胞性白血病组与缓解急性髓细胞性白血病组、初诊急性髓细胞性白血病组与对照组、缓解急性髓细胞性白血病组与对照组比较急性髓细胞性白血病干细胞含量的差异均有显著性意义(P均< 0.016)。

对缓解后不同时期急性髓细胞性白血病干细胞的含量进行统计分析显示：初诊后急性髓细胞性白血病组与缓解后第1，28，60，90及180天比较骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞含量差异均有显著性意义(P < 0.05)。缓解后第1，28，90天及180天组比较骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞含量差异均无显著性意义(P > 0.05)，但都明显高于非肿瘤对照组(P < 0.05)。

2.6 急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的含量 12例初诊急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的中位含量为7(范围0-560)/ 100 000个；44例次缓解急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的中位含量为10(范围0-105)/100 000个；12例非肿瘤对照组患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞- IPIC的中位含量为0(范围0-6) /100 000个。

统计学分析显示，初诊急性淋巴细胞性白血病组、缓解急性淋巴细胞性白血病组和非肿瘤对照组三者之间急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量比差异具有显著性(P < 0.05)，见图4。

但是，初诊急性淋巴细胞性白血病组与缓解急性淋巴细胞性白血病组骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量的差异无显著性意义(P > 0.017)。初诊急性淋巴细胞性白血病组、缓解急性淋巴细胞性白血病组骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞- IPIC含量均明显高于对照组(P均< 0.017)。

2.7 急性白血病微小残留病测定结果 对同时进行急性髓细胞性白血病干细胞和急性白血病微小残留病检测的33例次缓解急性髓细胞性白血病病例相关性分析发现，两者存在显著负相关性(R=-0.466，P=0.006)。

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引言

材料方法

对象和方法
设计：对比观察。
时间及地点：于2009年7月至2011年2月在辽河油田总医院成。
对象：选择同期辽河油田总医院就诊的白血病患儿23例(113例次)，其中男76例次，女37例次，年龄2-15岁。实验分为3组：①初诊急性髓细胞性白血病患儿11例(包括缓解急性髓细胞性白血病患儿39例次，未缓解急性髓细胞性白血病患儿7例次)。②初诊急性淋巴细胞性白血病患儿12例(其中B系7例，T系5例，包括缓解急性淋巴细胞性白血病患儿44例次)。③另选12例非肿瘤患儿做对照组(包括特发性血小板减少性紫瘫8例，再生障碍性贫血3例，传染性单核细胞增多症1例)。所有标本均在采集后4 h内进行测定。
诊断标准：急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病均符合内科学白血病诊断标准^[10]。
纳入标准：①患儿年龄<15岁。②进行单个核细胞染色、急性髓细胞性白血病干细胞检测者。
排除标准：①单核细胞增多症。②再生障碍性贫血。
流式细胞仪检测白血病干细胞所用主要试剂：
Main experimental reagents:

方法：
单个核细胞的分离和单细胞悬液的制备：取肝素钠抗凝的新鲜骨髓血1 mL于一支流式细胞仪专用管中，加入适量PBS，充分稀释。取离心管，加入2.0-3.0 mL淋巴细胞分离液，吸出骨髓血，保持两液面清晰，迅速放入离心机中，1 500 r/min×20 min；吸取上层血浆弃去，然后吸出单个核细胞层移入15 mL离心管中，加入PBS 10 mL，弃上清，加入PBS混匀，水平离心1 500 r/min×10 min，弃上清，用加入适量PBS，重悬细胞，制成单细胞悬液；取单个核细胞悬液10 μL加入到含90 μL Turk’s溶液的 1 mL离心管中，混匀，使用滴管取出10 μL混和液，计算单个核细胞悬液的浓度。
单个核细胞染色：每个标本取4支不同的流式细胞仪专用试管并编号，每管分别加入1×10⁶个细胞和1 mL灭活人AB血浆，混匀，置4 ℃冰箱中孵育10 min以阻断细胞表面FC受体，加 PBS 3 mL/管，混匀，1 500 r/min ×10 min离心1次，弃上清，加PBS至100 μL，加入不同的单克隆抗体试剂(简称为单抗)，见表1。

其中PE-，PerCP-标记试剂每管加20 μL，APC-标记试剂每管加5 μL，充分混匀后4 ℃下避光孵育20 min。弹击管底，用PBS 洗涤1 000 r/min×10 min，洗去未结合的单克隆抗体。然后加入1 mL 1ysing solution 4 ℃避光溶血10 min，PBS洗涤2次，1 000 r/min×10 min。弹击管底，加入适量的PBS重悬细胞，准备上流式细胞仪测定。
急性髓细胞性白血病干细胞的测定：选取CD34⁺/ CD38^-的造血干细胞，用CD 123来标记急性髓细胞性白血病干细胞，即正常HSC的免疫表型为：CD34⁺/CD38^-/ CD123^-，急性髓细胞性白血病干细胞的免疫表型为：CD34⁺/CD38^-/CD 123+。在非急性髓细胞性白血病病例中所测到的表型为CD34⁺/CD38^-/CD123⁺的细胞称为急性髓细胞性白血病干细胞相同表型细胞(急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC)。
急性白血病微小残留病测定：标本处理同前，根据初诊免疫分型测定的不同抗原的异常表达获得白血病相关免疫表型，采用该白血病相关免疫表型进行单抗组合和流式细胞术测定分析^[1]。
主要观察指标：①急性髓细胞性白血病干细胞的测定结果。②白血病急性白血病微小残留病测定结果。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件处理。用Kolmognrov-Smimov检验数据分布的正态性，多组间急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病比C-IPIC含量的比较采用Krllskal-Wa-115检验，多组间两两比较采用Mann-Whineyu检验(a经Bonfermni法校正后为a’，P < a’时认为差异有显著性意义，即3组间两两比较P < 0.017时认为差异有显著性意义，4组间两两比较P < 0.008时认为差异有显著性意义)。用Spearman等级相关来检验白血病干细胞含量与急性白血病微小残留病水平的相关性。

讨论

实验测定了急性髓细胞性白血病干细胞表型(CD34⁺/CD38-/CD123⁺)阳性的细胞在急性髓细胞性白血病, 急性淋巴细胞性白血病和非肿瘤对照组患儿骨髓单个核细胞中的存在情况，在11例初诊急性髓细胞性白血病患儿骨髓单个核细胞都有急性髓细胞性白血病干细胞存在，明显高于初诊急性淋巴细胞性白血病组和非肿瘤对照组患儿骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的含量，与Jordan等^[2]的研究结果符合。实验发现急性髓细胞性白血病患儿缓解后急性髓细胞性白血病干细胞含量与急性白血病微小残留病水平之间成负相关；并发现急性髓细胞性白血病干细胞含量在儿童急性髓细胞性白血病患者骨髓单个核细胞中占CD34⁺CD38^-细胞的比例较低，中位值仅为28.75%，而Jordan等报道的18例成人病例中的急性髓细胞性白血病干细胞含量占骨髓单个核细胞中CD34⁺CD38^-细胞的比例较高，平均含量为99.20%。初诊急性髓细胞性白血病患儿急性髓细胞性白血病干细胞在骨髓单个核细胞中含量明显比成人低，是否是儿童白血病患者治疗效果明显好于成人的原因有待于进一步研究。

作者贡献：第一作者设计实验，第三、四作者实施，第二作者进行实验评估，资料收集为第一、五作者，第一作者成文，第二作者审校，第一作者对文章负责。是盲法评估。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：参与实验的患病个体及其家属自愿参加，对标本采集均知情同意。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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