新型自组装水凝胶NBD/RADA16可促进前成骨细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.21.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：RADA16是较成熟的自组装纳米短肽材料，在亲水面往复形成互补离子键，可组装为纳米纤维，并且能够促MC3T3 E1细胞的黏附、伸展和增殖。
目的：观察新型自组装多肽水凝胶NBD/RADA16对小鼠前成骨细胞MC3T3 E1成骨分化能力的影响。
方法：将MC3T3 E1细胞分别接种于自组装多肽水凝胶NBD/RADA16与RADA16水凝胶中，进行成骨诱导培养，以单纯成骨诱导培养的细胞为对照。诱导培养1，3，6 d检测细胞碱性磷酸酶活性；诱导培养7 d后，Western Blot检测细胞骨形态发生蛋白2的表达；诱导培养21 d后，茜素红染色观察细胞钙化结节。
结果与结论：MC3T3 E1细胞在NBD/RADA16多肽水凝胶上生长状态良好，优于在RADA16上生长的细胞。自组装多肽水凝胶NBD/RADA16上MC3T3 E1细胞的碱性磷酸酶活性高于RADA16水凝胶上及单纯成骨诱导培养的细胞(P < 0.01)。自组装多肽水凝胶NBD/RADA16上MC3T3 E1细胞的矿化基质沉积、骨形态发生蛋白2表达高于RADA16水凝胶上的细胞(P < 0.01)。结果提示NBD/RADA16自组装多肽水凝胶较RADA16水凝胶更能促进MC3T3 E1细胞的成骨分化。

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关键词: 生物材料, 纳米材料, NBD/RADA16, 多肽水凝胶, 三维培养, 成骨细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: RADA16 is a mature amphiphilic self-assembling peptide, which can be assembled into nanofibers, and promote MC3T3 E1 cell attachment, spreading and proliferation.
OBJECTIVE: To observe the effects of the new-type self-assembling peptide hydrogel NBD/RADA16 on osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts MC3T3 E1.
METHODS: The MC3T3 E1 cells were inoculated in NBD/RADA16 self-assembling peptide hydrogel and RADA16 hydrogel for osteogenic induction. Cells undergoing simple osteogenic induction served as controls. After culture for 1, 3, 6 days, the activity of alkaline phosphatase was detected. After 7 days, western blot assay was used to determine the expression of bone morphogenetic protein-2. After 21 days, alizarin red staining was used to observe calcified nodules.
RESULTS AND CONCLUSION: MC3T3 E1 cells grew well on the NBD/RADA16 peptide hydrogel, which were superior to those on the RADA16 hydrogel. The activity of alkaline phoshpatase was higher in the NBD/RADA16 group than the RADA16 and control groups (P < 0.01). Compared with the RADA16 hydrogel, mineralized matrix deposition and expression of bone morphogenetic protein-2 were higher on the NBD/RADA16 peptide hydrogel (P < 0.01). These findings indicate that the NBD/RADA16 peptide hydrogel is superior to the RADA16 hydrogel for promoting the osteogenic differentiation of MC3T3 E1 cells.

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Key words: hydrogel, peptides, osteoblasts

中图分类号:

R318

赵刚，李京玲，王丹，于静，赵艳宇，满大鹏. 新型自组装水凝胶NBD/RADA16可促进前成骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(21): 3329-3333.

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图/表（结果） 3

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引言

在临床中骨移植是一种用于修复骨损伤和骨缺损的技术。骨移植的黄金标准是自体移植，但通常情况下供体非常有限，所以需要找寻其他替代材料。国内外很多引导骨再生的生物材料都存在固有的风险和缺点，例如供者疾病传播至受者或免疫反应；合成的骨替代材料如磷酸钙陶瓷已被应用，但这种陶瓷材料通常并不能形成骨^[1] 。研究发现，三维环境中恰当的空间界面构建对于细胞铺展具有重要作用：通过调控凝胶的降解特性，细胞铺展功能可以得到显著促进^[2-4] 。成骨细胞对骨组织中的骨代谢平衡、生长发育、损伤修复、骨的数量维持起最关键性作用^[5] 。牙槽骨吸收是牙周炎的一个重要病理性变化，由于牙槽骨的吸收，牙齿骨支持组织减少、丧失，牙齿逐渐松动，最终脱落或被迫拔除。外伤引起的牙槽骨大面积缺损更是临床难题。引导牙槽骨再生的生物材料国内外出现很多，如大量促成骨细胞生长因子骨形态发生蛋白等被应用于牙槽骨缺损^[6] ，也有一些新型的三维支架被应用于骨缺损^[7] ，但都有在体内伸展不够、生物相容性不佳等局限性，没能得到令人满意的临床效果。
多肽水凝胶被誉为体外细胞培养的最佳环境，其结构上为一种似天然细胞外基质的仿生材料，不仅能用于各种细胞的三维培养，而且能够促进局部血管的生成^[8] 。RADA16是较成熟的自组装纳米短肽材料^[9] ，单元序列([COCH3]-RADARADARADARADA-[CONH2])，分子水平组装成β折叠结构，在亲水面往复形成互补离子键，组装为纳米纤维^[10] 。MC3T3 E1细胞能够在RADA16水凝胶材料表面黏附、伸展和增殖^[11] 。
新型功能性水凝胶NBD/RADA16，本质上为氨基酸构成的多肽生物支架，即将多肽短链NBD结合于单纯多肽RADA16，用细胞培养基α-MEM触发可自组装形成利于细胞体外生长的水凝胶三维环境。功能性水凝胶NBD/RADA16不仅克服了其他生物材料延展性差、材料与细胞界面相容性差的问题，而且在生物活性、细胞黏附性、降解性和免疫反应等方面均优于其他材料，因而具有广阔的发展空间。与现有的支架材料相比，分子自组装多肽水凝胶支架材料具有明显的优势：多肽水凝胶材料具有纳米三维结构，与天然细胞外基质类似，能为细胞生长提供真正的三维环境^[12] ；水凝胶材料能在体内被相关酶降解为天然氨基酸，为人体重吸收利用；能够人工合成，制备简单，易于大量获取，并且可在氨基酸水平改性，从而得到更有活性的材料，没有免疫原性，避免了排斥反应。实验将小鼠前成骨细胞和活性纳米多肽纤维材料联合培养，观察纳米多肽水凝胶NBD/RADA16对小鼠前成骨细胞增殖、碱性磷酸酶、钙沉积及骨形态发生蛋白2的影响，为该纳米多肽纤维材料的临床应用提供实验依据。

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材料方法

设计：体外细胞观察性实验。

时间及地点：于2013年3月至2014年1月在佳木斯大学基础实验室完成。

材料：小鼠前成骨细胞株 MC3T3 E1来源于上海中科院细胞库。

实验方法：

MC3T3 E1细胞的传代培养及三维培养：将MC3T3 E1细胞置于α-MEM培养液中，在37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度的培养箱中常规培养，每二三天换液1次。待细胞融合至70%-80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，10%蔗糖洗涤2次去除残余的盐离子，1 000 r/min离心5 min，弃上清，轻滴加新鲜培养基制成浓度为1×10⁹ L^-¹的细胞悬液。将细胞悬液与10 g/L的RADA16储液、NBD/RADA16分别等体积混合，为了形成包裹有MC3T3 E1细胞的水凝胶，快速在混合液周围轻柔加入成骨细胞定向培养液(含有2 nmol/L 磷酸甘油钠、50 mg/L维生素C及10 nmol/L地塞米松)，在随后的60 min内，更换培养液3次以平衡生长环境至生理 pH值，时间间隔分别为15，25，35 min，每次更换75%左右体积的培养液，以免破坏水凝胶，置于37 ℃细胞培养箱中孵育，次日换液，此后每隔2 d换液1次。将MC3T3 E1细胞与水凝胶支架复合培养21 d。

碱性磷酸酶活性检测：取96孔板，细胞接种方法同上，细胞密度为5×10³/孔，将200 μL细胞悬液分别与NBD/RADA16，RADA16肽储液以1∶1的比例混合，并加入成骨诱导培养液，以单纯成骨培养基培养的细胞为对照组，每组各5孔，定向培养1，3，6 d，严格按照说明书定量进行对比实验。以酶联免疫检测仪在450 nm处测定吸光度A值，即代表细胞碱性磷酸酶活性。为排除增殖率不同对碱性磷酸酶活性的影响，进行如下修正：成骨细胞平均碱性磷酸酶活性=测得吸光度A值/同期成骨细胞增殖率。

茜素红染色检测钙化结节：MC3T3 E1细胞分别在NBD/RADA16多肽水凝胶支架材料和RADA16表面诱导培养3周后，先吸走全部培养基，接着用PBS冲洗2次，然后用体积分数95%乙醇溶液固定10 min，用去离子水漂洗2次，接着用茜素红溶液，在室温下染色10 min，在倒置相差显微镜下观察和摄片。

Western Blot印迹：MC3T3 E1细胞分别在NBD/RADA16多肽水凝胶支架材料和RADA16多肽水凝胶表面诱导培养1周后，收集细胞，加入150 µL细胞裂解液[含20 mmol/L Tris(pH 7.5)、4 mmol/L EDTA及2%SDS] 裂解细胞，超声破碎后4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，以50 µg蛋白上样，行稳流(40 mA)12% SDS-PAGE电泳，稳压 (100 V)冰浴电转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用TBST洗膜，加入鼠抗HIF-1α单抗(工作浓度为1∶1 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜后再加HRP标记的兔抗鼠二抗(工作浓度为1∶10 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL化学发光法显色、曝光、显影、定影、水洗。胶片采用薄层扫描仪扫描，Alphazmager 2200软件测定印迹区带的吸光度值。以β-actin为内参照，统计数据以供分析。

主要观察指标：诱导培养前后，MC3T3 E1细胞的增殖、碱性磷酸酶、钙沉积及骨形态发生蛋白2水平。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件包进行t 检验，检测数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

水凝胶内为交织成网状的纳米纤维，纤维直径10-20 nm，纤维之间有一定空隙，可容纳细胞和水分子，在结构上是一种类似于天然细胞外基质的材料^[13] 。RADA16是短肽水凝胶的代表，通过自组装形成纳米纤维，进一步形成支架水凝胶，含水量可超过99.5%，该短肽被广泛应用在细胞培养、组织修复等领域。王佰川博士将RADA16与RLN结合制作功能性自组装多肽纳米纤维凝胶支架^[14] ，联合兔骨髓间充质干细胞治疗兔椎间盘退行性变的实验为本次实验提供了基础。
纳米高科技的产生和发展为细胞体外培养带来了新的希望。纳米技术是指在纳米尺度的空间(1-100 nm)对原子和分子进行加工而制造出具有特殊性质的纳米颗粒^[15] 。纳米多肽具有稳定性好、可重复合成等优点。目前越来越多的纳米多肽材料被应用于细胞培养研究中并取得了令人鼓舞的成就。现有的支架材料包括纳米无机材料、有机高分子材料及各种表面改性的材料。然而，他们的硬度较大、生物相容性差、细胞降解性差等缺点限制了这些材料的应用。与普通的羟基磷灰石等材料相比，生物多肽RADA16具有更佳的理化性质和生物学性能^[16] ，同时，添加NBD后能够更好地保护细胞DNA，减少与血浆蛋白的相互作用，在体内可以有效逃避巨噬细胞的吞噬，延长其体内循环时间并能通过细胞膜实现表达，具备了作为细胞培养载体的重要条件。
NBD为由亮氨酸(Leu)-天冬氨酸(Asp)-色氨酸(Trp)-丝氨酸(Ser)-色氨酸(Trp)-亮氨酸(Leu)组成的寡肽^[17]，在细胞培养过程中通过阻断细胞壁上的肿瘤坏死因子信号通路影响细胞并促进其分化^[18] 。NBD可以特异性地抑制核因子κB激活通路中NEMO与IKK的结合，阻止破骨前体细胞转化成功能性破骨细胞，从而抑制炎症性骨吸收^[19] 。李文峰等^[20]的研究表明NBD多肽对成骨细胞的增殖分化有促进作用。
NBD/RADA16作为功能性自组装水凝胶在细胞培养过程中，不但维持了单纯RADA16多肽水凝胶原本具有的“立体稳定”效果，又提高了体外培养中细胞的增殖分化能力。NBD/RADA16含水量约90.0%，可让氧气和营养物质运输至其内的种植细胞；表面积大，有助于活性分子等向材料深部分布弥散，改善细胞的代谢能力。
MC3T3 E1作为骨祖细胞，是从新生小鼠颅骨中分离得到的，具有在体外分化为成骨细胞及形成矿化的潜力，常被用做成骨细胞分化研究的模型细胞^[1，21-22] 。实验选择成骨细胞作为种子细胞的原因：①体外扩增速度快，一般消化传代后15 h就可贴壁。②诱导分化相对简单，具有相当的分化潜力。③成骨细胞培养技术趋于成熟，体外操作简便。因此本实验采用小鼠前成骨细胞作为靶细胞，全程在无菌条件下将冻存的MC3T3 E1细胞进行复苏、培养，保证细胞贴壁生长，选择生长状态良好的第3代细胞，用于NBD/RADA16自组装水凝胶三维培养实验。
随着组织工程研究的发展，骨形成过程中生长因子的作用日益引起人们的关注。生长因子是存在于体内的生物活性因子，在细胞间传递信息并对细胞的生长具有调节功能。在颌及其周围组织中含有多种不同的生长因子，如骨形态发生蛋白蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子、Nel-lake 1型分子等，它们以自分泌或旁分泌形式调节细胞的增殖、分化，在骨生成中起重要作用。骨形态发生蛋白是一种酸性糖蛋白，常存在于骨基质中，属于转化生长因子β超家族成员，家族有40余种，在骨缺损修复中参与骨的再生与改建，对于骨形成是一重要的驱动因素。体外实验表明骨形态发生蛋白在牵张成骨过程中发挥着重要作用，对于骨形成速度和程度而言是一种必不可少的生理学基础。在骨折愈合过程中骨形态发生蛋白起了至关重要的作用^[23-37] 。其中骨形态发生蛋白2具有良好的异位诱导成骨作用，在体外对骨髓基质细胞有强烈的成骨转化作用^[23-24] 。提高自身成骨细胞释放生长因子或利用缓释系统承载生长因子，既能保护生长因子的生物学活性，又可以使生长因子大量持续性释放，更好地促进新生骨形成。因此在实验中提高骨形态发生蛋白2等细胞因子是组织工程骨达到优良效果的关键所在。
实验充分证明自组型水凝胶NBD/RADA16促进成骨细胞增殖和分化效果优于单纯的自组型水凝胶RADA16^[37] 。作者认为自组型水凝胶NBD/RADA16材料将会在牙科领域得到广泛应用，特别是牙周疾病引起的骨质缺损修复治疗。

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