LMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的LIM矿化蛋白表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：体外实验提示LMP-1基因可提高骨质疏松性骨髓间充质干细胞LMP-1蛋白的表达。

目的：用含有LIM矿化蛋白1基因的反转录病毒载体(RV-LMP-1-GFP)转染骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞，检测其对骨质疏松性骨髓间充质干细胞LIM矿化蛋白表达的影响。

方法：随机取雌性SD大鼠12只，采用双侧卵巢切除法建立骨质疏松性大鼠模型，另取6只大鼠仅切除卵巢周围等量脂肪组织，保留卵巢为假手术组。喂养2个月后取双侧股骨、胫骨、肱骨分离培养其骨髓间充质干细胞。均取3代培养细胞随机分为去势组、LMP-1转染组(转染LMP-1基因)和假手术组。分别行RT-PCR及Western-Blot检测各组细胞LIM矿化蛋白1 mRNA和蛋白的表达。

结果与结论：培养出骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞，转染后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光表达；3组细胞均可在基因及蛋白水平表达LIM矿化蛋白1。与假手术组及去势组比较，LMP-1基因转染组的LIM-1mRNA和蛋白的表达均升高显著(P < 0.05)，假手术组与去势组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。成功实现重组RV-LMP-1-GFP基因在骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞中mRNA和蛋白水平的表达，且LMP-1的表达水平显著提高。结果表明重组LMP-1基因成功导入骨质疏松性大鼠骨髓间充质干细胞基因组中，并使得LMP-1 mRNA和蛋白的表达明显提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 去势大鼠, LIM矿化蛋白1基因, 反转录病毒, 转染, 骨质疏松

Abstract:

BACKGROUND: In vitro experiments suggest that LIM mineralization protein-1 (LMP-1) gene can increase the expression of LMP-1 protein in osteoporotic bone marrow mesenchymal stem cells.

OBJECTIVE: To investigate the LMP-1 expression in osteoporotic bone marrow mesenchymal stem cells transfected with RV-LMP-1-GFP in vitro.

METHODS: Twelve SD female rats were selected and subjected to bilateral ovariectomy for establishment of osteoporosis models. After 2 months of feeding, bilateral femurs, tibiae, and humeri of rats were taken to isolate and culture bone marrow mesenchymal stem cells. Passage 3 cells were taken and randomly divided into ovariectomized group and LMP-1 transfection group. Another six rats only underwent removal of the same amount of fat tissue around the ovary, and passage 3 cells which were harvested as those in the former two groups served as sham group. RT-PCR and western blot assay were performed to determine the expression of LMP-1 protein and mRNA.

RESULTS AND CONCLUSION: Under an inverted fluorescence microscope, transfected bone marrow mesenchymal stem cells from osteoporotic rats showed green fluorescent expression. The three groups all could express LMP-1 at the protein and mRNA levels. The expression levels of LMP-1 protein and mRNA in the LMP-1 transfection group were significantly higher than those in the ovariectomized group and sham group (P < 0.05), but there was no statistical difference between the latter two groups (P > 0.05). The successful expression of the RV-LMP-1-GFP gene in osteoporotic SD rat bone marrow mesenchymal stem cells was realized at the protein and mRNA levels; moreover, the expression of LMP-1 was increased dramatically. These findings indicate that LMP-1 gene is successfully transferred into osteoporotic SD rat bone marrow mesenchymal stem cells, and significantly elevates the expression of LMP-1 mRNA and protein.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, retroviridae, osteoporosis

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

骨质疏松是骨量和骨质量的下降，从而导致骨微结构的破坏和材料特性的削弱，引起了骨脆性和骨折风险的增加，其原因是破骨细胞活性的增加和成骨细胞功能的不足。骨质疏松性骨折主要包括椎体、股骨近端、肱骨近端的骨折。股骨近端骨折的人数预计到了2030年将增加4倍，说明骨质疏松对患者的健康和生活质量的威胁。

矿化LMP-1基因在1998年被成功测序和克隆，LMP-1基因的转染可诱发相关骨形成相关基因的表达，如骨形态发生蛋白，可促进体外骨小梁及体内异位骨的形成。

LMP矿化蛋白1不仅影响骨基质的矿化，而且还是胚胎骨的发育和成骨细胞分化过程中重要的正调节因子。将转染含LMP-1质粒的骨髓细胞种植到失活的骨基质上置入无胸腺大鼠体内4周后，结果显示，植入体周围均有广泛的新骨形成，而对照组没有形成任何新骨。将裸鼠脊柱融合模型转染LMP-lcDNA骨髓细胞的脱矿骨基质4周后，结果显示，转染部位脊柱均发生融合，而转染无活性反义LMP-1eDNA的部位未见脊柱融合^[1]。

研究表明LIM矿化蛋白1作为成骨信号途径的上游信号分子级联放大下游成骨信号，增加成骨细胞对骨形态发生蛋白的敏感性，招募众多的成骨因子共同参与成骨，最终促进细胞成骨分化和诱导骨形成^[2]。

骨髓间充质干细胞取材方便，具有多向分化潜能^[3-5]，无致癌性，成为非常重要的组织工程载体细胞来源之一^[6-8]，其独特的优势受到了更多研究者的关注。体内实验提示骨髓间充质干细胞所处的微环境对其分化的方向有着重要的影响^[9-11]。

蒲超等^[12]2011年应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体，并感染犬骨髓间充质干细胞，检测其体外表达及诱导成骨作用。行RT-PCR及 Western Blot检测显示，感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1。实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1，并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达。

赵忠海等^[13]2010年观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果及对其分化的影响。结果显示，绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右。提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞分化。

临床骨质疏松症多为老年患者，其自身骨髓间充质干细胞多为骨质疏松性的，因此，转染骨质疏松性骨髓间充质干细胞的临床意义更大，应用前景更广阔。实验通过LMP-1基因体外转染骨质疏松性骨髓间充质干细胞，观察LMP-1基因对骨质疏松性大鼠骨髓间充质干细胞的影响，为今后体内基因转染提供理论参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年10月在山西医科大学第二医院山西省“骨与软组织损伤修复”重点实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级4月龄雌性SD大鼠18只，体质量200-250 g，由山西医科大学实验动物中心提供。

实验方法：

骨质疏松型大鼠模型的建立：随机取4月龄SD大鼠12只，体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，下腹部备皮，无菌条件下以背部两侧及肋弓下1.5 cm纵向切开皮肤、皮下组织、肌层，进入腹腔，找出位于肾脏两侧外下方呈粉红色的卵巢和紧密相连的输卵管，分别在输卵管上结扎后将卵巢摘除建立骨质疏松型大鼠模型，逐层缝合后用碘伏进行常规消毒。另取6只为假手术组，只切除卵巢周围等量脂肪组织，保留卵巢。建模后连续3 d肌注青霉素、伤口涂抹红霉素软膏，以预防伤口感染，均给予普通饲料，自由饮水。

SD大鼠骨髓间充质干细胞的原代获取及传代培养：造模后饲养2个月，此时大鼠月龄为6个月。取清洁级6月龄SD大鼠麻醉后颈椎脱臼处死，体积分数75%乙醇浸泡10 min，无菌条件下取股骨、胫骨，浸泡在PBS中。生物洁净工作台中(体积分数75%乙醇消毒，紫外线照射40 min)，手术刀刮除骨表面附着软组织，组织剪剪除骺端，显露髓腔。 5 mL注射器吸取完全培养液(青、链霉素各100 mg/L，体积分数10%胎牛血清、低糖DMEM)冲洗髓腔20-30次。弃上层(脂肪层)，取沉淀细胞加适量完全培养液接种于培养瓶。置于37 ℃、体积分数5%CO₂空气孵箱中培养。第4天时倒置显微镜观察细胞贴壁状态。当细胞增殖至80%时传代，传代方法：倒去培养液，用PBS冲洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化10 s，倒置显微镜观察细胞离壁后，立即加入完全培养液，分装入2个细胞培养瓶，即为1代细胞，准备第3代细胞待用。

大鼠骨髓间充质干细胞鉴定：大鼠骨髓间充质干细胞表型鉴定参考文献[14-15]的方法进行。Polisetti等^[15]研究证实应用简单的黏附方法，可建立一种有效地高纯度的骨髓间充质干细胞，其表型特征及多分化潜能具有干细胞的特征。

反转录病毒转染各组大鼠骨髓间充质干细胞：①实验分组：假手术组；未转染骨质疏松细胞组(去势组)；重组基因转染骨质疏松细胞组(LMP-1转染组)。②反转录病毒的转染：待3组细胞第3代长满后，取滴度为2.00× 10⁸TU/mL的重组基因，以MOI值为100转染LMP-1转染组细胞，12 h后换液，48 h后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光。

RT-PCR检测LMP-1 mRNA的表达：收集细胞，加入Trizol试剂，提取总RNA，以18S为内参照，按说明书建立20 μL反应体系进行反转录，然后进行荧光定量PCR扩增，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，共进行40个循环。扩增结束后，以目的基因LMP-1表达的相对定量值进行统计学分析。用Primer premir5.0软件设计引物，序列如下：LMP-1-Forward primer：5-CAG CCG GTT CAG AGC AAA C-3；Reverse primer：5-GCC AGT CCT CTG TGT TCT CC-3。片段长度为214 bp。

Western-Blot检测LMP-1蛋白的表达：分别收集各组细胞，裂解液提取各组蛋白，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转染至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗(sc9996)4 ℃孵育过夜，封闭液清洗加入二抗(sc2005)孵育，化学发光法进行显色，以GAPDH作为内参照，以LMP-1蛋白表达的相对量进行统计学比较。

主要观察指标：①大鼠骨质疏松性骨髓间充质干细胞形态。②转染骨质疏松性骨髓间充质干细胞倒置荧光显微镜观察。③RT-PCR检测3组LMP-1基因mRNA的表达。④Western-Blot检测各组细胞LMP-1蛋白表达。

统计学分析：计量数据以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计软件分析，采用ANOVA分析和组间LSD-t 检验。

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讨论

实验所采用的骨髓间充质干细胞提取法是1976年Friedenstein^[16]发现并使用的，并证实骨髓间充质干细胞是多能干细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等。20世纪90年代利用骨髓梯度离心以及细胞的贴壁特性，建立并完善了从骨髓中分离、培养骨髓间充质干细胞的方法，使得对骨髓间充质干细胞的生物学性状及应用方面的研究得以深入^[17-18]。实验分别提取骨质疏松性大鼠和正常SD大鼠的骨髓间充质干细胞进行比较研究。

经由特定载体将目的基因导入至特定的靶细胞中的基因疗法，是通过目的基因的转录表达达到所需治疗目的^[19]。基因转染目前大多采用病毒为载体，病毒进化中的感染性和寄生性可被充分利用，其中RV是在骨质疏松症的基因治疗中应用最多的病毒载体之一。研究表明，以RV为载体携带LMP-1基因重组后治疗大鼠的骨折，实验组比对照组骨量提高达63%^[20]。因此，本实验选用RV作为载体行LMP-1基因转染。

LIM矿化蛋白1为Boden等^[21]于1998年第1次发现，并经过证实与成骨细胞分化相关的LIM结构域蛋白^[22]。有研究表明LMP-1在体内和体外都能够促进骨形成^[23]，在诱导成骨的信号通路上可能处于骨形态发生蛋白的上游，LMP-1的基因疗法或许是一个潜在的比骨形态发生蛋白更简单、更能有效促进骨折愈合的新选择。已证实，LMP-1是成骨细胞分化的正性调节因子^[24]，主要在骨骼中表达，促进成骨细胞分泌骨钙素及形成骨结节，在骨钙化阶段起重要作用^[25-33]。有研究表明，LMP-1是一种细胞内分泌蛋白^[34]，外源性的重组LMP-1蛋白在体内无成骨活性，可通过基因转染途径进入宿主细胞才能合成有活性的LMP-1。以上实验表明LMP-1可促进成骨，可能会率先启动众多成骨因子的成骨级联效应。

刘素彩等^[35]证明，长期摄入高浓度地塞米松会抑制LMP-1 mRNA表达，继而抑制成骨细胞的分化，最终导致骨质疏松症的发生，提示地塞米松诱发的骨质疏松症与LMP-1 mRNA表达下降有非常密切的关系。有证据发现，LMP-1 mRNA被阻断后，成骨细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素分泌均明显降低^[36]，Ⅰ型胶原表达显著下调，骨基质矿化水平降低，说明抑制LMP-1的活性可使成骨细胞分化水平明显降低。因此LMP-1基因在骨质疏松症治疗中的作用尤为突出，也是本实验选用该基因作为重组基因的重要原因。

双侧卵巢切除术后的雌性大鼠是一种模仿女性绝经后骨质疏松的经典模型，已被世界卫生组织推荐广泛用于骨质疏松症的研究^[37]。测定和监测血清碱性磷酸酶的变化可反映骨型的变化情况，可作为初步判断和检测成骨细胞活性、骨质疏松模型建立成功与否的一个相对简易的指标。临床上，血清骨型碱性磷酸酶活性的定量测定被用来监测骨形成率的变化^[38-41]。

采用大鼠双侧卵巢切除术后，体内雌激素水平下降明显，导致破骨细胞功能及活性增强，骨转换率骤然增加，骨量及骨质量迅速减少。双侧卵巢切除术骨质诱导的骨质疏松动物模型主要发生在松质骨，因其转化率相对较高，例如椎骨和长骨的干骺端。

美国FDA评价新药的药效学的标准之一是用骨组织形态计量学的方法观察药物对去势大鼠骨形态计量学的变化。很多学者指出骨质疏松时骨结构的改变与骨量的减少均可直接或间接影响和改变骨的生物力学性能^[42]，即明显降低骨的力学强度。骨折合并骨质疏松症的患者是因为其骨的力学强度降所引起的。因此评价骨质疏松的一个重要指标之一是测定骨生物力学性能的变化^[43]。骨组织形态计量学是早期发现的重要指标是骨病理生理改变。骨生物力学是检测骨折量化指标等功能改变的重要指标。全面反映骨生理、病理与功能变化的是骨生物力学与骨组织形态学的结合，进而对骨量及骨质量做出科学的有价值的判断，能够为合理全面评价骨质疏松或药物的药效指标提供新的理论依据。

研究表明，构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因^[44-45]。

RV-LMP-1-GFP转染骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞，采用RT-PCR和Western Blot方法分别验证各组LMP-1基因mRNA及LMP-1蛋白的表达的不同，为 LMP-1基因的研究提供实验参考，并为其在组织工程的应用打下基础。

有文献报道，用慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞时，当MOI超过100时，感染率虽略有增加，但有些细胞出现中毒样改变，细胞增殖相对减慢，可见部分细胞胞体皱缩粗糙，有颗粒样物质沉积，MOI低于100时，24，48 h后分别观察其绿色荧光均较弱，感染率低于60%^[46]。采用MOI为100转染骨髓间充质干细胞，转染后1周内绿色荧光强度高，1周后减少，24 h后观察，感染率大于80%，细胞增殖相对较慢，48 h后观察，感染率大于90%，荧光强度最高，细胞增殖状态良好，72 h以后观察到的感染率和荧光强度均依次轻度减弱，1周后明显减弱。这也是本实验采用MOI为100转染骨质疏松性骨髓间充质干细胞，48 h后观察其荧光强度的重要原因。

重组RV-LMP-1-GFP基因采用上述方法可成功导入骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞中，并用RT-PCR和Western-Blot检测该基因在骨质疏松性大鼠所提取的骨质疏松性骨髓间充质干细胞中能成功表达，且LMP-1的mRNA和蛋白的表达比去势组和假手术组的明显提高。重组LMP-1基因在骨质疏松骨髓间充质干细胞中表达相应蛋白的明显增高，对LMP-1基因治疗骨质疏松性大鼠的体内实验打下基础并提供一定的参考价值，对今后进一步开展骨质疏松症患者基因治疗的临床实验及评估提供新的理论依据，其未来的应用前景值得期待。