不同方法制备移植修复材料对异体肌腱生物学性能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.39.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：移植的肌腱必须具有良好的生物力学性能，才能有效避免缝合时肌腱吻合端的撕裂，减轻肌腱愈合过程中粘连程度。 目的：探讨移植修复材料不同制备方法对异体肌腱生物学性能的影响。

方法：将48只健康雄性来亨鸡依据随机数字表法分为均分为3组，切取3组鸡一侧第三趾屈趾浅深肌腱，玻璃化组、化学萃取组分别采用玻璃化法与化学萃取法处理肌腱，空白对照组肌腱不做任何处理。取3组一部分肌腱进行生物力学检测；另一部分进行异体移植，移植1，2，3，6周检测外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数。

结果与结论：玻璃化法可保留部分原有肌腱细胞，化学萃取法不能。3组肌腱拉伸断裂强度、拉伸断裂功耗及拉伸断裂延伸率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。移植后1，2周末，3组间CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺比较差异有显著性意义(P < 0.05)；移植后3，6周末，玻璃化组、化学萃取组CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺均明显少于空白对照组(P < 0.05)，玻璃化组和化学萃取组间CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺比较差异无显著性意义(P > 0.05)。表明采用玻璃化法和化学萃取法在有效保留肌腱生物力学性能的基础上，可显著降低肌腱的免疫原性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 移植修复材料, 制备方法, 化学萃取, 玻璃化法, 生物学性能

Abstract:

BACKGROUND: The transplanted tendon must have good biomechanical properties, in order to effectively avoid tendon tear at the anastomosis end during suturing and reduce adhesion of tendon during healing process.

OBJECTIVE: To investigate the effects of different methods for preparation of graft materials on the biological properties of tendon allograft.

METHODS: Forty-eight healthy male Leghorns were randomly divided into three groups: vitrification group, chemical extraction group, and control group. Unilateral superficial and deep flexor tendon of the third toe was subjected to vitrification, chemical extraction and no treatment in the three groups, respectively. A part of tendon was taken for biomechanical testing, and the other part was for allogeneic transplantation. After 1, 2, 3, 6 weeks, peripheral blood CD4⁺, CD8⁺ T lymphocytes were counted.

RESULTS AND CONCLUSION: Vitrification could partially retain the original tendon cells, but the chemical extraction method could not. Tensile strength for tendon rupture, tensile fracture power and tensile elongation at break were not statistically significant among three groups (P > 0.05). At the end of 1 and 2 weeks after transplantation, CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺/CD8⁺ difference was significant among the three groups (P < 0.05); at the end of 3 and 6 weeks after transplantation, CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺/CD8⁺ were significantly less in the vitrification and chemical extraction groups than the control group (P < 0.05), but no difference was found between the vitrification group and chemical extraction group (P > 0.05). These findings indicate that the vitrification and chemical extraction methods can significantly reduce immunogenicity of the tendon based on effective retention of biomechanical properties of the tendon.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, biomechanics, transplantation

中图分类号:

R318

张红星，刘耿，邱武安. 不同方法制备移植修复材料对异体肌腱生物学性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(39): 6348-6352.

Zhang Hong-xing, Liu Geng, Qiu Wu-an. Impact of different preparation methods for graft materials on biological properties of allogeneic tendon[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(39): 6348-6352.

图/表（结果） 4

参考文献

[1]徐宁.以纳米羟基磷灰石/胶原为基元的仿生人工骨制备与性能研究[D].第二军医大学,2013.
[2]赵丹.雷公藤甲素、人羊膜在同种异体肌腱移植修复肌腱缺损中的作用[D].河北医科大学,2011.
[3]董静静.自凝固磷酸钙/纤维蛋白协同诱导成骨机制的研究及成骨材料的研制[D].第四军医大学,2013.
[4]刘伟.脱细胞同种异体肌腱复合重组人骨形态发生蛋白-2重建兔前交叉韧带的实验研究[D].第二军医大学,2012.
[5]张乃丽.新型可塑形同种骨修复材料的制备及相关研究[D].南方医科大学,2013.
[6]许伟.预张力水平对异体肌腱性能的影响[D].河北医科大学, 2012.
[7]陈晓.胚胎干细胞与蚕丝—胶原支架促进肌腱再生的研究[D].浙江大学,2010.
[8]刘玉艳.N，O-羧甲基壳聚糖/纳米β-磷酸三钙复合材料的制备及其生物学性能的基础研究[D].吉林大学,2011.
[9]聂磊.高活性多孔磷钙基载药复合骨支架的制备及性能研究[D].华中科技大学,2013.
[10]杨勇.ADSCs复合PRF修复家兔耳软骨缺损的实验研究[D].第四军医大学,2013.
[11]杨亮.细菌纤维素增强复合材料制备、表征及对蛋白药物承载研究[D].东华大学,2013.
[12]黄淼俊.含锶磷酸钙中空微球的生物模板法仿生合成研究[D].华南理工大学,2013.
[13]蒋涛.大鼠脱细胞脊髓支架的优化改性及相关特性研究[D].第三军医大学,2013.
[14]唐正海.新型磁性骨水泥制备及其体外细胞生物相容性研究[D].北京中医药大学,2013.
[15]张东宪.聚对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带支架材料的空穿编织和力学性能分析[D].第四军医大学,2012.
[16]唐林俊,陈浩贤,崔太安.等.同种异体肌腱移植长期疗效观察——附24例10年随访[C].中国中西医结合学会,2012.
[17]柏树令,应大君.系统解剖学[M].北京:人民卫生出版社,2008:67.
[18]张林,李敏.肌腱疲劳的生物力学研究进展[J].体育学刊, 2008, 15(1): 109-112.
[19]张文君,柴殿波,于建农.肌腱组织工程的研究进展[J].医学综述, 2008,14(10):1452-1454.
[20]窦勃,张英泽,田德虎,等.雷公藤甲素对同种异体肌腱移植修复鸡肌腱缺损的作用[J].中国修复重建外科杂志, 2012,26(7): 869-873.
[21]吴富章,卜海富,赵刚,等.玻璃化法保存异体肌腱移植的实验研究[J].安徽医科大学学报,2008,43(1):20-23.
[22]孙燕琨,张友乐,李祥,等.异体肌腱移植术后粘连原因分析[J].中国修复重建外科杂志,2008,22(3):346-348.
[23]李秀芬,王洪东,李立.肌腱的生物学特性及缺损后修复材料的性能评价[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(3): 525-528.
[24]潘乐,李世光,左健.同种异体肌腱移植修复运动损伤:免疫排斥反应及降低免疫排斥反应的方法[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(53):10043-10046.
[25]陈瑞光,王文,叶伟雄.关节镜下同种异体肌腱移植修复膝交叉韧带早期排斥反应的观察[J].器官移植,2011,2(4):213-216.
[26]邓启烈.运动性肌腱损伤同种异体移植和外科修复的生物力学特征[J].中国组织工程研究,2012,16(18):3403-3406.
[27]唐恒涛,王闯建,严旭,等.同种异体肌腱移植修复跟腱断裂[J].中国组织工程研究,2013, 17(31):5626-5632.
[28]胡成栋,张伯勋,刘曦,等.玻璃化法保存同种异体肌腱移植材料的可行性[J].中国组织工程与临床康复,2011,15(12):2175-2178.
[29]解强,李方祥,周敬滨,等.带线锚钉辅助下同种异体肌腱重建运动员肩喙锁韧带12例报道[J].中国骨与关节损伤杂志, 2013, 28(11): 1072-1073.
[30]陈晓敏,白洁,颜国华,等.羟基磷灰石/柞蚕丝素(HA/TSF)骨仿生纳米纤维的生物学性能研究[J].现代生物医学进展, 2013, 13(33): 6466-6470.

引言

材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：于2013年10至12月在西安交通大学附属红会医院手外二科完成。

材料：

实验动物及分组：从河北医大动物实验中心购买6月龄健康雄性白色来亨鸡48只，体质量2.0-2.2 kg，平均(2.10±0.05) kg，许可证号：SCXK-(军)2007-004。这些鸡同批孵出，同条件饲养，编号及标记处理后依据随机数字表法将这些鸡均分为玻璃化组、化学萃取组、空白对照组，饲养环境与条件相同。

实验试剂、仪器及设备：Mouse Anti-Chicken CD4/8α-R-PE(160A Oxmoor Blvd. Birmingham, AL 35209.USA)；二甲基亚砜(天津市大茂化学仪器供应站)；乙二胺四乙酸二钠(天津永达化学试剂有限公司)；1，2-丙二醇、乙酰胺、磷酸三丁酯(天津博迪化工股份有限公司)；淋巴细胞分离液(天津市浩洋生物制品科技有限责任公司)；氯胺酮、安定(河北医科大学第三医院药房)；COULTER、EPICS XL流氏细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；METTLER TOLEDO AX 205分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团)；解剖显微镜、光学显微镜AX80(日本Olympus公司)；数码照相机COOLPIX S9100(日本Nikon公司)；UNIVERSA 300手术显微镜(德国目乐麦迪塞姆有限公司)；超薄切片机(德国LEICA公司)；CSS-44020生物力学试验机(长春试验机研究所)。

实验方法：

肌腱获取：术前12 h禁止动物饮食和饮水，给予这些动物注射15 mg/kg 1%的氯胺酮联合1 mg/kg的安定麻醉。实验前将麻药注射在这些动物大腿肌肉中上部进行麻醉，术中依据麻醉深浅情况对麻药进行随时的追加^[1]。完成麻醉后让动物去后伸俯卧位，固定住其双足，然后将无菌小创打开，驱血后将止血带捆在大腿中部，以达到有效止血目的，取左足掌侧Bruner切口，在肌腱连接处对两腱进行横断分离，同时将第三趾屈趾浅深肌腱离断5 cm左右，用生理盐水冲洗离体肌腱后将肌腱外膜去除，在D-Hank’s液中放置，然后将其冷藏在4 ℃温度的冰箱中备用。运用玻璃化法和化学萃取法将肌腱制备出来后将其分为两份，分别进行力学测试和向同种异体动物体中移植^[2]。

肌腱处理： ①玻璃化法。首先将玻璃化溶液配备出来，基础液为二甲基亚砜和丙二醇，然后将同种异体肌腱取出来，在此过程中严格无菌操作，之后在4 ℃的温度下进行平衡处理，处理的3个浓度梯度分别为1/8、1/4、1/2的玻璃化液浓度，时间为0.5 h，最后以较快速度在深低温冷冻保存液的冷冻管中放置肌腱，向-196 ℃的液氮罐中直接投入至少进行2周的保存；二甲基亚砜、1，2-丙二醇等共同构成玻璃化液；玻璃化法也叫做无冰晶技术，实质为细胞内外同时玻璃化，即在深低温冷冻的过程中，无完形的玻璃体在液体连续不断的固化过程中形成，达到高度黏稠状态，没有结晶或只有少量结晶形成在其内部^[3]。②化学萃取。化学萃取液与磷酸三丁酯的体积比为100 mL∶2 mL，化学萃取液∶乙二胺四乙酸二钠为100 mL∶5 mmol/L，然后运用Tris缓冲液将其pH值调到8.0，封口后在室温下进行保存备用。在装有足量上述化学萃取液的瓶中放置剥取的肌腱，在振荡器上进行2 d的持续晃动，室温下的换液频率为每天1次。运用去离子水反复冲洗干净肌腱后，在盛有去离子水的玻璃瓶中分别装入，再进行1 d的持续振荡，室温下换液频率为每8 h 1次，将残留的去细胞液洗净。在体积分数70%乙醇中放置肌腱，进行1 d的持续振荡后测试。磷酸三丁酯属于一种阴性离子表面活性剂，能够化学萃取同种异体肌腱，使肌腱组织中的腱细胞部分向有机相中进入，而肌腱组织中仍然保留着另一种极为致密的纤维结缔组织，从而进行有机分离，脱细胞处理肌腱组织^[4]。③空白对照组肌腱不进行任何处理，完成测试的时间≤2 h^[5]。

主要观察指标：

生物力学检测：肌腱拉伸断裂强度检测过程中，用4层纱布包裹肌腱两端各1 cm处，然后在实验机两端自制模具上将其固定，实验时运用生理盐水喷湿测试肌腱，有效防止风干结果造成不良影响，对其进行拉伸直至完全断裂，拉伸速度为20 mm/min，将计算机连接到测试机上，然后运用计算机将拉力-位移曲线绘制出来；在肌腱拉伸断裂功耗检测过程中，运用计算机测定并将结果详细记录下来；在对肌腱拉伸断裂延伸率进行检测过程中，计算方法为拉伸断裂长度和初始长度之差与初始长度的百分比^[6]。

进行完生物力学检测后，光镜下将3组约1 cm的腱组织分别切取出来，运用体积分数10%甲醛对其进行1 d的固定，然后在传输机中放置，运用体积分数75%乙醇对其脱水，运用二甲苯对其进行透明处理，浸蜡包埋切片等后，分别进行Masson染色和苏木精-伊红染色^[7]。对组织中肌腱细胞(红色)和胶原纤维(蓝绿色)、肌腱结构进行认真细致的观察。

免疫原性检测：将3组制备的肌腱进行同种异体移植，交叉回植到3组动物中，术后1，2，3，6周末分别将3组动物的2 mL外周血抽取出来，然后在EDTA-K2抗凝管中放置混匀，在4 ℃的温度下冷藏保存备用，检测时间控制在2 h内。添加并混合8 μL的抗体CD4(CT-4)FITC和8 μL的抗体CD8-α(CT-8)FITC。标记，将5 μL的鸡血加入其中，在 37 ℃的孵育箱中进行1 h的避光孵育。对红细胞进行裂解。上机对CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数进行检测^[8]。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，组间比较用方差检验，两两比较用LSD-t 检验。运用统计学软件SPSS 21.0对上述数据进行统计学处理，检验水准α=0.05。

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讨论

3.1 组织形态学间的比较 在本实验中肌腱在经过长期的溶液浸泡、振荡降温、复温等过程后，对肌腱自身有一定程度的损伤，但外在影响不明显，实验结果表明两种不同方法制备的肌腱和空白对照组肌腱基本保持一致，其长度和横截面积变化不大，均保存了肌腱的完整性。在光镜下观察可见玻璃化组肌腱和空白对照组肌腱的显微结构保持基本一致，而化学萃取组肌腱排列较空白对照组肌腱稍欠规整，胶原纤维之间间隙稍宽，未见残留腱细胞迹象。出现这种结构之间差别的原因有可能在于玻璃化法制备肌腱时细胞内外同时玻璃化，形成的玻璃态状固体分子间关系没有显著变化。经化学萃取制备的肌腱未见细胞残留迹象，几乎完全去除了肌腱细胞，可能是因为磷酸三丁酯是一种阴性离子表面活性剂，可对同种异体肌腱进行化学萃取，使其肌腱组织中腱细胞部分进入有机相，而另一种极其致密的纤维结缔组织仍保留在肌腱组织中，进而达到有机分离的目的，对肌腱组织进行了脱细胞处理，但可能经过长期的浸泡和振荡导致肌腱较玻璃化组肌腱稍欠规整、纤维间隙稍宽。肌腱基质主要包含胶原纤维和少许的弹性纤维成分，胶原分子纵横交错编织成胶原纤维结构，可以使其组织承受在降温与复温过程中所产生的机械应力。光镜下观察玻璃化法较化学萃取制备的肌腱完整地保留了原有的肌腱细胞，两种方法均保留了肌腱原有的组织形态。总之，玻璃化法较化学萃取法制备的肌腱对肌腱细胞损伤较轻，能够相对较完整地保留组织原有的肌腱细胞，但其相关生物活性还有待于进一步的实验证实。

3.2 移植修复材料制备方法发展及其与异体肌腱生物学性能的关系 组织工程化肌腱由于具有相对复杂而繁琐的操作、较差的生物相容性、极为不稳定的种子细胞等，因此迄今为止仍然无法成为一种完善的制备方法，仍然无法将用来修复肌腱缺损的诸多难题较好地解决掉，因此仍然无法在临床得到有效的应用^[9-15]。近年来，在同种异体肌腱制备研究中，一个热点话题就是同种异体肌腱的应用，同种异体肌腱的来源极为广泛，不会对患者造成新的创伤，能够使手术时间相对缩短等。玻璃化技术能够对细胞内外冰晶的形成进行预防，所采用的试剂为高浓度冷冻保护剂，技术为单步快速降温技术，其本质是细胞内外在同一时间实现玻璃化。化学萃取是指阴离子表面活性剂磷酸三丁酯脱细胞处理肌腱组织^[16-20]。

3.3 玻璃化法和化学萃取法制备方法对异体肌腱生物学性能的影响 本实验结果充分说明了在肌腱制备中，玻璃化法组、化学萃取组、空白对照组肌腱的形态、弹性及韧性等均相似^[21-29]。有研究认为，玻璃化法对细胞具有较轻的损伤，能够将细胞活性较好地保留下来^[30]。镜下观察玻璃化法会损伤肌腱，但却能够良好保存玻璃化肌腱原有腱细胞，在一定程度上减轻损伤细胞外基质及胶原纤维结构的力度，为临床移植同种异体肌腱提供良好的前提条件，但关于其在细胞活性及移植后粘连问题方面目前临床还没有统一的说法，需要各相关医学学者进行更进一步的深入研究；而化学萃取法则会在一定程度上减轻损伤肌腱的力度，特别是能够将肌腱的原有细胞有效保留下来，类似于空白对照组肌腱纤维结构。

研究结果表明，3组肌腱生物力学测试结果之间的差异均不显著(P > 0.05)，充分说明了在肌腱制备中，玻璃化法和化学萃取法均能够将肌腱的生物力学性能有效保留下来。肌腱锻炼延伸率又叫极限延伸率，本实验结果也说明玻璃化法和化学萃取法并不会直接而深刻地影响到肌腱胶原纤维内在结构。在纵向拉伸断裂实验中，各组各阶段具有大致相同的肌腱形态变化，拉伸断裂强度和拉伸断裂功耗结果也表明，玻璃化法和化学萃取法并不会直接而深刻地影响胶原纤维生物力学性能。此外，测试方法、条件及环境等也可能直接导致本实验结果没有显著改变。

随着临床相关医学学者不断深入地研究低温保护剂，玻璃化冷冻保存中组织冷冻保存已逐步取代了最原始的细胞、胚胎冷冻保存，近年来，工程化组织冷冻保存也在实验室得到了有效研究。胡成栋等^[28]研究表明，玻璃化法保存的同种异体肌腱具有较好的生物活性和较低的免疫原性，作为肌腱移植材料具有令人满意的效果。玻璃化法将卵母细胞等成功保存了下来，已在临床得到了极为广泛的应用，同时临床相关医学学者也在不断探索逐步完善肾脏、角膜等组织的玻璃化保存。本实验结果表明，术后1，2周末3组的CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺之间差异显著(P < 0.05)；术后3，6周末玻璃化法组、化学萃取组的CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺均明显比空白对照组少(P < 0.05)，但玻璃化法组和化学萃取组CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺之间的差异不显著(P > 0.05)，充分说明了在肌腱制备中，玻璃化法和化学萃取法均能够显著降低肌腱的免疫原性。

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