人脂肪干细胞促进小鼠随意型皮瓣血管的新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离提取的一种具有多向分化潜能的干细胞，对缺血性疾病的治疗有积极作用。
目的：观察局部移植人来源脂肪干细胞对小鼠随意型皮瓣成活能力及血管新生效应的影响。
方法：体外经分离、培养及传代健康成人脂肪干细胞。于SPF小鼠背部设计蒂在头侧的随意型皮瓣设为实验组，随后于皮瓣蒂部、中部、远端分3次注射脂肪干细胞悬液、并设置以同法注射等量PBS的小鼠作对照组。移植后7 d，计算各组皮瓣成活率。移植后14 d，取皮瓣组织，随机作冰冻切片CD31免疫荧光染色，荧光显微镜下观察皮瓣组织微血管分布情况，并对CM-Dil标记的脂肪干细胞示踪；ELISA法检测皮瓣组织中血管内皮生长因子水平；Western blot法检测皮瓣组织中基质细胞衍生因子1蛋白的表达。
结果与结论：与对照组相比，实验组小鼠背部随意皮瓣成活率明显提高，皮瓣组织中微血管数目明显增多，血管内皮生长因子分泌水平明显升高，基质细胞衍生因子1蛋白表达明显增多(P < 0.05)。结果证实，人脂肪干细胞局部移植到随意型皮瓣后，可上调血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1的表达，促进皮瓣的血管新生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 外科皮瓣, 细胞移植, 血管新生, 细胞因子, 细胞培养

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a population of multilineage cells isolated from adipose tissue, which may have a positive effect on the treatment of ischemic diseases.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic and angiogenic effects of adipose-derived stem cells via local transplantation on random pattern skin flaps in mice.
METHODS: Human adipose-derived stem cells were isolated, cultured and passaged in vitro. On the back of the SPF mice, random pattern skin flaps were performed. After the operation, the adipose-derived stem cells were injected into the pedicle, central, and distal end of the flaps in the experimental group, while only PBS was injected into the control flaps. Seven days later, the survival rate of flaps was evaluated. Immunofluorescence assay was preformed to observe the distribution of microvessels in the flaps and trace the CM-Dil labeled adipose-derived stem cells, while the level of vascular endothelial growth factor was tested by ELISA and the protein expression of stromal cell-derived factor 1 tested by western blot at day 14 after adipose-derived stem cells transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, there was a significant increase in the flap survival rate in the experimental group, and along with the sharply increased number of microvessels, the secretions of vascular endothelial growth factor and stromal cell-derived factor 1 were also obviously raised in the experimental group (P < 0.05). After local transplantation of adipose-derived stem cells into random skin flaps, it could intervene the secretion of vascular endothelial growth factor and stromal cell-derived factor 1 and promote angiogenesis of the skin flap.

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Key words: stem cells, surgical flaps, vascular endothelial growth factors, cell transplantation

中图分类号:

R394.2

曹菁，姜南，徐扬阳，朱梦琳，杨柳. 人脂肪干细胞促进小鼠随意型皮瓣血管的新生[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 2993-2998.

Cao Jing, Jiang Nan, Xu Yang-yang, Zhu Meng-lin, Yang Liu. Human adipose-derived stem cells promote angiogenic capability of random pattern flaps in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 2993-2998.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 小鼠30只均进入结果分析，无脱落。

2.2 体外脂肪干细胞分离、培养、鉴定和标记结果：提取的脂肪干细胞培养至48 h绝大部分细胞贴壁生长，呈梭形成纤维细胞样，单层分布，均匀有序，见图1A。

流式细胞学检查显示，第3代脂肪干细胞表面抗原表达比例分别为CD105(93.30±1.24)%，CD90(97.25±2.33)%，CD31(0.20±0.04)%，CD34(3.82±0.86)%，CD45(3.12± 0.53)%，HLA-DR(0.81±0.09)%，同型对照均为阴性，说明本实验分离、培养所得到的细胞阳性表达多向分化潜能干细胞的标记CD105、CD90、不表达造血系统及内皮系统抗原标记CD31，CD34，CD45，不表达成纤维细胞抗原标记CD45、HLA-DR，与以往研究结果基本吻合^[18]。

成脂诱导21 d后的脂肪干细胞经油红O染色，细胞内可见成片分布的亮红色圆泡，提示胞浆内有脂滴形成，见图1B。

成骨诱导21 d后的脂肪干细胞经茜素红染色，可见岛状分布的橙红色颗粒，提示有沉积的钙结节，见图1C。

CM-DiI标记后即刻观察，在荧光显微镜下见标记后的脂肪干细胞均显红色荧光，经消化、重悬后细胞呈球形，胞浆丰富，活性良好，CM-Dil标记阳性率大于90%，见图1D。

2.3 皮瓣成活率比较情况 建模后7 d，成活皮瓣与坏死皮瓣间分界清晰，易被双盲观察者区别。实验组皮瓣成活面积为(3.78±0.16) cm²，成活率为(84.0±3.6)%；对照组皮瓣成活面积为(2.27±0.16) cm²，成活率为(72.2±3.4)%；两组皮瓣成活率比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 皮瓣组织中微血管密度的检测和CM-Dil荧光示踪 术后14 d，和对照组相比，实验组成活皮瓣内微血管的密度有明显的增加，对照组为每200倍镜下视野内(12.8±3.11)个，实验组为每200倍镜下视野内(32.2±2.59)个，两组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。实验组镜下可见少量红色荧光细胞分布于皮肤组织和皮下组织深层内，但未观察到典型的红色荧光与绿色荧光重叠现象，见图2，3。
2.5 皮瓣组织中细胞因子的表达 ELISA检测显示，实验组和对照组的皮瓣组织中均含有血管内皮生长因子，实验组血管内皮生长因子水平为(687.01±19.15) μg/L，对照组血管内皮生长因子水平为(453.60±26.37) μg/L，与对照组相比，实验组血管内皮生长因子分泌量显著增多(P < 0.05)。Western blot结果显示，实验组和对照组基质细胞衍生因子1表达均呈阳性，见图2。Image J软件对条带吸光度值的分析表明，实验组基质细胞衍生因子1蛋白与β-actin吸光度值的比值为0.78±0.04，对照组基质细胞衍生因子1蛋白与β-actin的比值为0.30±0.04，实验组基质细胞衍生因子1蛋白表达水平明显高于对照组(P < 0.05)。

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引言

皮瓣移植是修复组织缺损、重建功能的重要手段之一。促进移植皮瓣的再血管化，提高移植皮瓣的成活率及成活质量是目前临床工作需要解决的关键问题。以往学者们进行了大量研究，试图了解血管化的过程和影响因素，期望通过控制这些因素加速移植组织的再血管化进程，提高移植组织的再生修复能力。随意型皮瓣内无知名血管通过，其远端易发生缺血，造成皮瓣坏死，因而使得随意型皮瓣成为研究皮瓣成活能力的常用模型。

近年来研究发现，间充质干细胞可以明显促进伤缺血组织的再血管化。最早，间充质干细胞在骨髓中被发现^[1]，随后的研究显示体内多种组织中可能含有间充质干细胞，如肌肉、脐血、肾脏、脂肪等^[2-4]，人们将脂肪来源的间充质干细胞命名为脂肪干细胞。脂肪干细胞具有含量多、取材时风险低、患者承受痛苦小、易于患者接受、体外扩增容易、免疫原性低、能够避免伦理学问题等优点，逐渐成为众多专家学者研究的重点^[5-6]。有资料显示，脂肪干细胞移植可以促进血管新生、提高移植组织成活率。Traktuev等^[7]将脂肪干细胞悬液和内皮细胞混合物经皮下注射于小鼠皮肤缺损处，发现皮肤损伤局部血运显著增加。Nakagami等^[8]将小鼠来源脂肪干细胞与人主动脉内皮细胞进行共培养，发现脂肪干细胞可以分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝细胞生长因子等成分，进而增强人主动脉内皮细胞的活性、迁移能力和形成管状结构的能力。Bao等^[9]将脂肪干细胞注射至急性心肌梗死模型小鼠的心肌内，2周后观察到梗死区周围聚集大量脂肪干细胞，梗死区毛细血管密度增加，心功能得到改善，心室重塑加强，部分标记后的脂肪干细胞阳性表达血管内皮细胞标记，证明移植的脂肪干细胞参与了毛细血管的新生。杨波等^[10]将脂肪干细胞和游离脂肪组织混合移植，发现6个月后实验组移植脂肪湿质量与存活率高于对照组，且实验组部分脂肪干细胞转化为血管内皮细胞，说明在体内脂肪干细胞移植可以促进游离脂肪组织的再血管化。然而干细胞移植治疗缺血性疾病的内在机制尚不明确。目前，关于脂肪干细胞能否在缺血组织中直接分化为血管内皮细胞进而参与组织的再血管化尚存争议，脂肪干细胞促进缺血组织的血管新生是否与脂肪干细胞的旁分泌作用有关，还缺乏相应的实验数据支持。

实验以小鼠为研究对象，利用健康成年女性腹部脂肪抽吸所获得的脂肪组织提取脂肪干细胞，通过流式细胞术和成脂、成骨诱导分化培养对提取到的细胞进行鉴定，采用CM-Dil对细胞进行标记后，经皮下注射移植入小鼠随意型皮瓣周围。随后对随意型皮瓣区进行形态学观察、皮瓣成活率计算、微血管新生数量计数、细胞因子水平检测，观察脂肪干细胞移植对小鼠随意型皮瓣血管新生的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年9月在郑州大学第五附属医院中心实验室完成。

材料：

脂肪组织：实验所用脂肪组织来自郑州大学第五附属医院整形外科腹部脂肪抽吸治疗的女性患者，共10例，年龄18-36岁，术前体质量指数23.0-24.9 kg/m²，无传染病及内分泌疾病。根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[11]，在术前将实验方案告知对方，并签署知情同意书。

实验动物：4周龄雌性SPF小鼠30只，体质量25-30 g，由郑州大学实验动物中心提供，实验期间于郑州大学第五附属医院中心实验室按标准饲料喂养。实验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[12]。

实验方法：

人脂肪干细胞的分离培养及传代：无菌条件下将脂肪抽吸术中吸出的脂质部分约15 mL以PBS冲洗3遍，用眼科镊剔除可见的血管组织和纤维结缔组织，拣选出脂肪颗粒，眼科剪充分剪碎，1 000 r/min离心5 min(离心半径13 cm)，用移液枪吸除上层油脂，倒出中层脂肪组织备用，弃去下层冲洗液，加入等体积分数0.1%的Ⅰ型胶原酶，置于37 ℃恒温摇床震荡消化45 min，用等体积的完全培养基(DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清+体积分数1%青链霉素)终止消化，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液，室温下孵育10 min，再次离心、弃上清，以完全培养基重悬，200目筛网过滤后，镜下计数，以8×10³/cm²细胞浓度接种入无菌培养瓶^[13-14]。置于37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度的培养箱中常规孵育，3 d后首次换液，弃去上层培养基及悬浮细胞，之后每隔3 d换液1次，待细胞培养达到80%左右融合时，用体积分数0.25%胰蛋白酶(含体积分数0.02%EDTA)将贴壁细胞消化、离心、重悬后按1∶2的比例进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞生长及形态特征。

人脂肪干细胞的鉴定及标记：第3代人脂肪干细胞浓度达80%融合时进行鉴定及标记。

检测细胞表面抗原：制作单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10^{9^-¹，于各上样管内加入200 μL细胞悬液并分别加入带有荧光标记的鼠抗人CD31，CD34，CD45，CD105，CD90，HLA-DR单克隆抗体(Santa Cruz)各20 μL，同型对照加入荧光标记的非特异IgG。37 ℃避光孵育20 min，PBS洗3遍，送流式细胞仪检测。} L

成脂和成骨分化诱导：将细胞按照3.1×10³/cm²细胞浓度接种入6孔板，常规孵育24 h后，换为成脂分化诱导培养基或成骨分化诱导培养基继续培养，21 d后，固定细胞并分别用油红O或茜素红对诱导的细胞进行染色，倒置相差显微镜下观察诱导结果^[15-16]。

CM-Dil荧光标记脂肪干细胞：按终浓度2 mg/L在培养瓶内加入CM-Dil，37 ℃避光孵育5 min，转入4 ℃避光孵育15 min，弃去染液，用PBS洗3遍，常规消化、离心、去上清，加入PBS重悬，4 ℃避光备用。取20 μL细胞悬液涂片，迅速移至荧光显微镜下观察细胞显色情况^[17]。

小鼠背部随意型皮瓣模型的建立及人脂肪干细胞移植：①分组：实验小鼠30只按照随机数字表法分为实验组和对照组，每组15只。②建模：建模前3 d，用脱毛膏(硫化钠、无磷洗衣粉、马铃薯粉混合制成，质量比3∶1∶1)将小鼠背部毛脱净，清水冲洗。建模前12 h，实验小鼠禁饮食。腹腔内注射体积分数10%水合氯醛3.5 mL/kg进行麻醉，麻醉成功后俯卧位固定，于小鼠背部沿身体长轴方向设计蒂在颅侧的随意型皮瓣3.0 cm×1.5 cm。将激光多普勒血流仪单纤探头垂直固定于预先设计的皮瓣区域的中远1/3交界处中点，术区常规消毒铺巾，切开皮肤全层至肌筋膜上方，小心分离，使皮瓣内无轴性血管穿过。术中检测随意型皮瓣的相对血流值，当监测值降至术前相对血流值的(60±3)%时，停止分离。最后原位缝合皮瓣。③脂肪干细胞活性检测：取30 μL备用细胞悬液加入体积分数2%锥虫蓝溶液混匀(体积比1∶1)，对细胞计数4次，取平均值，活性细胞浓度≥95%时进行移植。调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，置冰上备用。④脂肪干细胞移植：造模成功后将500 μL细胞悬液分3次注射于实验组皮瓣的蒂部、中部、远端；对照组同法注射等量PBS。

皮瓣成活面积测量与成活率计算：建模后7 d，对皮瓣进行观察，以皮瓣颜色变黑、质地变硬、弹性差、组织回缩慢、切割组织不出血为标准，判断皮瓣是否成活，用透明膜覆盖，描画成活及坏死皮瓣轮廓，平铺拍照，应用Image J图像分析系统，计算出皮瓣成活表面积和皮瓣总面积。皮瓣成活率按以下公式计算：皮瓣成活率(R)=成活皮瓣表面积/皮瓣总面积×100%。

免疫荧光检测：建模后14 d，取各组小鼠(各5只)成活的新鲜皮瓣组织作快速冰冻切片，厚约12 μm，冰丙酮固定10 min，PBS轻柔漂洗3次，体积分数5%兔血清封闭1 h，孵育一抗大鼠来源单克隆抗体CD31(1∶100，Abcam)，4 ℃过夜，PBS洗3次，孵育二抗兔抗大鼠FITC (1∶100，Abcam) 2 h，漂洗、晾干、封固后荧光显微镜下观察。微血管计数按双盲法完成，对各样本随机计数5个200倍视野。

细胞因子水平的检测：①血管内皮生长因子表达水平的检测：建模后14 d，取各组小鼠(各5只)皮瓣区成活皮肤组织样本，每份样本称取约50 mg，剪碎组织，加入磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、预冷PBS，匀浆，低温离心取上清液，BCA法测定蛋白水平。用ELISA试剂盒(中衫金桥)检测样本中血管内皮生长因子水平。②基质细胞衍生因子1表达水平的检测：建模后14 d，取各组小鼠(各5只)皮瓣区成活皮肤组织样本冰浴条件下迅速剪碎，加蛋白裂解液300 μL及(PMSF匀浆，低温离心后取上清液，测量蛋白浓度。各组取30 μg蛋白样品液于点样孔中，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(10% SDS-PAGE)、电转移、丽春红预染色，体积分数5%脱脂牛奶封闭1 h，兔抗小鼠基质细胞衍生因子1多克隆抗体(1∶500，abcam，ab181018)、兔抗小鼠β-actin抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜。PBST洗涤3次，羊抗兔IgG(1∶6 000，中衫金桥)室温孵育1 h，PBST洗涤3次，滴加ECL发光液，显影，摄片。用Image J图像分析软件对印迹区进行吸光度值分析。

主要观察指标：将脂肪干细胞局部移植入小鼠背部随意型皮瓣区，移植后7 d计算实验组和对照组的皮瓣成活率，移植后14 d计算两组成活皮瓣内微血管的密度及血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1的相对表达水平。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间均数差异比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

随着研究的不断深入，人们发现血管新生的发生主要有两种机制，即血管形成和血管生成。前者主要依靠血管内成熟内皮细胞的增殖、迁移和重塑实现，微血管以出芽的方式从血管床长出，最终形成新的毛细血管丛；后者则由血管内皮祖细胞经过动员、迁移、分化和重塑来完成^[19]。研究证实外周循环血液中存在内皮祖细胞，当机体发生创伤、缺血等病理变化时，循环血液中的内皮祖细胞可以在多种细胞因子的作用下迁移并定植在损伤缺血部位，并进一步分化成成熟的血管内皮细胞，参与组织的血管新生^[20]。

有实验发现小鼠来源的脂肪干细胞移植到模型动物后不表达内皮细胞标志物；体外实验使用内皮细胞培养基EGM2不能诱导人脂肪干细胞分化为成熟内皮细胞^[21-22]。因此，目前关于脂肪干细胞是否能够通过向内皮系细胞分化从而发挥促进血管新生的作用,尚存争议。近年来，诸多研究显示脂肪干细胞具有分泌功能^[23-24]，可以分泌多种细胞因子，参与组织和器官的发育过程，起到促进血管的形成、支持造血、抗凋亡、调节免疫、加速细胞增生等作用。脂肪干细胞分泌的细胞因子中，有多种因子与创面的愈合、血管的重建密切相关，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、基质细胞衍生因子1等。有实验证实，向损伤组织注入脂肪干细胞后，脂肪干细胞并未直接参与毛细血管的构成，而是大量聚集在毛细血管周围，紧贴血管壁，促进内皮细胞组装成成熟稳定的血管，并伸出新芽与原有血管联通，使新生毛细血管连接成网络的能力显著增强^[25]。Deveza等^[26]发现，单纯应用脂肪干细胞培养过程中产生的上清液就可以发挥促进内皮细胞存活和迁移的作用。越来越多的证据表明，在脂肪干细胞移植辅助血管再生治疗的过程中其旁分泌作用可能扮演了重要角色。

血管内皮生长因子是一种与血管新生密切相关的细胞因子，可以促进内皮系细胞的存活和血管发生。有研究显示，经体外注射的血管内皮生长因子具有强大的促血管新生能力^[27]。基质细胞衍生因子1是一种小分子量的趋化因子蛋白，属于CXC趋化因子家族成员，已知的基质细胞衍生因子1受体有CXCR4和CXCR7。基质细胞衍生因子1可以提高包括脂肪干细胞、内皮祖细胞等多种干细胞的旁分泌、增殖以及迁移能力^[28-29]。有研究发现，将基质细胞衍生因子1和血管内皮生长因子注射到小鼠皮下，基质细胞衍生因子1表现出与血管内皮生长因子相当的促微血管形成的能力。此外，血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1之间还存在着相互作用，基质细胞衍生因子1能诱导内皮细胞中血管内皮生长因子的表达，而血管内皮生长因子也能诱导基质细胞衍生因子1的表达^[30]。

虽然缺血、缺氧及组织损伤等病理变化本身可以引起损伤部位血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1的表达，但这种内源性的修复作用水平较低，不能满足组织修复的需要。移植的脂肪干细胞可以上调损伤缺血组织的血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1表达水平。局部表达的血管内皮生长因子可以提供更适宜内皮系细胞存活的微环境，刺激血管原位内皮细胞增殖，捕获循环血液中的CXCR⁺干细胞。基质细胞衍生因子1同样可以募集CXCR⁺干细胞，并将募集到的细胞准确地定位在新生血管周围，这些细胞进一步分泌血管生成因子，促使血管壁内皮细胞生长，改善局部血流灌注。

由于这次实验样本数量有限，未能对移植后脂肪干细胞在体内的增殖和转归展开连续观察，不能排除这样一种可能，即脂肪干细胞分化成的内皮细胞未能长期存活，导致在实验所设定的时间点上不能观察到典型的红绿荧光重叠现象。因此不能定论移植的脂肪干细胞在体内是否能够分化成为内皮细胞。虽然实验未观察到移植的脂肪干细胞直接分化成内皮细胞的现象，但细胞移植组血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1的表达和皮瓣成活率以及微血管密度较对照组均明显升高，表明脂肪干细胞移植的确可以干预细胞因子的分泌，促进缺血皮瓣的血管新生。

总之，尽管目前的实验结果尚不能定论脂肪干细胞促进缺血皮瓣血管新生的具体机制，但大量研究提示，脂肪干细胞移植的确可以干预缺血组织细胞因子的分泌，在局部形成更适合内皮系细胞定植和生长的微环境，最终促进缺血皮瓣的血管新生。目前脂肪干细胞辅助皮瓣移植的相关技术还不成熟，关于脂肪干细胞的分离方式、移植数量、植入时间等问题还存在争议，值得继续探索，相信脂肪干细胞辅助皮瓣移植有着广阔的应用前景。