不同剂量骨碎补对兔骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (41): 6649-6654.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.016

• 干细胞与中医药 stem cells and traditional Chinese medicine • 上一篇下一篇

不同剂量骨碎补对兔骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

张虎林¹，张自强²，许宏斌¹，张晓刚¹

¹甘肃中医学院附属医院，甘肃省兰州市 730020；²宝鸡市中医院，陕西省宝鸡市 122321

修回日期:2014-09-20 出版日期:2014-10-01 发布日期:2014-10-01
通讯作者: 张晓刚，教授，主任医师，博士生导师，甘肃中医学院附属医院，甘肃省兰州市 730020
作者简介:张虎林，男，1977年生，甘肃省武威市人，汉族，2006年甘肃中医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事中医药对骨关节疾病治疗的研究。
基金资助:
甘肃省科技支撑计划-社会发展计划项目(0804NKCA101)

Drynaria freeze-dried powder at different dosages influences proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Hu-lin¹, Zhang Zi-qiang², Xu Hong-bin¹, Zhang Xiao-gang¹

¹Affiliated Hospital of Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730020, Gansu Province, China; ²Baoji Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Baoji 122321, Shaanxi Province, China

Revised:2014-09-20 Online:2014-10-01 Published:2014-10-01
Contact: Zhang Xiao-gang, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Affiliated Hospital of Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730020, Gansu Province, China
About author:Zhang Hu-lin, Master, Attending physician, Affiliated Hospital of Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730020, Gansu Province, China
Supported by:
the Technology Support-Social Development Program of Gansu Province, No. 0804NKCA101

摘要/Abstract

摘要：

背景：现代研究表明骨碎补具有推迟细胞退行性变、降低骨关节病发病率的作用。

目的：比较不同剂量骨碎补冻干粉诱导兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的效果，并筛选出最佳剂量。

方法：利用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞，分为空白组、转化生长因子β1阳性对照组、骨碎补高、中、低剂量组(分别含骨碎补0.4 mg，0.1 mg，5 μg)，取第3代骨髓间充质干细胞，根据实验分组加入不同培养液进行培养，1周后MTT比色法检测活细胞数目，免疫组化法测定Ⅱ型胶原表达。

结果与结论：MTT比色结果显示转化生长因子β1和骨碎补冻干粉均能促进骨髓间充质干细胞增殖，转化生长因子β1阳性对照组>骨碎补低剂量组>骨碎补中剂量组>骨碎补高剂量组>空白组。细胞免疫组化检测Ⅱ型胶原结果显示转化生长因子β1和骨碎补冻干粉均可以诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，诱导后的细胞明显表达Ⅱ型胶原，转化生长因子β1阳性对照组>骨碎补低剂量组>骨碎补中剂量组>骨碎补高剂量组>空白组。结果表明骨碎补能促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化，尤以5 μg剂量效果最佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨碎补, 骨髓间充质干细胞, 增殖, 诱导分化, 组织工程学, 兔

Abstract:

BACKGROUND: Modern research shows that Drynaria can delay cell degeneration and reduce the incidence of osteoarthritis.

OBJECTIVE: To observe the proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by different dosages of Drynaria freeze-dried powder, and to explore the optimum induction concentration.

METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro by density gradient centrifugation and adherence screening methods, and then divided into blank group, positive control group (transforming growth factor β1), high-, middle-, low-dosage Drynaria groups (0.4 mg, 0.1 mg, 5 μg). Passage 3 cells were selected and cultured in different media. After 1 week, cell viability was detected by MTT method, and expression of type II collagen by immunohistochemical method.

RESULTS AND CONCLUSION: Both transforming growth factor β1 and Drynaria could improve the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells, and the increase in cell proliferation was ranked as follows: positive control group > low-dosage group > middle-dosage group > high-dosage group > blank group. Bone marrow mesenchymal stem cells were differentiated into chondrocytes under induction of transforming growth factor β1 and Drynaria, and induced cells significantly expressed type II collagen. The expression of type II collagen was ranked as follows: positive control group > low-dosage group > middle-dosage group > high-dosage group > blank group. These findings suggest that Drynaria can promote the proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, and the optimal dosage is 5 μg.

全文链接：

Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, polypodiaceae, cell proliferation

中图分类号:

R394.2

张虎林，张自强，许宏斌，张晓刚. 不同剂量骨碎补对兔骨髓间充质干细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6649-6654.

Zhang Hu-lin, Zhang Zi-qiang, Xu Hong-bin, Zhang Xiao-gang. Drynaria freeze-dried powder at different dosages influences proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(41): 6649-6654.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间质干细胞表型CD44，CD34的表达 流式细胞仪检测细胞高表达CD44，不表达CD34，可证明为非造血干细胞，见图1。

2.2 骨碎补诱导兔骨髓间质干细胞后的形态 刚分离的细胞呈球形(图2A)，培养24 h细胞开始贴壁生长，呈圆形(图2B)，4 h体积变大，形状不规则(图2C)，72 h细胞体积继续增大，有的融合成细胞群(图2D)。培养至7 d后细胞变为梭形、纺锤形、三角形、多边形，体积大，有融合成片的底纹(图2E)。14 d后长成外周有触须的细胞，贴壁牢，不易消化(图2G)。培养的骨髓间质干细胞传至第3代时，无论细胞形态还是细胞活力都良好(图2H)，在此期间可加各种处理因素进行实验研究。加入各组培养液7 d后，空白组细胞爬满瓶底后则发生接触抑制，停止生长，只有少量细胞随着培养时间的延长，胶原基质逐渐堆积。用含骨碎补冻干粉的DMEM诱导分化后，光镜下观察，大多向三角形和短梭形转化，有数个突起，随着诱导作用时间的延长，细胞逐渐汇合，局部细胞呈重叠生长，胶原基质逐渐堆积、直到融合；不同浓度对骨髓间充质干细胞的影响不同，各中药组中以低浓度组细胞生长较好。

2.3 MTT比色实验结果 骨碎补冻干粉能明显促进兔骨髓间质干细胞增殖，各组与阳性对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，且在低浓度时最佳。与空白组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 细胞免疫组化检测Ⅱ型胶原表达 ①转化生长因子β1和骨碎补均可以诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，诱导后的细胞明显表达Ⅱ型胶原。②转化生长因子β1的诱导效果明显高于骨碎补低、中、高剂量组(P < 0.05)。③高、中剂量组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；低、中剂量组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；高、低剂量组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

参考文献

[1] 李伟岸,韦庆军,肖仕辉,等.兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、成骨诱导与鉴定[J].医学信息,2013,26(3):125-127.
[2] 张铭杰,张庆文,何伟,等.成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导[J].中国组织工程研究,2013,17(45):7947-7953.
[3] 肖仕辉,韦庆军,赵劲民,等. 全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定[J].中国组织工程研究,2013, 17(6): 1069-1074.
[4] 虞冀哲,杨勇,刘朝旭,等.低频电磁场干预大鼠骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究[J].中华实验外科杂志,2014,31(7): 1410-1412.
[5] 林增平,钟继平,聂达荣. 人骨髓间充质干细胞的分离和培养及向软骨细胞分化的实验研究[J].中国现代药物应用,2014,8(15): 239-240, 241.
[6] 郝耀,乔梁,郝永壮,等. 转化生长因子β及周期性拉伸应变条件下骨髓间充质干细胞向软骨样细胞的分化[J].中国组织工程研究,2014, 18(28):4429-4436.
[7] 李月白,刘鸣,李劲峰,等.腺病毒穿梭载体介导RNA干扰对激素诱导兔骨髓间充质干细胞成脂分化的作用[J].中华实验外科杂志,2013, 30(7): 1343-1346.
[8] 齐振熙,李树强,于涛.土鳖虫含药血清干预骨髓间充质干细胞的成脂分化[J].中国组织工程研究,2013,17(14):2597-2602.
[9] 曹月娟,林美光,王佩显.体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J].中华生物医学工程杂志,2014,20(1):1-6.
[10] ]顾健,王爱玲,郝玉瑜,等.大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的研究[J].医学综述,2014,20(6):1109-1111,1116.
[11] 黄吕,张辉,解力,等. H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J].中国组织工程研究,2014,18(19): 2981-2986.
[12] 邸军,李梓菲,陈艳,等.大鼠骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞诱导分化的机制[J].中国老年学杂志,2013,33(12):2835-2836.
[13] 顾加祥,尚修超,刘宏君,等. GDNF基因诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究[J].中国实验诊断学,2014,18(3): 354-357.
[14] 白瑞樱,张艳,朱涵.人骨髓间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的研究[J].新乡医学院学报,2014,31(2):104-106.
[15] 黄建锋,黄继锋,张伟才.两种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化[J].中国组织工程研究,2014,18(6): 829-834.
[16] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science. 1999;284(5411): 143-147.
[17] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.Nature. 2002;418(6893):41-49.
[18] 黄枫,解国平.补肾方含药血清对软骨细胞增殖的影响[J].广州中医药大学学报,2005,22(2):138-140.
[19] 许少刚,赵建宁.转化生长因子-β在软骨组织工程的应用进展[J].人民军医,2006,49(11):646-648.
[20] Lucas PA, Caplan AI.Chemotactic response of embryonic limb bud mesenchymal cells and muscle-derived fibroblasts to transforming growth factor-beta.Connect Tissue Res. 1988;18(1): 1-7.
[21] Miura Y, Parvizi J, Fitzsimmons JS,et al.Brief exposure to high-dose transforming growth factor-beta1 enhances periosteal chondrogenesis in vitro: a preliminary report.J Bone Joint Surg Am. 2002;84-A(5):793-799.
[22] Haynesworth SE, Goshima J, Goldberg VM,et al. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow.Bone. 1992;13(1):81-88.
[23] Majumdar MK, Banks V, Peluso DP,et al.Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells.J Cell Physiol. 2000;185(1):98-106.
[24] Worster AA, Nixon AJ, Brower-Toland BD,et al.Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells.Am J Vet Res. 2000; 61(9):1003-1010.
[25] Ponticiello MS, Schinagl RM, Kadiyala S,et al.Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy.J Biomed Mater Res. 2000;52(2):246-255.
[26] Chimal-Monroy J, Díaz de León L.Differential effects of transforming growth factors beta 1, beta 2, beta 3 and beta 5 on chondrogenesis in mouse limb bud mesenchymal cells.Int J Dev Biol. 1997;41(1):91-102.
[27] Fortier LA, Nixon AJ, Mohammed HO,et al. Altered biological activity of equine chondrocytes cultured in a three-dimensional fibrin matrix and supplemented with transforming growth factor beta-1.Am J Vet Res. 1997;58(1):66-70.
[28] Yip KK, Lo S, Kwok-fai So KF, ET AL. Pre-ischemia electro-acupuncture potentiates the expression of Bcl-2 and transforming growth factor-beta 1 in rat brains. Neural Regen Res.2012;7(24): 1859-1865.
[29] 杨志明.组织工程基础与临床[M].成都:四川科学技术出版社, 2000:50-51.
[30] Cornell CN, Lane JM.Newest factors in fracture healing.Clin Orthop Relat Res. 1992;(277):297-311.
[31] Kulyk WM, Rodgers BJ, Greer K,et al.Promotion of embryonic chick limb cartilage differentiation by transforming growth factor-beta. Dev Biol. 1989;135(2):424-30.
[32] 舒朝锋,崔磊,刘伟,等.人骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究[J].中华创伤骨科杂志,2004,6(2):194-198.
[33] 段小军,杨柳,左镇华,等.应用聚集培养技术进行兔骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导培养[J].中华实验外科杂志,2007,24(3): 316-318.
[34] 焦强,卫小春,杨自权,等.人骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化的研究[J].中国矫形外科杂志,2004,12(21):1682-1685.
[35] 戴洪山,刘建,袁志,等.人骨髓基质干细胞在不同诱导环境下向软骨细胞的分化[J].医学研究生学报,2006,19(8):688-691.
[36] Xu Y, Balooch G, Chiou M,et al.Analysis of the material properties of early chondrogenic differentiated adipose-derived stromal cells (ASC) using an in vitro three-dimensional micromass culture system.Biochem Biophys Res Commun. 2007;359(2):311-316.
[37] 潘浩,胡庆丰,李雄峰,等.补肾壮筋汤对兔早期实验性膝骨关节炎软骨细胞凋亡及增殖细胞核抗原表达的影响[J].中国骨伤,2005,18(5): 278-281.

引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2008年9月至2009年5月在甘肃中医学院中心实验室完成。

材料：

实验动物：1周龄青紫兰兔，雄性，体质量0.5 kg，由兰州生物制品研究所实验动物中心提供(实验动物合格证号14-004)。

实验方法：

分组处理：实验分空白组，阳性对照组，骨碎补高、中、低剂量组(n=6)。按以上分组加入不同干扰因素进行实验。

空白组：培养液为85 mL低糖DMEM+15 mL胎牛血清+ 10^-⁵ mmo1/L地塞米松+50 μg/L维生素C。

阳性对照组：培养液为85 mL低糖DMEM+15 mL胎牛血清+5 ng转化生长因子β1+10^-⁵ mmol/L地塞米松+ 50 μg/L维生素C。

骨碎补高剂量组：培养液为85 mL低糖DMEM+15 mL胎牛血清+0.4 mg骨碎补冻干粉+10^-⁵ mmol/L地塞米松+ 50 μg/L维生素C。

骨碎补中剂量组：培养液为85 mL低糖DMEM+15 mL胎牛血清+0.1 mg骨碎补冻干粉+10^-⁵ mmol/L地塞米松+ 50 μg/L维生素C。

骨碎补低剂量组：培养液为85 mL低糖DMEM+15 mL胎牛血清+5 μg骨碎补冻干粉+10^-⁵ mmol/L地塞米松+ 50 μg/L维生素C。

兔骨髓间质干细胞培养：①将1周龄青紫兰兔1只，心脏注射空气处死后放入盛有体积分数为75%乙醇的烧杯中浸泡10 min。②在细胞室内无菌操作取出一根股骨(带肌肉组织)。③把取好的股骨放入超净工作台中的无菌培养皿内，无菌操作下剔除股骨上的肌肉组织，分别用PBS冲洗3遍。④再取一把剪刀剪取股骨两端，把股骨放入已盛好低糖DMEM培养液的培养皿中，用5 mL注射器吸取完全培养液反复冲洗骨髓腔。弃去股骨，用注射器反复吹打细胞。⑤再用200目筛网将细胞悬液滤至另一烧杯内。将滤液接种于培养瓶中。置于体积分数为5%CO₂，37 ℃培养箱中培养。72 h首次半量换液(换液过程中尽量避免摇动)。⑥以后每3 d换液1次，第14天细胞接近融合，用0.125%胰蛋白酶消化传代。待细胞形态开始皱缩后，用含体积分数为15%胎牛血清的低糖DMEM培养液1.5-2.0 mL终止消化，加入PBS反复轻轻吹打，使细胞充分脱离培养壁，移入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入培养液，平均传于2个培养瓶中。通过反复贴壁法使细胞纯化。

骨髓间质干细胞表型CD44，CD34的检测：取传至第3代的骨髓间质干细胞去除培养液，用0.125%的胰蛋白酶1.0-2.0 mL进行消化，用倒置显微镜观察待细胞形态开始皱缩时在培养瓶中加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM终止消化，用尖细管反复吹打，使细胞脱离培养瓶壁。制成单个细胞悬液，将细胞悬液以1 000 r/min离心 5 min，弃上清，重新悬浮于5 mL 4 ℃预冷的盐水G(称取葡萄糖1.1 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.4 g，NaHPO₄0.15 g，加蒸馏水1 000 mL。待完全溶解，再称取MgSO₄•7H₂O 1.54 g，CaCl₂•2H₂O 0.16 g，依次溶解于1 000 mL上述盐溶液中)中，缓慢加入-20 ℃预冷的体积分数为95%乙醇15 mL，冰浴30 min。将固定好的细胞加入PBS配成，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，加入荧光标记的CD44、CD34抗体，流式细胞仪检测细胞表型。

MTT法观察不同浓度骨碎补对兔骨髓间质干细胞活性及增殖能力的影响：取传至第3代的细胞种入48孔培养板中，每孔加0.2 mL细胞培养液，将每孔的细胞数控制在约10 000个，在37 ℃，体积分数为5%CO₂，100%饱和湿度的细胞培养箱中继续培养24 h，待细胞贴壁后，吸除培养液，实验各组更换相对应培养液，每组种植8孔，3 d后第1次换液，1周后做MTT，检测活细胞的数目，观察其对细胞生长的影响并选定浓度。

吸除48孔板内的原培养液，加入新培养液0.2 mL，然后每孔加入MTT 10 μL，在细胞培养箱中继续培养4 h，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，在细胞培养箱中再继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现Formanzan全部溶解。在波长为570 nm的酶联免疫检测仪上测吸光度值，以只加培养液孔为空白对照，观察不同浓度药物作用后细胞的存活情况。

不同浓度骨碎补对兔骨髓间质干细胞向软骨细胞分化的影响：将细胞传至第3代时，以1×10⁹ L^-¹浓度，每板 1.5 mL接种于放有盖玻片的6孔板内，将接种完毕的培养板放入培养箱内培养24 h，细胞贴壁后，实验各组更换相对应培养液。细胞在37 ℃，体积分数为5%CO₂，100%饱和湿度的孵箱内继续培养，每2 d或3 d更换1次培养液进行体外培养，1周后取出玻片，进行细胞形态学和免疫组化分析。

通过免疫组化法测定Ⅱ型胶原表达确立骨碎补是否有促骨髓间质干细胞向软骨细胞分化的作用：具体操作按SP检测试剂盒说明进行，主要染色过程如下：爬满细胞的载玻片取出后，用40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min。蒸馏水洗，PBS浸泡5 min，体积分数为3%双氧水室温孵育 5 min，以消除内源性过氧化物酶活性。滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15 min，甩去多余液体，勿洗。滴加1∶200比例稀释的Ⅱ型胶原单克隆抗体(一抗)，4 ℃过夜，PBS冲洗3 min，冲洗3次。滴加生物素化二抗工作液IgG，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗3 min，冲洗3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗3 min，冲洗3次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒。先用去离子水920 μL加入B显色液40 μL混合均匀(即将B显色液按1∶25稀释)，再加入40 μL的A显色液(即将A显色液按1∶25稀释)，混合均匀后加至盖玻片，室温显色，显微镜下以阳性对照出现棕黄色终止反应时间，自来水充分冲洗，中性树胶封固。每张片子随机选取上、下、中、左、右5个非重叠视野，4张片子共计20个视野进行观察、拍照。

统计学分析：实验结果利用统计学软件SPSS 11.5进行数据统计，实验数据均以x(_)±s表示。多组计量资料显著性比较采用单因素方差分析q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

骨髓间充质干细胞能增殖分化成多种细胞，其分化方向有赖于所处的外部条件、细胞接种密度、细胞因子浓度及多种因子的协同作用，这些因素都能影响骨髓间充质干细胞的分化。不同的诱导条件能够发生不同的分化结果，多细胞因子及一些化学药物对骨髓间充质干细胞的生长繁殖、转化均有明显的促进作用，包括转化生长因子β1、成纤维细胞生长因子，血小板衍生因子等细胞因子及地塞米松、维生素C都能明显提高骨髓间充质干细胞的增殖和转化能力。

3.1 细胞因子参与和促进兔骨髓间充质干细胞增殖分化的因子和因素众多，但它们的作用不尽相同，目前用于诱导细胞的因子主要有：转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3、血小板衍生因子、骨形态发生蛋白等。转化生长因子β是一簇具有多种功能的肽类生长因子，是诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的关键细胞因子之一^[19]。

在这类诱导因子中，尤以转化生长因子β1最为常用。转化生长因子β1大量存在于骨组织中，组织中的含量大约为200 μg/g^[20]，是关节软骨组织工程学首选的生长因子，它具有多重生物学效应，能促进软骨基质的合成，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞和成骨细胞分化，能刺激骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原和蛋白聚合酶的表达^[21]。己有研究表明高密度接种细胞，在少量转化生长因子β1 (0.1-1.0 μg/L)作用下，就能促进骨髓间充质干细胞的软骨形成^[22-25]。转化生长因子β1促进软骨基质合成作用与骨髓间充质干细胞所处的分化阶段有关^[26]，还与培养时间和培养液成分相关^[27]。

转化生长因子β1对细胞有广泛的生物学效应，可以调节细胞的生长、分化、凋亡和细胞外基质的合成^[28]。它不仅能调控兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，而且可以抑制多种炎性递质的生物学活性，所以转化生长因子β1是修复软骨缺损的首选因子^[29]。本实验证实在兔骨髓间充质干细胞体外培养过程中，转化生长因子β1能诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。一般认为，转化生长因子β1对于未分化细胞是一种促分化生长因子，它能够诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，但对于成熟的软骨细胞，则能够抑制其分化^[30]。进一步研究证明^[30]，转化生长因子β1能够促进软骨的合成和代谢，诱导间质细胞向软骨细胞分化，转化生长因子β1与全身激素以及其他生长因子也有协同或拮抗作用，从而对软骨的生长代谢起调控作用^[31]。

3.2 细胞浓度胚胎在其发育过程中，软骨形成的最早期形态学变化便是间充质细胞间距缩小，细胞间逐渐紧密接触，这种细胞的局部聚集被认为是细胞间的黏附分子或细胞外基质成分所介导，在研究中发现间质细胞在高密度的环境中培养能提供缺氧的环境，有利于细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用以及信号传递，而且可以缩短体外诱导成软骨细胞的时间；在低密度环境中培养则不利于其向软骨细胞分化。这种现象可能与细胞之间的相互作用、相互调节有关。如细胞表面的整合素、黏附分子等，达到一定的细胞浓度后它们之间就会相互产生作用，传递生物信息，产生预期的生物学效应。

本研究采用1×10⁹ L^-¹的细胞浓度进行诱导，随着时间延长，实验组细胞聚集生长，类似软骨胚胎发生前局部间充质细胞聚集。另有不少研究者采用微团培养来重现胚胎发育过程中的软骨前体状态，但近来研究发现在微团培养时由于通透性降低，细胞团块中心营养供应障碍，细胞增殖受限，不能满足较大软骨组织的构建^[32-33]。与之相比，本研究采用单层培养模式存在上述问题，诱导后的细胞增殖能力较强，能够获得较多数量的软骨细胞，满足大量构建软骨组织工程的需要。

3.3 血清浓度无血清培养最利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。无血清培养的添加成分价格昂贵，体外培养操作复杂，不利于大规模体外组织构建和产业化生产。但是近来研究发现无血清的普通培养基培养，细胞增殖性差，难以满足软骨组织工程对大量种子细胞的需求^[34]。越来越多的研究者倾向于低浓度血清培养^[35-36]。本实验采用体积分数为15%胎牛血清，发现细胞增殖能力较好，能够大量扩增。

3.4 中医药对骨髓间充质干细胞的影响本实验证实骨碎补提取物可以作为兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导剂，其作用机制与祖国传统医学的“肾生髓”理论相吻合。祖国传统医学认为肾藏精，精生髓，髓滋养骨。随着现代科学技术的发展，这一中医传统学说从微观的物质水平上得到了初步证实。黄枫等^[18]的研究认为补肾方含药血清能拮抗白细胞介素1对软骨细胞增殖的抑制作用。潘浩等^[37]在对补肾中药对骨关节软骨病变影响的研究中，发现补肾方含药血清对软骨细胞增殖过程有一定的影响，认为补肾中药具有一定修复和延缓关节软骨退变的作用，并有一定诱导干细胞分化为软骨细胞的作用。在中医药学上，骨碎补为补肾类中药，此类方剂中多选用此药。但在目前对骨碎补诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验中，所有骨碎补的浓度各不相同，本实验选取不同剂量骨碎补冻干粉作为诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导剂，通过各组间比较得出骨碎补能促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化，尤以5 μg剂量效果最佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

不同剂量骨碎补对兔骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

Drynaria freeze-dried powder at different dosages influences proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[4]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[5]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[11]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[12]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[13]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[14]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[15]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.